一种通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母的制作方法

本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，特别涉及一种通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母。

背景技术：

干扰素(interferon)根据蛋白质的来源、结构及其受体不同可分为i型、ii型和iii型，每种类型又包含不同的亚型。目前只有i型中的α和β干扰素以及ii型中的γ干扰素被批准应用于预防和治疗病毒感染。猪的α1干扰素编码基因(poifnα1)是1986年由法国科学家首次从猪的基因组文库中分离得到的(lefevreandbonnardiere,1986)。该基因的完整开放阅读框编码一个长为189个氨基酸的蛋白质，包含一个由23个氨基酸残基组成的信号肽序列(1-23位氨基酸)和由166个氨基酸残基(24-189位氨基酸)组成的成熟蛋白质。成熟的猪干扰素α1由166个氨基酸残基组成，其二级结构以α-螺旋为主。poifnα1含有5个半胱氨酸残基，其中cys1-cys98，cys29-cys138形成两个二硫键。

干扰素是动物机体应对病毒等病原体入侵时较快产生的一种重要细胞因子，干扰素可以通过与动物机体内细胞表面的干扰素受体结合，从而启动一系列干扰素刺激基因(interferonstimulatedgenes)的表达,从而发挥抗病毒和免疫调节作用。i型干扰素主要由白细胞、成纤维细胞和浆细胞样树突细胞分泌产生。poifnα1是由猪的白细胞产生的一种耐酸、耐热的糖蛋白，目前被认为是在猪常见的病毒性疾病治疗中最有应用前景的一种干扰素。

干扰素可以通过用有丝分裂剂刺激猪的白细胞后从培养液中进行提取，也可以通过基因工程的方法用大肠杆菌或酵母来进行生产。从白细胞分泌的干扰素进行生化提取方法产量有限、而且存在从动物细胞带入动物病毒的风险。用基因工程工程方法生产干扰素不仅经济，而且安全。用大肠杆菌生产干扰素大多在细胞内积累，其中有大量的干扰素蛋白在表达过程中会形成无活性的聚合体，这种聚合体又称为包涵体。从大肠杆菌中提取干扰素必须要先破碎大肠杆菌的细胞壁和细胞膜，对包涵体进行变性和复性才能获得有活性的干扰素。此外，大肠杆菌细胞壁中的脂多糖(又称内毒素)，对动物是一种较强的致炎和致热因子，因此在提纯过程中必须清除干净。利用毕赤酵母生产的分泌型干扰素是活性形式，而且由于毕赤酵母分泌到胞外的杂蛋白较少，纯化比较容易。毕赤酵母生产干扰素发酵周期较长，一般需要96小时以上，而且发酵液体积较大，纯化前需要进行超滤浓缩处理。中国专利授权号cn103589769b提供了一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法，通过将poifnα1和硫氧化还原蛋白(thioredoxin)融合表达的大肠杆菌工程菌，但这种干扰素是融合蛋白，比活性较低。中国专利授权号cn104561199b提供了一种应用重组毕赤酵母稳定地生产猪α干扰素的方法，但由于宿主菌为蛋白酶缺陷型的非野生型毕赤酵母，菌体的生长速度较慢，发酵周期较长。

毕赤酵母表达系统是最常用的重组蛋白质表达系统之一，已有上千种重组蛋白在毕赤酵母中成功进行了表达，并有多种蛋白实现了工业化生产。现有的表达猪α1型干扰素的毕赤酵母工程菌，是通过单拷贝表达猪α1型载体ppiczαa-poifnα1整合至x33毕赤酵母基因组醇氧化酶(aox1)位点，再通过博来霉素抗生素筛选获得的高拷贝菌株。而这种高拷贝菌株由于在开始甲醇诱导后单位时间内酵母细胞内表达重组干扰素蛋白较多，而造成部分干扰素分子不能正确折叠和分泌而在细胞内堆积，不能有效分泌到细胞外，因而使高拷贝菌株的生产性能得不到有效发挥。

可见，现有技术还有待改进和提高。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母，旨在解决现有的高拷贝菌株在诱导表达重组猪α1干扰素不能正确折叠和分泌而在细胞内堆积，不能有效分泌到细胞外，使高拷贝菌株的生产性能得不到有效发挥的技术问题。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母，所述毕赤酵母包括如seqidno.1所示dna序列的重组猪α1干扰素基因片段和如seqidno.2所示dna序列的蛋白质二硫键异构酶pdi基因片段。

所述的通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母中，所述毕赤酵母分别经过猪α1干扰素表达载体ppiczαa-pifna1和辅助分泌表达载体ppic3.5k-pdi转化。

所述的通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母中，所述转化后得到的菌株分别通过博来霉素、g418进行抗生素浓度梯度高拷贝筛选。

所述的通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母中，所述博来霉素的浓度梯度为0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.6mg/ml；所述g418的浓度梯度为0.4mg/ml、0.8mg/ml。

所述的通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母中，所述重组猪α1干扰素基因片段的插入位点为醇氧化酶基因座；所述蛋白二硫键异构酶pdi基因片段的插入位点为组氨酸合成酶基因座。

所述的通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母中，所述猪α1干扰素表达载体ppiczαa-pifna1和辅助分泌表达载体ppic3.5k-pdi转化感受态细胞为x33毕赤酵母、gs115毕赤酵母或km71毕赤酵母中的一种。

所述的通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母中，所述猪α1干扰素表达载体ppiczαa-pifna1是通过xhoi和xbai双酶切ppiczaa表达质粒，电泳并切胶回收线性化载体，用t4dna连接酶连接同样经过xhoi和xbai双酶切处理的重组猪α1干扰素基因片段，转化top10大肠杆菌感受态，提取质粒用xhoi和xbai双酶切鉴定阳性重组质粒获得的。

所述的通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母中，所述辅助分泌表达载体ppic3.5k-pdi是通过ecori和xbai双酶切ppic3.5k表达质粒，电泳并切胶回收线性化载体，用t4dna连接酶连接同样经过ecori和xbai双酶切处理的两端分别添加了ecori和noti限制性内切酶识别序列的蛋白质二硫键异构酶pdi基因片段，转化top10大肠杆菌感受态，提取质粒用ecori和xbai双酶切鉴定阳性重组质粒获得的。

所述的通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母中，所述毕赤酵母的保藏编号为gdmccno.60826。

有益效果：

本发明提供了一种通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母，通过在毕赤酵母中整合多拷贝重组猪α1干扰素基因片段和插入表达酵母蛋白质二硫键异构酶的dna片段，辅助蛋白质在酵母细胞内折叠，减少干扰素在细胞内堆积，提高猪α1干扰素分泌到细胞外的量，猪干扰素α1的表达量达到了1.43g/l,较只整合干扰素表达盒的菌株提高了40％以上，显著提高了菌体发酵生产猪α1干扰素的水平，使高拷贝菌株的生产性能得到有效发挥。

附图说明

图1为本发明提供的猪α1干扰素表达载体ppiczαa-pifna1的示意图。

图2为所述辅助分泌表达载体ppic3.5k-pdi的示意图。

图3为毕赤酵母工程菌发酵培养上清液中猪α1干扰素表达水平的电泳验证图；其中，其中，m：dnamarker；ifn1：pifna1-01；ifn2：pifna1-02；ifn3：pifna1-02。

具体实施方式

本发明提供一种通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

表达猪α1干扰素的毕赤酵母菌株komagataellaphaffiihnc-pifna，分类学名称komagataellaphaffii，现已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070,保藏日期2019年12月4日，保藏编号gdmccno.60826。

下列实施例中未注明具体条件的实验操作，均参照《dna克隆2：一种实用方法》(dnacloning2：apracticalapproach，oxforduniversitypress,1992)中所述的条件进行。

dna聚合酶、限制性内切酶、dna连接酶购自newenglandbiolabs，x33毕赤酵母及其表达载体购自invitrogen。

实施例1猪α1干扰素表达载体的构建

1.1基于毕赤酵母密码子偏好性优化猪的α1干扰素表达基因编码序列根据毕赤酵母(pichiapastoris)密码子偏好性(https://sg.idtdna.com/site/account/login？returnurl＝％2fcodonopt)设计猪α1干扰素基因序列，基因序列由江苏金斯瑞生物科技公司合成，其对应的氨基酸序列如下所示(seqidno.4)。

cdlpqthslahtralrllaqmrrispfscldhrrdfgspheafggnqvqkaqamalvhemlqqtfqlfstegsaaawnesllhqfctgldqqlrdleacvmqeaglegtplleedsilavrkyfhrltlylqeksyspcaweivraevmrsfsssrnlqdrlrkke

优化后的pifna1序列为(seqidno.1)：

aaaagagaggctgaagcttgtgacttaccacaaacccactccttggctcacactagagctttgcgtctattagctcagatgagaaggatttcaccctttagttgtctggatcataggcgtgacttcggatcaccacatgaagccttcggtggaaaccaagtacagaaggcccaagcaatggctctggtacatgagatgttgcagcaaaccttccagttattctccaccgaaggtagtgcagccgcctggaatgagtccctgcttcaccagttttgtaccggacttgaccagcaactaagagatttagaagcctgtgtaatgcaagaagccggcttggaaggtacacccttattggaggaagattcaattttagctgtgagaaaatactttcacaggttaacgctttacctacaggaaaaatcatacagtccttgtgcctgggaaatagtgcgtgcagaagtaatgcgttccttttccagttcaaggaacttgcaggacaggcttcgtaagaaagaatga

1.2猪α1干扰素表达载体ppiczαa-pifna1的构建

用xhoi和xbai双酶切ppiczaa表达质粒,琼脂糖电泳并切胶回收线性化载体，用t4dna连接酶连接同样经过xhoi和xbai双酶切处理的合成猪α1干扰素基因片段，转化top10大肠杆菌感受态。提取质粒用xhoi和xbai双酶切鉴定阳性重组质粒，获得猪a1干扰素表达载体ppiczαa-pifna1(如图1所示)。

1.3辅助分泌表达载体ppic3.5k-pdi的构建

用ecori和xbai双酶切ppic3.5k表达质粒，琼脂糖电泳并切胶回收线性化载体，用t4dna连接酶连接同样经过ecori和xbai双酶切处理的两端分别添加了ecori和noti限制性内切酶识别序列的合成毕赤酵母pdi基因，转化top10大肠杆菌感受态。提取质粒用ecori和xbai双酶切鉴定阳性重组质粒获得辅助分泌表达载体ppic3.5k-pdi(如图2所示)。

合成的毕赤酵母pdi基因序列为(seqidno.2)：

gaattcaccatgcaattcaactggaatattaaaactgtggcaagtattttgtccgctctcacactagcacaagcaagtgatcaggaggctattgctccagaggactctcatgtcgtcaaattgactgaagccacttttgagtctttcatcaccagtaatcctcacgttttggcagagttttttgccccttggtgtggtcactgtaagaagttgggccctgaacttgtttctgctgccgagatcttaaaggacaatgagcaggttaagattgctcaaattgattgtacggaggagaaggaattatgtcaaggctacgaaattaaagggtatcctactttgaaggtgttccatggtgaggttgaggtcccaagtgactatcaaggtcaaagacagagccaaagcattgtcagctatatgctaaagcagagtttaccccctgtcagtgaaatcaatgcaaccaaagatttagacgacacaatcgccgaggcaaaagagcccgtgattgtgcaagtactaccggaagatgcatccaacttggaatctaacaccacattttacggagttgccggtactctcagagagaaattcacttttgtctccactaagtctactgattatgccaaaaaatacactagcgactcgactcctgcctatttgcttgtcagacctggcgaggaacctagtgtttactctggtgaggagttagatgagactcatttggtgcactggattgatattgagtccaaacctctatttggagacattgacggatccaccttcaaatcatatgctgaagctaacatccctttagcctactatttctatgagaacgaagaacaacgtgctgctgctgccgatattattaaaccttttgctaaagagcaacgtggcaaaattaactttgttggcttagatgccgttaaattcggtaagcatgccaagaacttaaacatggatgaagagaaactccctctatttgtcattcatgatttggtgagcaacaagaagtttggagttcctcaagaccaagaattgacgaacaaagatgtgaccgagctgattgagaaattcatcgcaggagaggcagaaccaattgtgaaatcagagccaattccagaaattcaagaagagaaagtcttcaagctagtcggaaaggcccacgatgaagttgtcttcgatgaatctaaagatgttctagtcaagtactacgccccttggtgtggtcactgtaagagaatggctcctgcttatgaggaattggctactctttacgccaatgatgaggatgcctcttcaaaggttgtgattgcaaaacttgatcacactttgaacgatgtcgacaacgttgatattcaaggttatcctactttgatcctttatccagctggtgataaatccaatcctcaactgtatgatggatctcgtgacctagaatcattggctgagtttgtaaaggagagaggaacccacaaagtggatgccctagcactcagaccagtcgaggaagaaaaggaagctgaagaagaagctgaaagtgaggcagacgctcacgacgagctttaagcggccgc

毕赤酵母蛋白二硫键异构酶的氨基酸序列(seqidno.3)：

mqfnwniktvasilsaltlaqasdqeaiapedshvvklteatfesfitsnphvlaeffapwcghckklgpelvsaaeilkdneqvkiaqidcteekelcqgyeikgyptlkvfhgevevpsdyqgqrqsqsivsymlkqslppvseinatkdlddtiaeakepvivqvlpedasnlesnttfygvagtlrekftfvstkstdyakkytsdstpayllvrpgeepsvysgeeldethlvhwidieskplfgdidgstfksyaeaniplayyfyeneeqraaaadiikpfakeqrgkinfvgldavkfgkhaknlnmdeeklplfvihdlvsnkkfgvpqdqeltnkdvteliekfiageaepivksepipeiqeekvfklvgkahdevvfdeskdvlvkyyapwcghckrmapayeelatlyandedasskvviakldhtlndvdnvdiqgyptlilypagdksnpqlydgsrdleslaefvkergthkvdalalrpveeekeaeeeaeseadahdel

实施例2分泌表达猪α1干扰素的毕赤酵母工程菌的构建

用sali限制性内切酶单酶切ppiczaa-pifna1表达载体，切胶回收线性化表达载体，用1.6kv的电压电转化至x33毕赤酵母感受态细胞或其他毕赤酵母如gs115、km71等菌株中，菌液涂布于ypg平板(含0.4mg/ml博来霉素)，30℃培养2-3天，直至长出单菌落。挑取单菌落，复制到含0.8mg/ml博来霉素的ypg琼脂平板上，30℃培养2-3天；待菌落长出，在深孔培养板中培养并用1.5％的甲醇诱导表达72小时，取20μl发酵液上清进行sds电泳并染色，观察干扰素表达条带。同上将在含0.8mg/ml博来霉素的ypg平板上长出的菌落，复制到含1.2mg/ml博来霉素的ypg平板，待长出菌落，同上培养诱导表达，比较与0.8mg/ml博来霉素筛选出菌株的干扰素表达条带的量。同上将含1.2mg/ml博来霉素的ypg平板上长出的菌落，复制到含1.6mg/ml博来霉素的ypg平板上，待长出菌落，进行培养诱导。并与前述梯度筛选出的菌株，干扰素的表达量用电泳方法进行比较。该轮筛选出的菌株命名为pifna1-01(如图3所示)。

用博来霉素筛选出的工程菌pifna1-01作为基础菌株，制备感受态。

用sali限制性内切酶单酶切ppic3.5k-pdi辅助分泌表达载体，用1.6kv的电压电转至x33毕赤酵母感受态细胞或其他毕赤酵母如gs115、km71等，菌液涂布于ypg平板(含0.4mg/mlg418)，30℃培养2-3天，直至长出单菌落。将菌落复制到含0.8mg/mlg418的ypg平板上，30℃培养2-3天，直至长出单菌落。接种深孔板培养24h并用1.5％甲醇浓度诱导表达72h。取20μl发酵上清液，进行sds-page染色并与pifna1-01诱导表达产生的干扰素产量进行比较，筛选出表达量最高的菌株命名为pifna1-02(如图3所示)。

实施例3重组猪α1干扰素的诱导表达

挑取实施例2中制备的表达猪α1干扰素的毕赤酵母菌株pifna1-02，接种于25mlbmgy培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备一级种子液。取20ml一级种子液接种于200mlbmgy培养基中制备二级种子液，30℃，220rpm培养24小时。二级种子液全部接种于5l发酵罐(2lbsm培养基)，控制温度30℃±0.5℃，溶氧20％±5％，ph＝5.0±0.5。基础甘油耗尽后，流加10％甘油，甘油耗尽后直至溶氧上升至100％，饥饿半小时，流加甲醇诱导菌丝霉素表达，共诱导72小时，离心(6000×g，5min)取发酵上清液进行检测。

实施例4重组猪α1干扰素蛋白浓度的检测和蛋白电泳

bca法测定上清液总蛋白浓度，结果显示，pifna1-01和pifna1-02菌株诱导72小时发酵上清液的总蛋白浓度分别为：1.0g/l、1.4g/l。

sds-page蛋白电泳分析发酵上清液干扰素含量，蛋白电泳结果如图所示，在15-20kd之间有目标大小的蛋白条带，蛋白条带的分子量大小与猪a1干扰素理论分子量16kd相近。通过软件分析，干扰素素蛋白含量85％以上。基础菌株和辅助分泌的菌株干扰素产量大致为1.02g/l，1.43g/l。

实施例5重组猪α1干扰素的质谱检测

将实施例4中蛋白电泳胶的目标条带切下,用测序级的胰蛋白酶酶解后用液质联用来进行酶解肽段的串联质谱分析，结果找到5个肽段，覆盖率占表达猪α1干扰素序列全长的95.18％。

利用液相色谱(lc)串联质谱(ms/ms)方法鉴定到的肽段如下(seqidno.5)：

kyfhrllaqmrrltlylqekispfscldhraevmrsfsssrsfsssrnlqdrrispfscldhrcdlpqthslahtryfhrltlylqekrdfgspheafggnqvqkltlylqeksyspcaweivrdleacvmqeaglegtplleedsilavraqamalvhemlqqtfqlfstegsaaawnesllhqfctgldqqlr

匹配肽段如下划线部分所示：

cdlpqthslahtralrllaqmrrispfscldhrrdfgspheafggnqvqkaqamalvhemlqqtfqlfstegsaaawnesllhqfctgldqqlrdleacvmqeaglegtplleedsilavrkyfhrltlylqeksyspcaweivraevmrsfsssrnlqdrlrkke(覆盖率95.18％)

实施例6pifna1-02菌株稳定性评价

通过连续传代培养评价菌株稳定性。

挑取实施例2中所制备的表达干扰素的毕赤酵母细胞pifna1-02菌落接种于3mlbmgy培养基中，30℃，220rpm培养24小时制备种子液。取0.5ml种子液接种于25mlbmgy培养基中，30℃，220rpm培养24小时。菌液转移到50ml离心管中，离心(6000×g，5min)弃上清，用25ml甲醇浓度为1％的bmmy培养基重悬菌体，菌液转移到250ml三角瓶中，30℃，220rpm培养72小时，每24小时添加甲醇至1％浓度。离心(6000×g，5min)取发酵上清液进行干扰素蛋白质电泳检测。

挑取筛选菌株，连续传代培养10代，检测发酵上清液干扰素蛋白浓度，结果显示每一代菌株的摇瓶发酵上清液的干扰素蛋白浓度为1.3-1.5g/l，说明菌株稳定性良好。

综上所述，本发明通过在醇氧化酶(aox1)基因座整合了多拷贝猪α1型干扰素表达载体的x33野生型毕赤酵母基因组中的组氨酸合成酶(his4)基因座插入外源性蛋白二硫键异构酶(pdi)基因，并利用梯度g418筛选增加pdi拷贝数，最终获得的毕赤酵母工程菌，猪干扰素α1的表达量较只整合干扰素表达盒的菌株提高了40％以上，显著提高了菌体发酵生产干扰素α1的水平。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110>广东海纳川生物科技股份有限公司

<120>一种通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母

<160>5

<170>patentinversion3.3

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<211>519

<212>dna

<213>重组猪α1干扰素基因序列

<400>1

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<212>dna

<213>蛋白质二硫键异构酶pdi基因序列

<400>2

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aagctagtcggaaaggcccacgatgaagttgtcttcgatgaatctaaagatgttctagtc1200

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<213>蛋白质二硫键异构酶pdi氨基酸序列

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<213>猪α1干扰素氨基酸序列

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195