本发明属于生物工程技术领域，提供了一株高产纳豆激酶的菌株及利用该菌株制备纳豆激酶产品的方法。
背景技术：
血栓性疾病是一般由血液中的血小板、纤维蛋白、白细胞等物质粘联而形成的血栓，随着血栓的不断增大，造成了血管阻塞甚至封闭，使机体的一些器官因缺血而引发功能性障碍的各种疾病。血栓性疾病的致残和致死的概率都较高，是一种严重危害人类健康和生命的疾病。据报道，中国血栓性疾病的患者已经达到1000万以上，并且每年新增的患者大约有150～200万人，每年都有超过300万人进行血栓治疗。伴随着老龄化社会的到来，估计患病人数会有进一步的增加，所以血栓性疾病已经是对我们健康威胁的主要疾病之一。
纳豆激酶(nattokinase，nk)是由纳豆枯草芽胞杆菌(bacillussubtilisnatto)产生的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶，易溶于水，固态呈淡黄色或白色，无二硫键，一般为单链多肽结构。纳豆激酶的脱氧核糖核酸序列由275个氨基酸残基构成，相对分子质量一般为28000u。该酶n末端为丙氨酸，等电点为8.6±0.3。在室温下，酶活性在ph值6.0～12.0的范围内具有很强的纤维蛋白水解能力，酶反应的最适ph值一般为8，酸性和强碱性条件下会迅速失活。其酶活力不易受反复冻融影响，温度达50℃以上时酶活性会逐渐丧失，超过60℃酶迅速失活，其最适温度为45℃。
纳豆激酶具有良好的溶解血栓的功效，与传统的溶栓药物链激酶、尿激酶相比具有药理作用直接且多元化、体内半衰期长、分子量相对较小可直接通过胃肠系统被人体吸收、安全性高、价格便宜等诸多优点。kimj.y.etal.effectsofnattokinaseonbloodpressure:arandomized,controlledtrial.研究表明20～80岁高血压患者口服纳豆激酶胶囊(2000fu/天)8周后，舒张压和收缩压均较对照组(服用安慰剂)明显降低。然而目前国内的纳豆激酶产品活性普遍比较低,筛选具有高活力纳豆激酶生产能力的菌株及制备高活性的纳豆激酶活性产品,作为预防和治疗血栓性疾病具有重要意义。
技术实现要素：
本发明针对上述技术存在的不足，提供一株高产纳豆激酶的菌株及利用该菌株制备纳豆激酶产品的方法，所涉及的高产纳豆激酶的菌株，经16srdna鉴定为一株枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，菌株代码为yjy20-05，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.20017。该菌株应用于纳豆激酶液体发酵中酶活较原始菌株发酵水平提高1倍、时间缩短1倍，纳豆激酶提取纯化后,先制成微胶囊后与卵磷脂复合制备纳豆激酶片，可获得纳豆激酶含量为2000fu/片、卵磷脂含量0.3g/片的纳豆激酶片剂，既保证了纳豆激酶的活性又强化了预防和治疗血栓性疾病的功能。
本发明提供的具体技术方案是：
本发明首先提供了一株新的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，该菌株来源与市场上的原始菌株，其具体获得过程如下：
采集市售纳豆样品，从其中分离纯化单菌落，采用常规诱变方法，如uv，dms，mms，ntg等，结合artp诱变系统，反复多次诱变，经过酪素培养基初筛、琼脂糖—纤维蛋白原平板复筛，并对其生理生化特性、遗传稳定性深入研究后，最终筛选出一株发酵高产纳豆激酶、易培养且具有遗传稳定性的菌株，将其命名为yjy20-05，发明人对该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心进行了生物保藏，保藏编号为cgmccno.20017，经检测其为存活状态；该菌株的形态特征为：无荚膜，周生鞭毛，革兰氏阳性菌；该菌株在普通营养琼脂上形成表面粗糙不透明、污白色或微黄色、有褶皱的菌落。
发明人同时对菌株yjy20-05进行了16srdna测序，其序列如seqidno：1所示，该序列为菌株的16srdna的全序列。
将所测得的16srdna序列进行blast比对，比对结果显示，菌株yjy20-05的16srdna的核苷酸序列与芽孢杆菌属(bacillussp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的菌株有100％的同源性；因此鉴定其为一株枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。
获得上述菌株后，可以利用该菌株进行纳豆激酶相关产品的生产，具体步骤包括：
(1)纳豆激酶发酵液的制备：包括种子制备、液体深层发酵；
(2)纳豆激酶精品液的制备：包括纳豆激酶的纯化；
(3)纳豆激酶片剂的制备：包括纳豆激酶微胶囊干粉的制备、纳豆激酶片剂的制备。
上述的发酵液、微胶囊干粉和片剂均可以作为产品直接销售；
更进一步的，其中所述纳豆激酶发酵液的制备包括以下步骤：
1)种子制备：在无菌操作台上，将活化的试管斜面菌种用接种针刮取1环到100mllb培养基中，摇床温度33℃～37℃、转速160r/min～200r/min，振荡培养18～24h，检测od600＝0.5～0.8时停止培养，得到种子液；
2)液体深层发酵：取制备好的种子液，按照1％～5％(v/w)的接种量接种于灭菌的发酵培养基中，进行深层发酵，获得纳豆激酶发酵液；
液体深层发酵培养基组成和发酵条件如下：
液体深层发酵培养基组成，按重量百分比计为：葡萄糖0.8％～2％、木糖1％～3％、大豆蛋白胨1％～2％、硫酸铵0.3％～0.8％、氯化钙0.01％～0.03％、硫酸氢二钠0.08％～0.13％、硫酸二氢钠0.05％～0.08％、氯化亚铁0.003％～0.005％、豆油0.5％～1％，加水至1000ml，ph7.2～7.4；
液体深层发酵条件为：培养温度33℃～37℃，摇床转速160r/min～200r/min，培养时间为32～40h，检测纳豆激酶含量达到1053～1214fu/ml停止发酵，发酵纳豆激酶含量较原始菌株467～521fu/ml提高1倍、发酵时间较原始菌株72～96h缩短1倍；
上述纳豆激酶含量的检测方法为紫外分光光度法。
所述纳豆激酶精品液的制备包括以下步骤：
取纳豆激酶发酵液，4000～6000rpm离心15～25min，取上清液；选用截留分子量为100kd的滤膜，在0.05～0.20mpa，10～35℃，ph6～8条件下超滤，收集过滤液；选用截留分子量为1kd的超滤膜，在0.05～0.20mpa，10～35℃，ph6～8条件下超滤，收集1kd超滤膜截留液，即为精品纳豆激酶液，经过检测其纳豆激酶含量为2578～2961fu/ml；
所述纳豆激酶精品液的制备中，纳豆激酶发酵液离心和过100kd滤膜能除去发酵液中大部分的杂质和菌体，100kd滤膜过滤液过1kd超滤膜能除去部分小分子的呈味物质，有效去除纳豆激酶产品的刺激性气味；同时上述制备工艺条件更加简单，且大大降低了生产成本。
所述纳豆激酶片剂的制备包括以下步骤：
1)纳豆激酶微胶囊干粉的制备
纳豆激酶微胶囊的制备：室温下，取纳豆激酶精品液，按重量比为1:1加入3％明胶溶液，连续搅拌，再按纳豆激酶液重量比为1:1搅拌加入1％海藻酸钠溶液获得混悬液，然后将混悬液分散在按纳豆激酶液重量比为1:7的蒸馏水中，用10％醋酸水溶液缓慢调节ph至4.2，用冰水浴降温至5℃以下，持续搅拌，缓慢向体系中滴加纳豆激酶液按重量比为1:1的浓度0.1g/mlcacl2水溶液，再向体系中加入纳豆激酶液按重量比为300:1硅酸铝镁，即得到纳豆激酶微胶囊湿产品，湿产品压滤后减压干燥即得粉末状产品，即可获得纳豆激酶含量为26212～28943fu/g的纳豆激酶微胶囊干粉；
上述纳豆激酶微胶囊干粉的制备中cacl2起固化剂的作用，硅酸铝镁起抗粘剂的作用。
2)纳豆激酶片剂的制备：按重量份取上述制备的纳豆激酶微胶囊干粉6.91～7.63份，加入卵磷脂干粉50份，均匀混合，再加入麦芽糊精20份、预胶化淀粉11.57～17.29份、微晶纤维素5～10份、硬脂酸镁0.8份混合均匀制备纳豆激酶片剂，可获得纳豆激酶含量为2000fu、卵磷脂含量为0.3g的0.6g每片纳豆激酶片。
所述纳豆激酶片剂的制备中，纳豆激酶和卵磷脂同时服用，可达到相辅相成的作用，因为纳豆激酶在降解血栓时其代谢产物要经过肝脏代谢，从而加重了肝脏的负担，而卵磷脂能增强肝脏的排泄功能，从而保护肝脏不受损害，进而促进了微胶囊溶解血栓的作用；本发明首次将两种有效组分配合在一起使用，起到了意想不到的效果，更加有利于人民的身体健康。
利用上述高产纳豆激酶菌株制备纳豆激酶片剂具有如下优势：
(1)纳豆激酶原始菌株来源于农家自制食品中，保证了发酵产物的安全性；
(2)应用本专利筛选菌株应用于纳豆激酶液体发酵中酶活较原始菌株发酵水平提高1倍、时间缩短1倍；
(3)采用专用工艺制备获得了纳豆激酶微胶囊，有效地保护了纳豆激酶的活性；
(4)纳豆激酶片剂中复配卵磷脂，提高了人体肝脏功能，更好地预防了疾病的发生；
(5)纳豆激酶片剂中纳豆激酶含量2000fu/片、卵磷脂含量0.3g/片，每天1粒达到了治疗和预防血栓疾病的需求。
保藏信息，
保藏时间：2020年6月3日
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心
保藏编号：cgmccno.20017
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
分类命名:枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成，下述实施例中所采用的菌种均为保藏号cgmccno.20017的菌种。
实施例1
一种纳豆激酶片剂的生产方法，具体步骤包括：
(1)纳豆激酶发酵液的制备：
在无菌操作台上，将活化的试管斜面菌种用接种针刮取1环到100mllb培养基中，摇床温度33℃、转速190r/min，振荡培养24h，检测od600＝0.6时停止培养，得到种子液；取制备好的种子液，按照1％(v/w)的接种量接种于灭菌的发酵培养基(发酵培养基组成：葡萄糖1.5％、木糖3％、大豆蛋白胨1％、硫酸铵0.3％、氯化钙0.02％、硫酸氢二钠0.13％、硫酸二氢钠0.05％、氯化亚铁0.003％、豆油0.7％，ph7.4)中，摇床温度37℃、转速200r/min，振荡培养32h，检测纳豆激酶含量达到1214fu/ml停止发酵，获得纳豆激酶发酵液；
(2)纳豆激酶精品液的制备：
取纳豆激酶发酵液，4000～6000rpm离心15～25min，取上清液；选用截留分子量为100kd的滤膜，在0.05～0.20mpa，10～35℃，ph6～8条件下超滤，收集过滤液；选用截留分子量为1kd的超滤膜，在0.05～0.20mpa，10～35℃，ph6～8条件下超滤，收集10kd超滤膜截留液，即为精品纳豆激酶液，其纳豆激酶含量为2578fu/ml；
(3)纳豆激酶片剂的制备：
室温下，取纳豆激酶精品液250g，加入3％明胶溶液250g，连续搅拌，再加入1％海藻酸钠溶液250g，然后将混悬液分散在1750ml的蒸馏水中，用10％醋酸水溶液缓慢调节ph至4.2，用冰水浴降温至5℃以下，持续搅拌，用滴管向体系中缓慢滴加250g的浓度0.1g/mlcacl2水溶液，再向体系中加入0.83g硅酸铝镁，即得到纳豆激酶微胶囊湿产品，湿产品压滤后减压干燥即得纳豆激酶含量为26212fu/g的纳豆激酶微胶囊干粉；
按重量份取纳豆激酶微胶囊干粉7.63份，加入卵磷脂干粉50份，均匀混合，再加入麦芽糊精20份、预胶化淀粉11.57份、微晶纤维素10份、硬脂酸镁0.8份混合均匀制备纳豆激酶片剂，可获得纳豆激酶含量为2000fu/片、卵磷脂含量0.3g/片的纳豆激酶片(每片克重0.6g)。
实施例2
一种高纳豆激酶活性纳豆的生产方法，具体步骤包括：
(1)纳豆激酶发酵液的制备：
在无菌操作台上，将活化的试管斜面菌种用接种针刮取1环到100mllb培养基中，摇床温度37℃、转速160r/min，振荡培养20h，检测od600＝0.5时停止培养，得到种子液；取制备好的种子液，按照5％(v/w)的接种量接种于灭菌的发酵培养基(发酵培养基组成：葡萄糖2％、木糖1％、大豆蛋白胨1.3％、硫酸铵0.8％、氯化钙0.03％、硫酸氢二钠0.10％、硫酸二氢钠0.06％、氯化亚铁0.005％、豆油0.5％，ph7.3)中，摇床温度33℃、转速180r/min，振荡培养38h，检测纳豆激酶含量达到1096fu/ml停止发酵，获得纳豆激酶发酵液；
(2)纳豆激酶精品液的制备：
取纳豆激酶发酵液，4000～6000rpm离心15～25min，取上清液；选用截留分子量为100kd的滤膜，在0.05～0.20mpa，10～35℃，ph6～8条件下超滤，收集过滤液；选用截留分子量为1kd的超滤膜，在0.05～0.20mpa，10～35℃，ph6～8条件下超滤，收集10kd超滤膜截留液，即为精品纳豆激酶液，其纳豆激酶含量为2967fu/ml；
(3)纳豆激酶片剂的制备：
室温下，取纳豆激酶精品液3kg，加入3％明胶溶液3kg，连续搅拌，再加入1％海藻酸钠溶液3kg，然后将混悬液分散在21kg的蒸馏水中，用10％醋酸水溶液缓慢调节ph至4.2，用冰水浴降温至5℃以下，持续搅拌，向体系中缓慢滴加3kg的浓度0.1g/mlcacl2水溶液，再向体系中加入10g硅酸铝镁，即得到纳豆激酶微胶囊湿产品，湿产品压滤后减压干燥即得纳豆激酶含量为28943fu/g的纳豆激酶微胶囊干粉；
按重量份取纳豆激酶微胶囊干粉6.91份，加入卵磷脂干粉50份，均匀混合，再加入麦芽糊精20份、预胶化淀粉17.29份、微晶纤维素5份、硬脂酸镁0.8份混合均匀制备纳豆激酶片剂，可获得纳豆激酶含量为2000fu/片、卵磷脂含量0.3g/片的纳豆激酶片(每片克重0.6g)。
实施例3
一种高纳豆激酶活性纳豆的生产方法，具体步骤包括：
(1)纳豆激酶发酵液的制备：
在无菌操作台上，将活化的试管斜面菌种用接种针刮取1环到100mllb培养基中，摇床温度35℃、转速200r/min，振荡培养18h，检测od600＝0.8时停止培养，得到种子液；取制备好的种子液，按照2％(v/w)的接种量接种于灭菌的发酵培养基(发酵培养基组成：葡萄糖0.8％、木糖2％、大豆蛋白胨2％、硫酸铵0.4％、氯化钙0.01％、硫酸氢二钠0.08％、硫酸二氢钠0.08％、氯化亚铁0.004％、豆油1％，ph7.2)中，摇床温度36℃、转速160r/min，振荡培养40h，检测纳豆激酶含量达到1053fu/ml停止发酵，获得纳豆激酶发酵液；
(2)纳豆激酶精品液的制备：
取纳豆激酶发酵液，4000～6000rpm离心15～25min，取上清液；选用截留分子量为100kd的滤膜，在0.05～0.20mpa，10～35℃，ph6～8条件下超滤，收集过滤液；选用截留分子量为1kd的超滤膜，在0.05～0.20mpa，10～35℃，ph6～8条件下超滤，收集10kd超滤膜截留液，即为精品纳豆激酶液，其纳豆激酶含量为2621fu/ml；
(3)纳豆激酶片剂的制备：
室温下，取纳豆激酶精品液4.5kg，加入3％明胶溶液4.5kg，连续搅拌，再加入1％海藻酸钠溶液4.5kg，然后将混悬液分散在31.5kg的蒸馏水中，用10％醋酸水溶液缓慢调节ph至4.2，用冰水浴降温至5℃以下，持续搅拌，向体系中缓慢滴加4.5kg的浓度0.1g/mlcacl2水溶液，再向体系中加入15g硅酸铝镁，即得到纳豆激酶微胶囊湿产品，湿产品压滤后减压干燥即得纳豆激酶含量为28449fu/g的纳豆激酶微胶囊干粉；
取纳豆激酶微胶囊干粉7.03份，加入卵磷脂干粉50份，均匀混合，再加入麦芽糊精20份、预胶化淀粉14.17份、微晶纤维素8份、硬脂酸镁0.8份混合均匀制备纳豆激酶片剂，可获得纳豆激酶含量为2000fu/片、卵磷脂含量0.3g/片的纳豆激酶片(每片克重0.6g)。
实验例1
本发明纳豆激酶片剂对大鼠体内动脉血栓形成的影响实验
取sd大鼠70只，体重在190～210g，雌雄各半，将其随机分为5组，每组10只，雌雄各5只，分别为实验组1、2、3，对照组以及空白对照组。
实验组1、2、3分别给去离子水(10ml/kgbw)中加入实施例1、2、3的粉碎纳豆激酶片，给药剂量为167fu/kg(以纳豆激酶含量计，相当于人体每日推荐量的5倍)，灌胃；
对照组给去离子水(10ml/kgbw)中加入纳豆激酶微胶囊干粉167fu/kg(以纳豆激酶含量计，相当于人体每日推荐量的5倍)，灌胃；
空白对照组给去离子水(10ml/kgbw)，灌胃。
每天一次，连续七天，末次给药后30分钟，将大鼠用20％乌拉但麻醉，剥离大鼠颈总动脉，在远心端进行动脉插管用四道生理记录仪加测血压，在近心端用45％的三氯化铁溶液浸泡的0.5cm宽的滤纸条包裹动脉，记录从包裹到血压降为0时的时间为动脉血栓形成时间，测试结果见表1。
表1受试样品对大鼠体内动脉血栓形成时间的影响
与空白对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
由表1可知，实验组1、2、3相对空白对照组极显著延长动脉血栓形成时间，对照组相对空白对照组显著延长动脉血栓形成时间，表明纳豆激酶微胶囊干粉复配卵磷脂干粉能有效延长动脉血栓形成时间。
实验例2
本发明纳豆激酶片剂对大鼠体内静脉血栓形成的影响实验
取sd大鼠70只，体重在190～210g，雌雄各半，将其随机分为5组，每组10只，雌雄各5只，分别为实验组1、2、3，对照组以及空白对照组。
实验组1、2、3分别给去离子水(10ml/kgbw)中加入实施例1、2、3的粉碎纳豆激酶片，给药剂量为167fu/kg(以纳豆激酶含量计，相当于人体每日推荐量的5倍)，灌胃；
对照组给去离子水(10ml/kgbw)中加入纳豆激酶微胶囊干粉167fu/kg(以纳豆激酶含量计，相当于人体每日推荐量的5倍)，灌胃；
空白对照组给去离子水(10ml/kgbw)，灌胃。
每天一次，连续七天，末次给药后30分钟，将大鼠用20％乌拉但麻醉，剥离大鼠下腔总静脉，在左肾静脉下端用线结扎下腔总静脉，3h后打开下腔总静脉取出血栓称重，记录数据，测试结果见表2。
表2受试样品对大鼠体内静脉血栓形成的影响
与空白对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
由表2可知，实验组1、2、3相对空白对照组极显著降低血栓重量，对照组相对空白对照组显著降低血栓重量，表明纳豆激酶微胶囊干粉复配卵磷脂干粉能有效降低血栓重量。
比较例
以本发明获得的菌株与专利cn107841473a菌株，采用进行相同的种子培养基、种子制备方法、发酵培养基、液体深层发酵条件，每2h检测纳豆激酶含量，关于纳豆激酶生产能力对比如表3：
表3本发明获得的菌株与专利cn107841473a菌株纳豆激酶生产能力对比
通过本发明获得的菌株与专利cn107841473a菌株纳豆激酶生产能力对比可得，本发明获得的菌株在缩短发酵时间1倍的情况下，纳豆激酶生产能力提高1倍，较之现有菌株有明显进步。
序列表
<110>黄河三角洲京博化工研究院有限公司
<120>一株高产纳豆激酶的菌株及利用该菌株制备纳豆激酶产品的方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1365
<212>dna
<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)
<400>1
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