一种Cry2Ab-2杀虫基因及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种cry2ab-2杀虫基因及其应用。

背景技术：

玉米(zeamaysl.)是重要的谷类作物，玉米可作为食品，饲料和工业原料。自采用高产选育育种和杂交品种以来，玉米的产量显着增加，2014年分别达到近208和2.15亿吨。然而，随着中国人口的增长和耕地数量的稳步下降，作物的产量必须增加以满足不断增长的需求。多种因素限制了玉米的产量，其中害虫是重要的。玉米作物的主要害虫是鳞翅目昆虫，导致春玉米产量损失10％，夏玉米产量减少20％-30％，每年造成巨大的经济损失。除直接产量损失外，鳞翅目害虫对玉米的侵染可能导致产生伏马菌素，霉菌毒素，降低玉米品质，并可能对家畜造成负面影响。已经开发出多种策略来控制玉米害虫，以化学杀虫剂的应用为主要措施。然而，化学杀虫剂的应用带来了一系列问题，如空气，水和土壤污染，食物污染，抗性食草动物的重新出现，以及作物害虫天敌数量的减少。因此培育玉米抗虫新品种，减少化学杀虫剂的使用，从根本上控制虫害对作物的影响成为玉米品种培育的重要方向，目前应用最广泛的抗虫基因就是从苏云金芽孢杆菌中发现的bt蛋白。

苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis，bt)是具有昆虫病原性特征的革兰氏阳性孢子形成细菌。bt在孢子形成阶段产生杀虫蛋白作为伴孢晶体。这些晶体主要由一种或多种蛋白质(cry和cyt毒素)组成，也称为δ-内毒素。cry蛋白是来自苏云金芽孢杆菌的伴随包涵体(晶体)蛋白，其对靶生物体具有实验可验证的毒性作用或与已知的cry蛋白具有显着的序列相似性。类似地，cyt蛋白是来自苏云金芽孢杆菌的伴孢包含蛋白，其表现出溶血(cytolitic)活性或与已知的cyt蛋白具有明显的序列相似性。这些毒素对其目标昆虫具有高度特异性，对人类，脊椎动物和植物无害，并且是完全可生物降解的。因此，bt是控制农业中害虫和重要人类疾病媒介的可行替代方案。截至2018年5月，共有近90种cry2类抗虫基因被发掘鉴定出来，涵盖了从cry2aa至cry2ai共9小类，其中cry2ab蛋白占其中的绝大多数。cry2类是仅次于cry1类的杀虫晶体蛋白，对鳞翅目，直翅目等类昆虫具有较好的杀虫活性，其中cry2ab、cry2ae、cry2af蛋白仅对鳞翅目昆虫具有杀虫活性，且cry2ab对粘虫的毒力要高于cry1ab和cry1ac，因此在害虫防治方面具有较为广泛的应用前景。

目前bt蛋白改造主要的方法有结构域转换、密码子优化、dnashuffling、易错pcr等，其中易错pcr技术可以简便有效的向已知dna序列中引入突变，其体系最早由leung建立，cadwell以该体系进行易错pcr，诱变了编码四膜虫核酶的基因，明显提高了该酶的活性。shellygoomber等，通过易错pcr法体外进化芽孢杆菌脂肪酶使其在5℃时仍具有活性,增强了该酶的适冷性。了解决化学农药污染环境的问题，而提供一种cry2ab-2杀虫基因及应用。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决化学农药污染环境的问题，而提供一种cry2ab-2杀虫基因及应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种突变基因cry2ab-2，所述突变基因cry2ab-2的碱基序列如序列表seqidno.1所示。申请ncbi登陆号位为：mt273011.1。

作为本发明的进一步改进，所述基因为人工合成。

本发明进一步保护cry2ab-2蛋白，所述cry2ab-2蛋白为序列表seqidno.1所示的基因表达的蛋白。

本发明进一步保护上述cry2ab-2蛋白作为制备杀虫剂的应用。

作为本发明的进一步改进，所述虫为粘虫。

本发明进一步保护上述突变基因cry2ab-2在培育抗粘虫转基植物品种的应用。

作为本发明的进一步改进，所述植物为玉米。

本发明进一步保护上述突变基因cry2ab-2的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体、工程菌或细胞。

作为本发明的进一步改进，所述载体包括原核表达载体、克隆载体。

作为本发明的进一步改进，所述工程菌为大肠杆菌。

本发明具有如下有益效果：本发明提供了cry2ab-2杀虫基因，它是通过易错pcr法对cry2ab基因碱基序列进行随机诱变获得的，通过对诱变后的序列分析结果表明：cry2ab-2基因氨基酸序列第20位的thr转换成ala，第582位的gly转换成asp，与原始序列一致性达到97.31％，通过使用在线过敏原数据库在线分析表明，该序列与已知过敏源同源性较低不存在致敏性，通过sds-page电泳分析结果表明，在70.68kda左右出现一条明显的特异条带，说明在iptg的诱导下cry2ab-2基因得到了正确表达。用诱导表达的蛋白进行抗虫(粘虫)试验，结果表明该表达蛋白具有很强的杀虫活性，使粘虫致死率达88.98％，而且存活的害虫生长也严重受到抑制，与对照差异明显。初步证明本研究成功诱变一种改良型的cry2ab基因，该基因具有很强的杀虫活性，可以为转基因抗虫育种的培育和工程菌株的构建提供候选基因。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同mg²⁺含量电泳图；m:dl2000dnamarker；h:无菌水；1-11：反应体系中mg²⁺浓度一次为3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5mmol/l；

图2为易错pcr的电泳图；m：dl2000dnamarker；1-6：cry2ab-2的易错pcr扩增；

图3为cry2ab-2保守结构域图；

图4为重组质粒pcr验证图；m：dl2000dnamarker；1-4：重组质粒验证；

图5为cry2ab-2基因质粒双酶切鉴定图，m：dl2000dnamarker；1-2：酶切验证；

图6为pet22b-cry2ab-2蛋白的sds-page分析图，m:蛋白标准分子量；1-3:cry2ab-诱导；

图7为原核表达蛋白抗虫鉴定图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1易错pcr扩增

使用软件primer5.0设计引物

s:cgcgatgaatagtgtattgaatagcggaagaactac，

as:cgcgttaataaagtggtgaaatattagttggtac，

以含有puc57-cry2ab质粒为模板,进行易错pcr,易错pcr50μl反应体系包含ddh2o10.5μl,10*buffer5μl,mgcl23μl,dntp4μl。上下游引物各1ul,dna1μl,taq酶0.25μl。反应程序：94℃预变性3min；94℃变性40s；40℃退火40s，72℃延后延伸10min；4℃保存。不进行热启动。1％的琼脂糖凝胶电泳，纯化回收目的片段，以此片段为模板，以同样的条件进行第二轮易错pcr，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，纯化并测序。使用软件dnaman6.0对测序结果进行比对分析，根据外源蛋白质过敏性分析的国家标准,使用在线过敏原数据库(www.allergenonline.org)网站对其致敏性进行在线分析。

以不同镁离子浓度，使用低保真taqdna聚合酶，延长每个循环的时间，降低起始模板的终浓度，使用带有置换位点引物,不进行热启动等角度出发进行易错pcr扩增，经过初步的摸索，最终确定加的4μlmg²⁺(如图1)，70个循环为适合的条件，进行易错pcr可以扩增得到清晰的特异条带(如图2)。

实施例2克隆载体的构建

将经过两轮易错pcr，纯化回收的目的片段与载体pmd-18t进行16℃过夜连接。将连接产物转化到大肠杆菌e.colidh5α感受态细胞中，次日挑取单菌落过夜培养，提取质粒进行pcr验证，纯化回收pcr产物送吉林省库美生物技术有限公司测序验证。命名为cry2ab-2基因序列。

cry2ab-2基因序列和保守结构域分析及功能预测

由dna序列推导，其编码的蛋白质包含633个氨基酸,理论分子量大小为70.68kda。通过在线blast(ncbi)比较同源性显示，该基因与cry2aa最为相似。利用在线软件sopma对突变基因编码的二级蛋白结构分析显示α-helix＝32.54％，β-turn＝5.06％,randomcoil＝41.71％,ee-strand＝20.85％。在网站ncbi对该基因编码蛋白质的氨基酸序列进行cdd(convseddomaindatabase)分析显示，cry2ab-2编码蛋白的domaini范围是glu165～leu183主要参与膜的穿透和孔洞的形成，domainii对应的范围是ser343～ser354主要参与受体的结合，domainiii所对应的范围是thr567～ala585，与碳水化合物的结合有关，是δ内毒素活化区的一部分，可以产生杀虫毒素。如图3在线致敏性分析结果显示，cry2ab-2基因编码的蛋白质70个氨基酸序列与已知过敏原的序列同源性均小于35％，即cry2ab-2基因编码的蛋白不存在致敏性。

实施例3原核表达载体的构建与鉴定

提取pmd18t-cry2ab-2的质粒dna使用带有xhoi和salii酶切位点的无缝引物进行正常的pcr扩增，扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性40s；62℃退火40s，72℃延伸2min；72℃后延伸10min；35×循环。pcr后产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，纯化回收目的片段，并使用无缝连接试剂盒，将其与原核表达载体pet-22b进行连接，再转化大肠杆菌e.colidh5α感受态细胞中，次日挑取全部单菌落过夜培养，并提取其质粒dna，进行pcr和酶切验证，将初步确定为阳性的pcr产物送吉林省库美生物技术有限公司测序验证。

cry2ab-2基因原核表达载体构建

挑取全部菌落过夜培养，次日提取质粒pcr验证(如图4)，筛选出稳定的阳性克隆，对重组质粒dna进行酶切验证，得到2个条带大小分别5.5kb和1902bp(如图5)，测序分析表明序列正确，说明目的基因片段成功的连接到原核表达载体pet22b(+)中。

实施例4cry2ab-2基因在大肠杆菌中表达

提取pet22b-cry2ab-2的质粒dna，将其转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，挑取单菌落过夜培养，次日将菌液按1:100的比列接种到装有50ml的lb液体培养基中(含kan100mg/ml)，37℃摇床198rpm振荡培养3.5h,使od600达到0.6时，加入100mm的iptg的母液至其终浓度1mm,继续振荡培养3h。将三角瓶置于冰上5min，离心收集菌体(4℃、10000r/min、8min)，并用预冷的无菌水重悬菌体再次离心，重复两遍。弃上清用pbsbuffer重悬。将悬浮液用超声波破碎(1200w、6son、5soff10min)，将其离心(4℃、10000r/min、10min)收集菌体和上清液备用。进行sds-page电泳分析验证。

cry2ab-2基因在大肠杆菌中表达分析

sds-page电泳分析，结果显示(图6)，经iptg诱导后含cry2ab-2工程菌(非可溶性组分)在70.68kda左右，表达出一条明显的特异条带，与预期大小相吻合，表明cry2ab-2基因编码的杀虫蛋白在大肠杆菌bl21中得到正确的表达。

实施例5cry2ab-2蛋白杀虫活性的生物鉴定

重组菌菌体诱导表达后进行超声波破碎并回收cry2ab-2蛋白，用于以下杀虫活性的鉴定。

粘虫的杀虫活性鉴定采用人工饲料法：人工饲料的配制参照jiangsj的方法和条件。以含cry2ab-2和cry2ab载体的破碎菌液做为阳性对照，以含空载体的破碎菌液为阴性对照。

cry2ab-2蛋白杀虫活性的生物鉴定(图7)

(1)称取30g人工饲料放置于灭菌的9cm培养皿中；

(2)加入待测蛋白溶液3ml，充分搅拌，混匀后平均分装于三个9cm培养皿中；

(3)根据饲料的干湿程度超净台里放置一段时间，直到饲料表面没有明显的水滴。

(4)每皿接入30头初孵幼虫，设3个重复，共处理90头试虫(接完虫子垫上三层卫生纸盖紧培养皿，用橡皮筋扎紧，以免虫子逃逸)；

(5)将样品置于24℃光照培养箱培养，光周期为12：12，湿度70％～80％左右，每天观察饲料干湿程度，适当微调；

(6)培养7d后调查死虫和活虫数，计算死亡率。

如表1所示，在24h之内三组粘幼虫都有大量取食饲料，随着处理时间的延长，取食含目的蛋白的初孵粘虫幼虫出现萎缩现象并出现死虫，而阴性处理组正常取食。处理7d后统计粘虫的死亡率，如表1所示，取食cry2ab蛋白-与cry2ab-2蛋白的初孵粘虫死亡率为87.78％，和88.83％。

表1cry2ab蛋白对粘虫的致死率

与现有技术相比，本发明通过易错pcr法对cry2ab基因碱基序列进行随机诱变研究，通过对诱变后的序列分析结果表明：cry2ab-2基因氨基酸序列第20位的thr转换成ala，第582位的gly转换成asp，与原始序列一致性达到99.05％，通过使用在线过敏原数据库在线分析表明，该序列与已知过敏源同源性较低不存在致敏性，通过sds-page电泳分析结果表明，在70.68kda左右出现一条明显的特异条带，说明在iptg的诱导下cry2ab-2基因得到了正确表达。用诱导表达的蛋白进行抗虫(粘虫)试验，结果表明该表达蛋白具有很强的杀虫活性，使粘虫幼虫的死亡率达88.98％，而且存活的害虫生长也严重受到抑制，与对照差异明显。初步证明本研究成功诱变一种改良型的cry2ab基因，该基因具有很强的杀虫活性，可以为转基因抗虫育种的培育和工程菌株的构建提供候选基因。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>吉林农业大学

<120>一种cry2ab-2杀虫基因及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1902

<212>dna

<213>苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)

<400>1

atgaatagtgtattgaatagcggaagaactactatttgtgatgcgtataatgtagcgact60

catgatccatttagttttcaacacaaatcattagataccgtacaaaaggaatggacggag120

tggaaaaaaaataatcatagtttatacctagatcctattgttggaactgtggctagtttt180

ctgttaaagaaagtggggagtcttgttggaaaaaggatactaagtgagttacggaattta240

atatttcctagtggtagtacaaatctaatgcaagatattttaagagagacagaaaaattc300

ctgaatcaaagacttaatacagacactcttgcccgtgtaaatgcggaattgacagggctg360

caagcaaatgtagaagagtttaatcgacaagtagataattttttgaaccctaaccgaaac420

gctgttcctttatcaataacttcttcagttaatacaatgcaacaattatttctaaataga480

ttaccccagttccagatgcaaggataccaactgttattattacctttatttgcacaggcg540

gccaatttacatctttcttttattagagatgttattctaaatgcagatgaatggggaatt600

tcagcagcaacattacgtacgtatcgagattacttgaaaaattatacaagagattactct660

aactattgtataaatacgtatcaaagtgcgtttaaaggtttaaacactcgtttacacgat720

atgttagaatttagaacatatatgtttttaaatgtatttgagtatgtatctatctggtcg780

ttgtttaaatatcaaagtcttctagtatcttccggtgctaatttatatgcaagtggtagt840

ggaccacagcagacccaatcatttacttcacaagactggccatttttatattctcttttc900

caagttaattcaaattatgtgttaaatggatttagtggtgctaggctttctaataccttc960

cctaatatagttggtttacctggttctactacaactcacgcattgcttgctgcaagggtt1020

aattacagtggaggaatttcgtctggtgatataggtgcatctccgtttaatcaaaatttt1080

aattgtagcacatttctccccccattgttaacgccatttgttaggagttggctagattca1140

ggttcagatcgggagggcgttgccaccgttacaaattggcaaacaggatcctttgagaca1200

actttagggttaaggagtggtgcttttacagctcgcggtaattcaaactatttcccagat1260

tattttattcgtaatatttctggagttcctttagttgttagaaatgaagatttaagaaga1320

ccgttacactataatgaaataagaaatatagcaagtccttcaggaacacctggtggagca1380

cgagcttatatggtatctgtgtataacagaaaaaataatatccatgctgttcatgaaaat1440

ggttctatgattcatttagcgccaaatgactatacaggatttactatttcgccgatacat1500

gcaactcaagtgaataatcaaacacgaacatttatttctgaaaaatttggaaatcaaggt1560

gattctttaaggtttgaacaaaacaacacgacagctcgttatacgcttagagggaatgga1620

aatagttacaatctttatttaagagtttcttcaataggaaattccactattcgagttact1680

ataaacggtagggtatatactgctacaaatgttaatactactacaaataacgatggagtt1740

aatggtaatggagctcgtttttcagatattaatatcggtaatgtagtagcaagtagtaat1800

tctgatgtaccattagatataaatgtaacattaaactccggtactcaatttgatcttatg1860

aatattatgcttgtaccaactaatatttcaccactttattaa1902