一种可降解含能材料的菌株及其应用的制作方法

本发明涉及污染物处理领域，更特别地，涉及一种可降解含能材料的菌株及其应用，还涉及一种降解含能材料的方法。

背景技术：

含能材料是一种能量密度高、瞬间功率大的亚稳定性物质，作为武器弹药系统中关键功效组件、推进剂的燃料以及火炸药的组分，在军事、航空航天及民用领域中均得到广泛应用。传统含能材料包括三硝基甲苯(tnt)、环三亚甲基三硝胺(rdx)和环四亚甲基四硝胺(hmx)。国内外在含能材料毒性及环境危害研究方面开展了大量工作。根据美国和欧洲的生产车间工人的职业健康调查，rdx暴露可导致严重惊厥、眩晕、呕吐，甚至意识障碍，而hmx暴露对肝脏和神经系统均有影响。epa在2014年已将tnt和rdx确定为“人类可能致癌物”(c类)

cl-20(六硝基六氮杂异伍兹烷，hexanitrohexaazaisowurtzitane)是一种具有复杂笼型结构的多环硝胺类化合物，与传统含能材料tnt、rdx和hmx具有相似分子结构。自1987年合成以来，由于其优越的爆炸性能，近年来受到广泛关注。研究表明，cl-20具有1.8倍tnt当量，其密度、爆速、爆压和能量密度均高于rdx和hmx，同时还具有良好的热稳定性。由cl-20作为主要配方能显著提升弹药的比冲、燃烧速度和爆能，在火药、发射药、推进剂等领域均具有广阔的应用前景。许多欧美发达国家已将cl-20的合成和应用列入关键军事研究技术，并有望作为rdx和hmx的替代材料，因此还被誉为是“第四代”含能材料。

目前对cl-20的健康和环境影响研究报道较少，而由于其结构与tnt、rdx和hmx较为相似，推测其可能具有相近的毒性效应。我们在前期对cl-20的毒性进行了系统研究，发现其可诱发小鼠微核率升高，并可造成染色体损伤和形成非整倍体。致畸试验结果表明，cl-20对孕鼠有毒性作用。有研究者发现，与rdx、hmx、tnt等含能材料相比，cl-20对蚯蚓、土壤微生物具有更大的毒性，0.02mg/kg的cl-20就可造成土壤中蚯蚓密度大量减少。一项关于鸟类的急性经口毒性试验表明，cl-20对动物体重有影响，呈明显剂量效应关系，且对肝脏有毒性作用。由于cl-20的广泛使用和对土壤环境、水体环境及人体的明显危害性，限制着其生产和使用，因此很有必要采取一定的措施对残留于土壤及水体环境中的cl-20进行处理。

国内外在含能材料的微生物降解方面也开展了大量研究工作，其典型代表是关于tnt的微生物降解研究。随着近年来对含能材料微生物降解研究的不断发展，目前已筛选出许多能够降解tnt、rdx和/或hmx的微生物。然而，关于cl-20微生物降解的研究较少。由于cl-20结构与rdx类似，有研究者选择能够降解rdx的两株细菌rhodococcussp.dn22和rhodococcusrhodochrous11y来降解cl-20，结果发现均不能发挥降解作用。有研究发现两种白腐真菌phanerochaetechrysosporium和irpexlacteus可在需氧条件下通过胞外氧化酶的脱硝机制，如lip、mnp等分解cl-20。这些酶可非特异性降解cl-20，研究表明其对rdx、hmx等含能材料均具有一定的降解能力，且仅在周围环境中缺少碳源和氮源情况下才能发挥较高的降解能力。研究者在花园土壤中筛选出一株需氧土壤杆菌(agrobacteriumsp.strain)js71和一株厌氧假单胞菌(pseudomonassp.strain)fa1，在海洋沉积物中筛选出一株梭菌(clostridiumsp.strain)edb2，均具有cl-20降解作用。其中，js71不能以cl-20作为唯一氮源或碳源生长，且其生长和降解cl-20的速率均较低；fa1细菌中发现一种nadh依赖型酶，分别为亚硝酸盐还原酶(nitritereductase)和一氧化氮还原酶(nitricoxidereductase)，edb2中也发现了nadh依赖型酶，能够将cl-20降解为no2^-、n2o和hcooh。

目前，仅国外研究者开展了少量关于cl-20微生物降解的研究，其降解cl-20的效率均不高，且降解谱较窄，无论在降解机制及实际应用方面均无法发挥实际作用。因此，寻找能够在真实环境条件下高效降解cl-20的微生物菌株，对cl-20生产和应用导致的环境污染治理工作具有十分重要和现实的意义。

微生物材料的保藏

本发明涉及的菌株已于2019年8月8日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内的中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)中，保藏号为cgmccno.18373。分类学命名为假单胞菌pseudomonassp.。

技术实现要素：

为解决以上技术问题，本发明提供了一种可降解含能材料的菌株，所述菌株于2019年8月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)中，保藏号为cgmccno.18373。

本发明还提供了上述菌株在降解含能材料中的应用。

在一个实施方案中，所述含能材料为六硝基六氮杂异伍兹烷、三硝基甲苯、环三亚甲基三硝胺和环四亚甲基四硝胺中的一种或多种组合。

本发明还提供了一种降解含能材料的方法，包括在含有所述含能材料的环境中加入权利要求1所述的菌株的步骤。

在一个实施方案中，所述含能材料为六硝基六氮杂异伍兹烷、三硝基甲苯、环三亚甲基三硝胺和环四亚甲基四硝胺中的一种或多种组合。

在一个实施方案中，所述含能材料为六硝基六氮杂异伍兹烷。

在一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：

s1：将含有六硝基六氮杂异伍兹烷的材料配制成培养基；

s2：将所述菌株的细胞加入到所述培养基中，培养12h以上，得到培养物；

s3：除去所述培养物中的菌细胞。

在一个优选实施方案中，s1中的培养基不含其它氮源，或者其它氮源含量极低。

在一个优选实施方案中，s2中培养36-48h。

本发明的菌株为好氧的假单胞菌，能够以含能材料例如cl-20为唯一氮源生长，并高效降解其所处环境中的含能材料，最终可使含能材料浓度降低到0μg/ml左右，在治理含能材料例如cl-20生产和应用导致的环境污染中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为菌株zyl-01在cl-20无机盐固体培养基上划线培养48h后的菌落照片；

图2为菌株zyl-01在革兰氏染色后的光学显微照片；

图3菌株zyl-01的16srdna序列在ncbi进行blast比对后，采用mega5.0构建的系统发育树；

图4为lb培养基中菌株zyl-01在不同温度下的生长曲线；

图5为lb培养基中菌株zyl-01在不同ph值下培养20h后的od600的统计图；

图6为加有菌株zyl-01菌细胞的培养基中cl-20浓度随时间的变化。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.可降解cl-20菌株的筛选

称取5g土壤(来自辽宁省辽阳市某cl-20生产线的污水处理厂)，加入到cl-20无机盐培养基中，于28℃培养7d，使土壤中的微生物充分生长，随后进行传代培养。取5ml培养液加入新的cl-20无机盐培养基中，于28℃，150rpm恒温摇床培养7d。传代5次后，进行分离纯化，得到纯化的菌株。

无机盐培养基的配制：含na2hpo4·12h2o(浓度3.8g/l)和kh2po4(浓度1.5g/l)的溶液100ml，121℃高压灭菌20min，加入1ml高压灭菌的cacl2溶液(浓度0.755g/l)，1ml过滤除菌的含mgso4·7h2o(浓度5.0g/l)、mnso4·h2o(浓度0.152g/l)和feso4·7h2o(浓度0.5g/l)的溶液，1ml115℃高压灭菌的20％葡萄糖溶液，以及1ml过滤除菌的1％cl-20丙酮溶液。

将其中一株命名为zyl-01，保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内的中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)中，保藏号为cgmccno.18373。

2.菌株zyl-01的种属鉴定

将对数生长期的菌液划线接种至cl-20无机盐固体培养基中，28℃恒温培养48h，观察菌落形状、颜色、粘稠度、隆起及边缘形态等特征，并通过革兰氏染色在显微镜下观察细胞形态。结果如图1和2所示，zyl-01菌落为圆形，白色，直径约1-2mm，表明湿润，易挑起；zyl-01细胞呈杆状，2-3μm，无鞭毛，革兰氏染色呈阴性。

对其16srdna进行测序，序列如seqidno:1所示。将其16srdna序列在ncbi中进行blast比对，并构建系统发育树，结果如图3所示，菌株zyl-01的16srdna序列与假单胞菌属的类群具有较高同源性。

结合菌落和细胞形态，以及16srdna序列特性，将本发明的zyl-01菌株划入假单胞菌属。

3.菌株zyl-01的培养条件

在固体培养基中挑取单菌落，接种至25mllb培养基，28℃，150rpm摇床培养2-3d，至细菌生长至对数生长期。取25μl菌液接种至新的lb培养基，采用od600检测在不同温度(21℃、28℃、37℃)及ph值(4.0、5.5、7.0、8.5、10.0)条件下细菌的生长情况。

结果如图4和5所示，菌株zyl-01在温度21-37℃，ph5.5-8.5的条件下均可良好生长，培养的最适温度为28℃，最适ph为7.0。

4.菌株zyl-01降解cl-20

取用液体lb培养基培养至对数生长期的zyl-01培养物1ml，10000rpm离心5min后弃上清，加1ml无菌水重新悬浮后，加入25ml无机盐培养基中作为zyl-01组；将1ml无菌水重新悬浮的菌液经121℃，20min高压灭菌后，加入25ml无机盐培养基中作为对照组。28℃，150rpm摇床培养，检测不同时间点cl-20浓度。将培养物在12000rpm下离心5min，吸取上清，采用紫外分光光度法(od230)检测cl-20浓度。结果如表1和图6所示，菌株zyl-01能够在含有cl-20的无机盐培养基中生长，该培养基中仅cl-20分子中含有氮源，表明该细菌能够利用cl-20作为唯一氮源。菌株zyl-01在12h内可降解46.6μg/ml的cl-20，在36h内降解率达到97％以上，基本将培养基中的cl-20完全代谢。

表1加有zyl-01的培养基中cl-20浓度随培养时间的变化

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>西北工业大学

<120>一种可降解含能材料的菌株及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1479

<212>dna

<213>假单胞菌(pseudomonassp.)

<400>1

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