一种表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白重组病毒载体的构建与应用的制作方法

本发明涉及针对禽类传染性法氏囊病病毒vp2蛋白的疫苗及方法。

背景技术：

在不限制本发明范围的情况下，结合鸡传染性法氏囊病(infectiousbursaldisease，ibd)病毒的发病率和死亡率描述其背景。鸡传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒(infectiousbursaldiseasevirus，ibdv)引起的一种急性、高度接触性、传染性疾病。该病可通过损伤法氏囊造成机体免疫抑制进而引起雏鸡高死亡率。已知的ibdv有两个血清型，即血清i型和ii型，其中血清ii型不致病或有很弱的致病性，血清i型则可引起鸡群发病。从发现该病起的数十年中，血清i型ibdv产生了变异，经典株、变异株和超强株相继出现。20世纪90年代以来，高致死率的超强毒株(veryvirulentibdv，vvibdv)全球流行，给养禽业带来巨大损失。由于疫苗的开发、使用以及养殖管理技术的发展，vvibdv的流行逐渐被控制。但近年来ibd出现了新变化，非典型ibd在我国部分鸡场相继被发现，感染鸡无明显外观症状，但其中枢免疫器官法氏囊却严重萎缩，导致其严重免疫抑制和生产性能下降，严重威胁养禽业健康发展。

疫苗接种是预防和控制ibd最主要的措施，目前商品化的传染性法氏囊病活毒疫苗分为弱毒、中等毒和强毒三类。弱毒疫苗对鸡安全，但对有母源抗体的鸡群免疫保护效果不理想。中等毒力和强毒疫苗的免疫保护力虽然要好一些，但是由于具有一定的致病力会损伤法氏囊，也存在毒力返强的风险。另外，由于母源抗体的干扰以及ibdv的特点，在实际应用中传统疫苗可形成不可避免的免疫空白期。vp2蛋白是ibdv的主要保护性抗原且其中和抗体可以引发机体对法氏囊强毒攻击的保护，因此，构建表达ibdvvp2基因的疫苗具有较好的应用价值。

火鸡疱疹病毒(turkeyherpesvirus，hvt)属于鸡马立克氏病病毒血清iii型的一种α疱疹病毒。在火鸡中普遍存在，对家禽无致病性的病毒。从上个世纪70年代，hvtfc-126株就作为疫苗用于马立克氏病的预防和控制。由于其对家禽无致病性的特性，hvt作为活病毒载体构建新一代安全有效的疫苗已成为研究的重点方向之一。hvt有20多个可供外源基因插入的复制非必需区且可插入较长的外源基因。

技术实现要素：

一方面，本发明提供一种禽传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组载体或vp2基因免疫原性衍生物重组载体，该vp2基因来自传染性法氏囊病病毒的保护性抗原表位基因。

进一步，该vp2基因序列由seqidno：1编码，免疫原性衍生物是指与vp2序列相差1至100个核苷酸的基因序列、优指相差1至50个核苷酸的基因序列或指包含vp2基因的核苷酸序列。

在一个具体实施方案中，禽传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组载体或其免疫原性衍生基因重组载体由病毒载体编码。进一步，所述病毒载体是火鸡疱疹病毒。

在另一个具体实施方案中，禽传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组载体或其免疫原性衍生基因重组载体是重组病毒(rhvt-u3vp2)，是由火鸡疱疹病毒的非致病性骨架与禽传染性法氏囊病病毒vp2基因或其免疫原性衍生基因结合的重组病毒(rhvt-u3vp2)。

另一方面，本发明提供一种包含禽传染性法氏囊病病毒vp2基因重组载体或vp2基因免疫原性衍生基因重组载体的疫苗组合物。

在一个实施方案中，该疫苗组合物包含火鸡疱疹病毒的非致病性骨架与禽传染性法氏囊病病毒vp2基因或其免疫原性衍生基因结合的重组病毒(rhvt-u3vp2)。进一步，疫苗组合物包含编码vp2蛋白或其免疫原性衍生蛋白的火鸡疱疹病毒的重组病毒(rhvt-u3vp2)。

进一步，疫苗是活疫苗、经修饰的活疫苗。

在另一方面，本发明的疫苗组合物还包含佐剂。

在一个实施方案中，佐剂选自：水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素e佐剂及其组合。

在一个具体实施方案中，佐剂包含油乳剂，该油乳剂包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、角鲨烷、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯和缓冲盐溶液(sp-油)。

在一个实施方案中，该组合物还包含药学上可接受的载体。

在另一个实施方案中，该疫苗组合物还包含至少一种额外的抗原。在某些实施方案中，至少一种额外的抗原保护性地抵御可以引起禽疾病的微生物。

在另一个实施方案中，抗原包括一种或多于一种衍生于已知在禽中具有致病性的细菌、病毒、或寄生微生物的抗原。

本发明还提供了保护禽类免受马立克氏病和传染性法氏囊病病毒感染的方法。该方法包括向禽类施用免疫有效量的本文公开的疫苗组合物、或重组病毒载体。在多种实施方案中，该方法包括通过选自经胃肠道外、经口、皮内和经皮的一种或多于一种途径向禽类施用疫苗组合物或重组病毒载体。在另一个实施方案中，疫苗组合物或重组病毒载体以单剂量施用。

在另一个实施方案中，本发明的疫苗组合物与至少一种额外的抗原联合施用，该额外的抗原保护性地抵御可以引起禽类疾病的微生物。

附图说明

图1：转移载体p19-ul3/4-rfp示意图。

图2：转移载体p19-ul3/4-vp2-g示意图。

图3：重组病毒rhvt-u3vp2的pcr鉴定。

图4：重组病毒rhvt-u3vp2的间接免疫荧光鉴定。

图5：重组病毒rhvt-u3vp2遗传稳定性试验。

具体实施方式

虽然下面详细讨论了本发明各种实施方案的进行和使用，但应该理解，本发明提供了许多可以在各种特定情况下使用的可适用的发明概念。这里讨论的具体实施方案仅说明进行和使用本发明的具体方式，并不限制本发明的范围。

本文提供了通过vp2基因或对vp2基因的dna改造获得的vp2免疫原性衍生基因。

在一个实施方案中，当vp2基因或vp2免疫原性衍生基因置于火鸡疱疹病毒(hvt)骨架中时，嵌合型病毒诱导针对vp2基因的高中和保护性抗体滴度。

进一步本发明先构建了一株在hvt的ul3和ul4基因间插入红色荧光蛋白基因(rfp)标记的hvt病毒，然后构建携带绿色荧光蛋白基因(gfp)筛选标记、ibdvvp2基因及loxp基因的转移载体，应用绿色荧光蛋白筛选技术，获得了表达ibdvvp2基因的重组火鸡疱疹病毒株(rhvt-u3vp2)。本发明的双标记基因筛选技术提高了重组病毒的筛选效率；且该重组病毒免疫鸡后能够对传染性法氏囊病病毒的攻击产生完全的保护。

为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。本文定义的术语具有本发明相关领域中普通技术人员通常理解的含义。

术语“抗原”是指可以在动物中刺激抗体或t细胞应答或两者的产生的化合物、组合物或免疫原性物质，其包括注射或吸收到动物体内的组合物。可以对整个分子或分子的一部分(例如表位或半抗原)产生免疫应答。

术语“表位”是指充当抗体或t细胞受体识别的结合位点的抗原的不连续部分。例如，表位可以指由抗体的互补决定区(cdr)识别的抗原决定簇。各结合抗体的结合表位的部位称为“互补位”。

“免疫原性组合物或免疫组合物”是指包含至少一种抗原的物质的组合物，该抗原在宿主中引发对感兴趣的组合物或疫苗的细胞的免疫应答和/或抗体介导的免疫应答。

术语“免疫应答”是指在动物中引发的应答。免疫应答可以指细胞免疫(cmi)或体液免疫或可能涉及两者。本发明还考虑了限于免疫系统的一部分的应答。通常，“免疫应答”包括但不限于以下一种或多于一种事件：特异性导向包含在感兴趣的组合物或疫苗中的抗原的抗体、b细胞、辅助性t细胞、抑制性t细胞和/或细胞毒性t细胞的产生或活化。优选地，宿主将展示治疗性的或保护性的免疫应答，从而增强对新感染的抵抗力和/或降低疾病的临床严重度。通过被感染宿主通常显示的症状的减轻或缺乏、被感染宿主中更快的恢复时间和/或更低的病毒滴度来证明这种保护。

术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子以及其部分、片段、和衍生物，例如fab、fab’、f(ab’)2、fv、fsc、cdr区、或能够结合抗原或表位的抗体的任何部分，该能够结合抗原或表位的抗体包括具有双特异性的嵌合抗体或将源自抗体的抗原结合域与另一种多肽结合的嵌合抗体。

术语“单克隆抗体”包括由任何已知技术提供的衍生于单克隆抗体和各物种相应的单克隆抗体的嵌合抗体及其片段、部分、区域或衍生物，这些技术包括但不限于分子技术，包括噬菌体展示技术、亲和力成熟技术和定向诱变技术以及包括共价修饰和缀合的化学技术。

本文所用的“佐剂”是指由一种或多于一种增强对抗原的免疫应答的物质组成的组合物。佐剂如何起作用的机制尚不完全清楚。一些佐剂被认为通过缓慢释放抗原来增强免疫应答，而其他佐剂本身具有强免疫原性并被认为起到协同作。

如本文所用，术语“多价”是指含有一种以上抗原的疫苗，无论是来自相同物种(即禽传染性法氏囊病病毒的不同分离株)，还是来自不同物种或指含有来自不同属的抗原的组合的疫苗。

本文所用的术语“禽”是指的动物来源，其包括鸡。

如本文所用，术语“毒性(的)”是指分离物保留其在动物宿主中的感染性的能力。

病原体可以是细菌、病毒、原生动物或真菌。灭活可以通过多种方法完成，包括冻融、化学处理(例如，用硫柳汞或福尔马林处理)、超声处理、辐射、加热或任何其它足以在保持生物体免疫原性的同时防止其复制或生长的常规方法。

术语“药学上可接受的载体”是指用于包含可以注射到宿主中且没有副作用的疫苗抗原的流体载体。本领域已知的合适的药学上可接受的载体包括但不限于无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖或缓冲溶液。载体可包括助剂，助剂包括但不限于稀释剂、稳定剂(糖和氨基酸)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、ph缓冲剂、黏度增强添加剂、着色剂等。

术语“疫苗组合物”包括在药学上可接受的载体中的至少一种抗原或免疫原，其可用于在宿主中诱导免疫应答。疫苗组合物可以按剂量施用并通过医学或兽医领域技术人员熟知的技术施用，同时考虑例如接受体动物的年龄、性别、体重、物种和状况、以及给药途径等因素。给药途径可以是经皮(通过皮内、经皮、皮下、肌内途径而穿过皮肤或通过口腔、鼻腔、肛门、阴道而穿过黏膜)或通过肠胃外途径(静脉内或腹膜内)。疫苗组合物可以单独施用，或者可以与其他治疗或疗法共同施用或按顺序施用。给药形式可包括混悬剂、糖浆剂或酏剂，以及用于肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内给药(例如注射给药)的制剂，例如无菌混悬剂或乳剂。疫苗组合物可以以喷雾形式给药或混合于食物和/或水中或与合适的载体、稀释剂、或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖等混合递送。该组合物可含有辅助物质，如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂、佐剂、凝胶化或黏度增强添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等，这取决于给药途径和所需制剂。

本发明涉及的微生物资源信息

本发明涉及的微生物为：火鸡疱疹病毒(turkeyherpesvirus，hvt)cvccav19株，保存于北京市大兴区生物医药基地庆丰路33号中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心；经分子生物技术，将鸡传染性法氏囊病病毒vp2基因插入到hvtul3基因和ul4基因之间，获得的重组病毒，命名为rhvt-u3vp2，该株病毒已于2020年06月16日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为：cgmccno.19996；保藏生物材料的分类命名为：rhvt-u3vp2，并经保藏单位证明处于存活状态。

实施例

以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制。

实施例1：重组火鸡疱疹病毒(rhvt-u3vp2株)的构建

本发明所述重组火鸡疱疹病毒(rhvt-u3vp2株)的构建方法如下：

(1)含rfp表达框的转移载体构建

puc19载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程(大连)有限公司。含有phcmv启动子、bghploya的rfp报告基因载体p19-ul3/4-rfp(见图1)，由本发明人所在实验室构建、保存。

(2)引物设计

本发明的引物设计序列见表1

表1本发明构建所涉及的相关引物信息

(3)含rfp标记的火鸡疱疹病毒rhvt-u3r的构建

1)转移载体p19-ul3/4-rfp的构建

按照genbank中的hvtfc-126株基因序列(genbank登录号af291866)，利用cedesignv1.04设计同源重组连接引物ul3f/r与ul4f/r，以火鸡疱疹病毒fc-126株(cvccav19)基因组dna为pcr扩增模板，分别扩增ul3基因和ul4基因。扩增目的片段分别连接puc19载体，构建重组质粒puc19-ul3/4。利用cedesignv1.04设计同源重组连接引物phcmv～rfpf/r、bghployaf/r，分别以实验室内质粒pt-tk-rfp、pt-bghploya为模板扩增phcmv～rfp和bghploya片段，扩增的目的片段连接到puc19-ul3/4获得转移载体p19-ul3/4-rfp。

2)同源重组

按照lipofectamine^tm3000转染试剂盒(invitrogen公司)说明书，将转移载体p19-ul3/4-rfp与hvtfc-126株进行转染鸡胚成纤维细胞(cef)。具体步骤如下：

六孔板中的cef培养至长成70％～90％细胞单层时，接种适量的hvtfc-126株，放入5％co2的37℃培养箱中培养12h；取两个洁净离心管，每管加入125μlopti-mem培养基；向其中一管加入lipofectamine3000试剂7.5μl，振荡混匀；另一管中加入p3000试剂10μl与p19-ul3/4-rfp转移载体2.5μg，振荡混匀；将两管配好的试剂混合，充分混匀，室温静置15min；将接种有hvt的铺在6孔板中的cef从温箱中拿出，弃掉培养基，用opti-mem培养基洗两遍；将静置完成后的试剂均匀滴在6孔板中的一个孔中，补加500μlopti-mem培养基，放于5％co2的37℃培养箱中培养8-10h；将细胞板上转染过的孔里的液体弃掉，换5％胎牛血清f-10培养基继续培养。每隔12h观察转染后的细胞，等到细胞完全病变，收获细胞。将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板cef细胞，继续培养。每隔24h在荧光显微镜下观察细胞，挑取发出红色荧光的蚀斑接种已长成良好细胞单层的6孔板cef细胞，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为rhvt-u3r。

(4)表达鸡传染性法氏囊病病毒vp2基因重组火鸡疱疹病毒((rhvt-u3vp2株)的构建

1)转移载体p19-ul3/4-vp2-g的构建

提取ibdvhb96株的rna，以vp2f和vp2r引物rt-pcr扩增vp2基因。用bamhi与nhei双酶切p19-ul3/4-rfp，然后将目的片段与酶切后的p19-ul3/4-rfp载体连接，获得重组质粒puc19-ul3/4-vp2。将质粒pgfp-loxp和重组质粒puc19-ul3/4-vp2分别用bamhi进行酶切后连接，获得重组转移载体p19-ul3/4-vp2-g(见图2)。

2)同源重组

按照lipofectamine^tm3000转染试剂盒说明书，将转移载体p19-ul3/4-vp2-g与rhvt-u3r病毒进行转染鸡胚成纤维细胞(cef)。具体步骤如下：

六孔板中的cef培养至长成70％～90％细胞单层时，接种适量的rhvt-u3r，放入5％co2的37℃培养箱中培养12h；取两个洁净离心管，每管加入125μlopti-mem培养基；向其中一管加入lipofectamine3000试剂7.5μl，振荡混匀；另一管中加入p3000试剂10μl与p19-ul3/4-vp2-g转移载体2.5μg，振荡混匀；将两管配好的试剂混合，充分混匀，室温静置15min；将接种有rhvt-u3r的铺在6孔板中的cef从温箱中拿出，弃掉培养基，用opti-mem培养基洗两遍；将静置完成后的试剂均匀滴在6孔板中的一个孔中，补加500μlopti-mem培养基，放于5％co2的37℃培养箱中培养8-10h；将细胞板上转染过的孔里的液体弃掉，换5％胎牛血清f-10培养基继续培养。每隔12h观察转染后的细胞，等到细胞完全病变，收获细胞。将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板cef细胞，继续培养。每隔24h在荧光显微镜下观察细胞，挑取发出绿色荧光的蚀斑接种已长成良好细胞单层的6孔板cef细胞，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为rhvt-u3vp2-g。

3)rhvt-u3vp2-g中gfp基因的敲除

将获得的重组病毒rhvt-u3vp2-g接种已长成良好细胞单层的6孔板cef细胞，放入5％co2的37℃培养箱中培养12h；取两个洁净离心管，每管加入125μlopti-mem培养基；向其中一管加入lipofectamine3000试剂7.5μl，振荡混匀；另一管中加入p3000试剂10μl与pcdna3.1-cre质粒2.5μg，振荡混匀；将两管配好的试剂混合，充分混匀，室温静置15min；将接种有rhvt-u3vp2-g的铺在6孔板中的cef从温箱中拿出，弃掉培养基，用opti-mem培养基洗两遍；将静置完成后的试剂均匀滴在6孔板中的一个孔中，补加500μlopti-mem培养基，放于5％co2的37℃培养箱中培养8-10h；将细胞板上转染过的孔里的液体弃掉，换5％胎牛血清f-10培养基继续培养。每隔12h观察转染后的细胞，等到细胞完全病变，收获细胞。将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板cef细胞，继续培养。每隔24h在荧光显微镜下观察细胞，挑取发出无荧光的蚀斑接种已长成良好细胞单层的6孔板cef细胞，如此进行蚀斑纯化，至到在荧光显微镜下观察不到发出荧光的蚀斑。将获得的重组病毒命名为rhvt-u3vp2。

实施例2：重组火鸡疱疹病毒(rhvt-u3vp2株)的鉴定

1、重组病毒rhvt-u3vp2的pcr鉴定

采用ul3f、ul4r引物进行pcr扩增鉴定，pcr产物测序证实，vp2基因成功插入到ul3和ul4基因之间(见图3)。

2、重组病毒rhvt-u3vp2间接免疫荧光鉴定

将重组病毒rhvt-u3vp2及其亲本毒分别接种cef，当细胞病变达80％时，用间接免疫荧光法检测vp2基因的表达情况(见图4)。

间接免疫荧光步骤：弃去细胞培养液，用pbs(ph7.2)轻洗细胞表面1次，然后每孔加80％预冷的丙酮溶液500μl，室温放置20min，弃去液体，自然晾干；用pbs(ph7.2)洗细胞面1次，然后分别加入工作浓度的小鼠抗ibdvvp2单抗300μl，置于37℃温箱中孵育30min；弃去液体，用含0.05％吐温-20的pbs(ph7.2)洗3次；再向每个孔内加入cy3标记的山羊抗小鼠igg结合物300μl，置于37℃培养箱孵育30min；用含0.05％吐温-20的pbs(ph7.2)洗3次；在荧光倒置显微镜下观察。小鼠抗ibdvvp2单抗染色后，重组病毒rhvt-u3vp2出现了特异性红色荧光，而亲本毒无荧光。结果表明，重组病毒在cef中表达了vp2蛋白。

3、重组病毒rhvt-u3vp2病毒含量测定

重组病毒rhvt-u3vp2接种cef，用cef进行蚀斑计数，结果为10^6.0pfu/0.1ml。

4、重组病毒rhvt-u3vp2遗传稳定性试验

重组病毒rhvt-u3vp2病毒在cef细胞上传代20代，取其第1代、第5代和第10代毒应用pcr、间接免疫荧光检测，结果表明所获得的重组病毒rhvt-u3vp2在cef中稳定遗传、正确表达vp2蛋白(见图5)。

5、动物试验

1)安全性试验

将1日龄spf鸡25只，每只颈部皮下注射重组病毒rhvt-u3vp2，0.2ml/只(20000pfu/ml)观察21日，扑杀剖检，所有鸡只均无鸡传染性法氏囊病大体病变。另将30只1周龄spf鸡随机分成3组，每组10只鸡，第1组颈部皮下注射重组病毒rhvt-u3vp2作免疫组，0.2ml/只(20000pfu/ml)；第2组颈部皮下注射hvtfc-126株(cvccav19)做亲本毒株对照组，0.2ml/只(20000pfu/ml)；第3组不作处理，作空白对照组。每组单独隔离饲养。连续观察120天。免疫组、亲本毒株对照组、空白对照鸡均未出现任何马立克临床症状；观察结束时，剖检所有鸡只，均为观察到马立克病的大体病变。结果表明，该重组病毒rhvt-u3vp2与亲本毒株hvtfc-126一样，对spf鸡安全。

2)免疫原性试验

①马立克氏病部分

用1日龄spf鸡60只，其中20只肌肉注射重组病毒rhvt-u3vp2作免疫组，0.2ml/只(1000pfu/ml)；另外20只不免疫，作为攻毒对照组；其余20只不免疫不攻毒，作为阴性对照。接种后21d，取全部免疫鸡和攻毒对照鸡，腹腔接种京-1株强毒10^-10.2ml，连续观察60d。结果显示：攻毒对照鸡19只发病，md阳性率95％，剖检观察显示明显的马立克氏大体病变，免疫组16只鸡无马立克氏大体病变，80％保护。健康组无md病变。

②传染性法氏囊病(ibdvvp2蛋白)部分

将30只1周龄spf鸡，随机分成3组，每组10只。第1组颈部皮下注射重组病毒rhvt-u3vp2作免疫组，0.2ml/只(5000pfu/ml)；第2组不免疫，作攻毒对照；第3组不免疫，作空白对照。每组单独隔离饲养。在免疫后28天，翅静脉采血后，滴鼻接种ibdvbc6/85株(cvccav7)，每只100bid。观察3d，将免疫组与对照组实验鸡全部处死，剖检并取下法氏囊，观察法氏囊病变。空白对照组法氏囊正常，攻毒对照组法氏囊100％病变，免疫组100％保护(表2)，说明rhvt-u3vp2具有良好的免疫原性。

实施例3：疫苗的制备

(1)疫苗制备

1)细胞制备：选择发育良好的9～11日龄spf鸡胚，按照常规胰酶消化法制成cef，培养24小时左右长成单层备用。

2)病毒液的制备：按体积比0.01％～0.5％的接毒量将生产种毒rhvt-u3vp2株接种cef细胞单层，5％co237℃培养箱中培养36～72小时，当病变率达85％以上收获细胞，加入细胞冻存液配成细胞悬液。

4)配苗及分装：按照dmso含量(v/v)10％和牛血清含量(v/v)20％加入到收集的细胞悬液中，混匀，按每安瓿2.0ml分装并封口。

5)保存将分装、已贴好标签的疫苗安瓿立即置程序降温仪内进行冷冻。取出后放入液氮罐内。

实施例4：疫苗检验

(1)疫苗检验：

本发明涉及到的相关检验方法按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典2015年版(三部).中国农业出版社，2016，本发明称《中国兽药典》)的方法进行。

1)性状淡粉色混悬液。

2)无菌检验按现行《中国兽药典》进行检验，无菌生长。

3)支原体检验按现行《中国兽药典》进行检验，无支原体生长。

4)外源病毒检验

a.鸡传染性贫血病毒(cav)检验用1日龄spf鸡20只，每只同时点眼、滴鼻接种10羽份疫苗，肌肉注射100羽份疫苗，21日后，按上述方法和剂量重复接种1次。第1次接种后42日采血，分离血清，用商品化cav抗体检测试剂盒进行cav抗体检测，为阴性。

b.其他外源病毒检验按现行《中国兽药典》进行检验，无外源病毒污染。

5)鉴别检验

采用疫苗稀释液稀释疫苗后与小鼠抗ibdvvp2单抗做间接免疫荧光反应，接种疫苗的cef培养皿应为红色荧光，而hvt病毒对照培养皿及细胞对照培养皿无此荧光反应的标准检验，接种疫苗的cef培养皿为红色荧光，而hvt病毒对照培养皿及细胞对照培养皿无此荧光反应。

6)安全检验采用1日龄spf鸡20只，取10只，每只肌肉或皮下注射疫苗0.2ml(含10羽份)，另10只作对照。观察21d，对照鸡应至少存活8只，免疫组非特异死亡数应不超过对照组的标准检验，免疫组：10/10存活，无md临床症状及眼观变化；对照组：10/10存活。

7)效力检验

免疫攻毒法：

①用1日龄spf鸡60只，其中20只颈部皮下注射疫苗1羽份疫苗(0.2ml/只)作免疫组，；另外20只不免疫，作为攻毒对照组；其余20只不免疫不攻毒，作为阴性对照。接种后10日，取全部免疫鸡和攻毒对照鸡，腹腔接种鸡马立克氏病病毒超强毒京-1株强毒10-10.2ml，连续观察60日。观察期间死亡的鸡需剖检是否有鸡马立克氏病大体病变；观察结束时，将试验鸡扑杀，剖检观察是否有鸡马立克氏病大体病变。攻毒对照鸡md阳性率≥60％，免疫组的md减少率≥60％，同批隔离饲养的20只阴性对照鸡应无md病变。

结果表明：攻毒对照鸡md阳性率80％，免疫组md减少率81％。阴性对照鸡20/20存活，且无md病变。

②鸡传染性法氏囊病(ibdvvp2蛋白)部分

取1周龄spf鸡10只，按瓶签注明羽份，每只颈部注射接种疫苗0.2ml(含10羽份)，另各取5只鸡不免疫作攻毒对照和空白对照，在同样条件下隔离饲养。21-28日后，取全部免疫鸡连同对照鸡，每只点眼攻击ibdvbc6/85株(cvccav7)强毒至少10bid，72h后将所有鸡剖检，检查法氏囊变化，空白对照组5只鸡法氏囊应无任何变化，攻毒对照组5只鸡应至少有4只鸡的法氏囊出现病变，免疫组应至少有8只鸡的法氏囊无病变。

结果表明：空白对照组5/5法氏囊无病变，攻毒对照组5/5法氏囊病变，免疫组10/10法氏囊无病变。

实施例5：重组病毒rhvt-u3vp2的应用

根据genbank公布的h9亚型禽流感病毒ha基因序列，人工合成ha基因(seqidno：2)，通过psti酶切插入到转移载体p19-ul3/4-vp2-g中，获得重组转移载体p19-ul3/4-ha-g。

按照lipofectamine^tm3000转染试剂盒说明书，将转移载体p19-ul3/4-ha-g与rhvt-u3r病毒进行转染鸡胚成纤维细胞(cef)。经蚀斑纯化，获得的重组病毒rhvt-u3ha-g株。利用cre-loxp系统，获得重组病毒rhvt-u3ha。

本发明构建了表达鸡传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组火鸡疱疹病毒(rhvt-u3vp2)，将该重组病毒rhvt-u3vp2株制备成活疫苗，可预防马立克氏病和传染性法氏囊病；在构建过程中携带红色荧光标记的重组火鸡疱疹病毒载体(rhvt-u3r)，可通过同源重组的方法，应用该载体表达外源基因，为火鸡疱疹病毒作为载体构建抗马立克氏病和其他病原的新型重组疫苗打下基础。