工程化细鞘丝藻及其生产GLA的应用的制作方法

本发明涉及微藻合成生物学领域，更特别地，涉及一种工程化的细鞘丝藻及其应用，以及一种新的desb基因。

背景技术：

多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid，pufa)是指含有两个或两个以上双键且碳长度为18-22个碳原子的直链脂肪酸，主要包括亚油酸(la)、γ-亚麻酸(gla)、α-亚麻酸(ala)、花生四烯酸(ara)、二十碳五烯酸(epa)、二十二碳六烯酸(dha)等。在pufa中，距羧基端最远的双键在第3个碳原子上则称为ω-3(n-3)系列，如在第6个碳原子上则称为ω-6(n-6)系列。

γ-亚麻酸(γ-linolenicacid，gla)为ω-6系列多不饱和脂肪酸，是人体的必需脂肪酸，参与到多种代谢途径和组织结构中，它在人体组织中存在时间很短，且含量很少。正常人从食物中摄取的亚油酸(linoleicacid，la)经δ-6脱氢酶化为gla，进而代谢为二高-γ-亚麻酸(doom-γ-linolenicacid，dgla)，再转变成前列腺素e1(pge1)，或经δ-5脱氢酶转化为花生四烯酸(arachidonicacid，ara)生成其它前列腺素(pgs)。但当人体摄取过量的饱和脂肪酸或出现脂肪酸代谢紊乱时，δ-6脱氢酶受到抑制，则影响亚油酸向gla的转化，可造成体内前列腺素缺乏，导致多种疾病产生。此时，需要及时补充gla来防止或治疗相应的疾病。因此，gla可在抗炎、降血脂、抗肿瘤、改善糖尿病并发症、防治高血压和动脉粥样硬化、抗心脑血管疾病等方面起重要作用。

目前，在一些高等植物、蓝藻和异养微生物中均发现有gla的存在。如高等植物的月见草(oenotherabiennisl1)种子中油脂含量为15-25％，其中gla占7-11.22％；玻璃苣(boragoofficinalisl1)种子中的油脂含量20-30％，其中gla占15-25％；蓝藻中节旋藻(arthrospirasp.；过去称为螺旋藻，spirulinasp.)的gla的含量可占细胞总脂的8％-25％，曾有报道在一株钝顶节旋藻中，gla可占细胞干重的2％(roughan,1989)；在真菌的被孢霉属(mortierellaramannianavar)中gla一般可占细胞总脂的10％左右，深黄被孢霉(mortierellaisabellina)中gla占细胞总脂的3％-11％，何东平等通过诱变技术得到一种深黄被孢霉的突变株，突变株中gla可占总脂的8.5-10.3％。

目前gla在工业上的生产主要是利用真菌的发酵来进行，如日本学者铃木修利用被孢霉发酵产gla，发酵150h后,gla的产量最高达到2.9g·l^-1，gla产率为0.464g·l^-1·d^-1；邢来君等人利用200l发酵罐内发酵培养96h，最终可获得1.34g·l^-1的gla，gla产率为0.335g·l^-1·d^-1。但是利用真菌发酵生产gla需要昂贵的发酵设备及添加葡萄糖等碳源，生产成本高，而且真菌来源的gla往往含有其异构体(ala)，需要进一步纯化，加大了生产成本。

节旋藻是目前少数可以进行户外规模化养殖的微藻，相比发酵生产，其成本更低，可以进行光合自养，无须额外补充碳源，但是节旋藻适宜养殖温度在30℃左右，一般在25-35℃之间，温度过高(40℃)或者过低(20℃以下)均不能正常生长(特别是冬季低温和夏季高温条件下)。此外，有研究表明温度过高后者过低均显著降低节旋藻中gla含量的。

细鞘丝藻(leptolyngbyasp.)也可以进行规模化养殖，并且比节旋藻生长更快，温度适应范围更宽，尤其是在40℃生长良好，对于夏季户外培养棚中的高温条件有较好的适应能力。细鞘丝藻的另一个突出优点是可以通过接合转移进行遗传操作。但是，细鞘丝藻本身可以合成ala而不是gla，因此，我们希望通过基因工程的手段对细鞘丝藻的脂肪酸合成途径进行改造，一方面阻断ala合成，另一方面过量表达合成gla的基因，获得能生产gla的细鞘丝藻工程藻株。

技术实现要素：

为解决以上问题，本发明通过对细鞘丝藻进行了遗传操作，使其不能合成ala，转而合成gla。

基于以上工作，本发明提供了细鞘丝藻在生产gla上的应用。

本发明还提供了一种工程化的细鞘丝藻，所述细鞘丝藻中，desb基因被敲除，并且转入desd基因过表达盒。

在一个优选实施方案中，所述desd基因过表达盒含有强启动子和desd基因编码序列。

在一个具体是实施方案中，所述desd基因编码序列如seqidno:1所示。

在一个具体实施方案中，所用的强启动子为在细鞘丝藻中可组成型强表达或可诱导强表达的启动子，例如，psba、rbcl和cpcb等基因的启动子。也可以将这些启动子组合使用。

在一个优选实施方案中，所述desd基因过表达盒插入到所述desb基因内，使所述desb基因被敲除。尽管列举该方案作为一个优选方案，但是本发明的范围不限于此，任何将desb基因敲除同时过表达desd基因的方法均落在本发明的保护范围内。

在一个具体实施方案中，用于工程化的原始藻株为具有ala合成路径的细鞘丝藻，例如，leptolyngbyasp.bl0902，并且desb基因的序列如seqidno:2所示。

在一个具体实施方案中，上述用于生产gla的细鞘丝藻藻株为2020年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号cctccm2020087的藻株。

本发明还提供了一种生产gla的方法，包括培养上述细鞘丝藻，并使所述细鞘丝藻生产gla的步骤。

在一个具体实施方案中，所述细鞘丝藻的培养温度为20-40℃。

本发明还提供了一种△15脂肪酸脱饱和酶编码基因，编码的氨基酸序列如seqidno:3所示。

在一个具体实施方案中，所述的△15脂肪酸脱饱和酶编码基因的核酸序列如seqidno:2所示。

本发明的工程化细鞘丝藻能够开放式大规模培养。在开放式半连续培养中，藻株具有良好的生物质产率和gla产率(平均生物质产率为19.1±4.9g·m^-2·d^-1，平均gla产率为0.35±0.07g·m^-2·d^-1)。此外，本发明的工程化细鞘丝藻不生产ala，省去了分离gla与ala工序，降低了纯化难度和成本。

生物材料保藏

我们已于2020年4月28日将一株可产生gla不产生ala的细鞘丝藻保藏于中国湖北省武汉市武汉大学的中国中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctccm2020087。该藻株的分类学命名为：细鞘丝藻ppsba-desdleptolyngbyasp.ppsba-desd。

附图说明

图1为运载质粒phb6127的图谱；

图2为细鞘丝藻desd过表达株ppsba-desd的基因组结构示意图；

图3为细鞘丝藻ppsba-desd和野生型的gc图谱；

图4为不同温度下培养的细鞘丝藻ppsba-desd的gla含量(％细胞干重)；

图5为细鞘丝藻ppsba-desd在跑道池中半连续培养过程的生物量(左)和浊度(右)曲线。

具体实施方式

1、原始藻株

本发明用于构建产gla工程藻的原始藻株为野生型的细鞘丝藻(leptolyngbyasp.bl0902)由美国加州大学圣地亚哥分校的jamesw.golden教授馈赠。我们的研究显示，该藻株可产生ala，不产生gla。

我们对细鞘丝藻bl0902进行基因组测序，并对所获得的序列信息进行分析，结果发现该藻株的基因组中存在一个基因有可能是△15脂肪酸脱饱和酶编码基因(desb基因)，其核酸序列如seqidno：2所示，氨基酸序列如seqidno:3所示。我们对细鞘丝藻bl0902进行遗传操作，敲除该基因，结果显示，敲除突变株不再产生ala(图3)，这说明该基因确实是将亚油酸转化成ala的关键基因desb基因。

2、运载质粒phb6127的构建

构建质粒所用限制性内切酶、t4dna聚合酶、taqdna聚合酶和t4dna连接酶均为大连宝生物有限公司(takara)产品。

以细鞘丝藻的基因组dna为模版，以引物l-desb-1和l-desb-2为引物对desb基因进行pcr扩增，pcr产物克隆至pmd18-t中，测序无误，重组质粒命名为phb6104。

以集胞藻pcc6803的基因组dna为模版，以desd-1和desd-2为引物，pcr扩增集胞藻的△6脂肪酸脱饱和酶编码基因(desd基因)，pcr产物克隆至pmd18-t中，重组质粒命名为phb6105。

将omega片段用drai从prl57上切下，克隆至经过psti酶切并补平的phb6105中，使omega片段置于desd基因的3′端，得到的重组质粒命名为phb6111，该质粒含有desd-omega片段。

将desd-omega片段利用pvuii和bamhi从phb6111上切下，克隆到经过ecori(补平)及bamhi酶切的prl439中，使得ppsba启动子置于desd-omega片段的5′端，得到的重组质粒命名为phb6119，该质粒含有ppsba-desd-omega片段。

利用psti和hindiii双酶切将ppsba-desd-omega片段从质粒phb6119上切下，补平后克隆至经过phb6104的bali位点，得到的重组质粒命名为phb6125中，该质粒含有5′desb-ppsba-desd-omega-3′desb片段。

将含有5′desb-ppsba-desd-omega-3′desb的片段利用spei从phb6125上切下，克隆至prl271的spei位点，得到的重组质粒命名为phb6127。如图1所示，该质粒含有ppsba-desd基因，其上下游还含有细鞘丝藻desb基因片段。

3、产gla的细鞘丝藻藻株的构建

通过三亲接合转移将质粒导入细鞘丝藻，接合转移按照相关文献的方法进行并略有改动。首先将运载质粒phb6127转化到含有辅助质粒pds4101的e.colidh10b中，然后在接合质粒prl443的帮助下，通过接合转移，将运载质粒导入到细鞘丝藻中。具体方法如下：

含有不同质粒的e.coli菌株分别接种到30mllb培养基中(按照需要添加不同浓度的抗生素)，37℃摇床培养过夜(对于含有phb6127质粒的菌株采用30℃培养)，离心(4000rpm，5min)收集细胞，利用无抗生素的新鲜lb洗涤菌体三次，最后各用1mllb重悬细胞。

取30ml培养至对数期的细鞘丝藻培养物，离心收集藻细胞，用新鲜bg11培养基洗涤三次后悬浮于1mlbg11培养基中。

将含有运载质粒和辅助质粒的菌液、含有接合质粒的菌液以及细鞘丝藻液混合，涂布到预置于bg11平板(不含抗生素)的nc膜上，将含有nc膜的平板置于30℃和30μe·m^-2·s^-1持续光照下培养36h，然后将该nc膜转移到含有壮观霉素sp(5μg.ml^-1)的bg11平板上继续培养8-10天，待膜上长出藻落。挑取单藻落在bg11平板(含sp)上划线，待长绿后，刮取藻细胞至bg11液体培养基(含sp)培养。取对数期培养物，提取藻细胞dna，进行pcr检测，确定目的藻株中desb基因被ppsba-desd-omega片段插入(图2)，得到的藻株可以在实现对desb基因插入失活的同时过表达desd。该工程藻株命名为细鞘丝藻ppsba-desd。

将该藻株已于2020年4月28日保藏于中国湖北省武汉市武汉大学的中国中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctccm2020087。

4、测试温度对细鞘丝藻ppsba-desd的影响

不同温度下藻株的培养：利用改良的zarrouk培养基在1000ml的三角瓶中进行，光照强度为30μe·m^-2·s^-1并持续通入空气，培养温度分别为20℃、30℃和40℃。

细胞干重的测量：取50-100ml培养的藻液通过真空过滤到一张事先称重的微孔滤膜上(whatmangf/c)，然后利用0.5nhcl清洗滤膜，将含有细胞的滤膜置于105℃烘箱烘干至恒重(约4h)，利用滤膜过滤前后的重量差计算出细胞的干重。

总脂提取：总脂的提取参照相关文献，稍有修改。称取0.1g干藻粉于15ml玻璃离心管中，加入2ml的氯仿和2ml的甲醇，涡旋振荡1min左右。然后利用超声波破碎仪，以200w功率的超声波粉碎藻细胞，超声破碎仪设置成每工作3s间隔3s，重复99次。超声破碎后，静置30min，2000rpm离心10min，转移上层提取物溶液至15ml圆底玻璃离心管中。重复上述超声、离心和转移提取液步骤3遍。最后，向15ml圆底玻璃离心管中加入1/3体积灭菌超纯水，稍微振荡，2000rpm离心10min。转移下层有机相至已知重量的称量瓶中，置于通风橱中用氮气吹干至恒重，称重，得到总脂重量。

细胞总脂的甲脂化：将提取的总脂(3-5mg)转至1.5mlagilent玻璃瓶中，用氮气吹干各溶剂后，加入1ml1m的硫酸甲醇溶液，充氮气后密封，沸水浴1h。自然冷却，加入200μl蒸馏水(ddh2o)，混匀，用200μl正己烷萃取，萃取3次，合并有机相，用氮气吹干；用100μl正己烷重新溶解油脂，取1μl样品，通过gc分析脂肪酸组成。

细胞gla含量分析：利用文献所述的全细胞甲酯化分析gla含量并稍有改动：离心收集培养的藻细胞，冷冻干燥后取～10mg干藻粉到预先称重的gc瓶中，依次加入25μlc13:0脂肪酸内参(10mg/ml)、200μl氯仿/甲醇(2:1,v/v)和300μl含有5％hcl的甲醇溶液，密封后振荡混匀。将gc瓶置于85℃反应1小时，然后自然冷却到室温(20min)。在gc瓶中加入1ml正己烷后震荡1min，2000rpm离心1min收集上层有机相。取1μl有机相进行气相色谱(gc)分析。

气相色谱分析：所用气相色谱分析仪为ultratrace(thermoscientific,unitedstates)，配氢火焰离子化检测器(fad)；采用db-23石英毛细管柱(0.25mm×60m，膜层厚500nm；agilenttechnologies,unitedstates)。气相色谱分析程序如下：起始柱温50℃保持1min，每分钟升温40℃至170℃，然后每分钟升温18℃至210℃，保持18min；进样口温度270℃，分流比为10～20:1；以n2为载气，恒流方式，流量为2ml/min；检测器温度280℃，空气流量为350ml/min，h2流量为35ml/min。通过色谱峰滞留时间及峰面积来进行脂肪酸的定性及定量分析，通过内参十三碳脂肪酸(c13:0)的甲酯化计算脂肪酸甲酯化效率，利用正十五烷及脂肪酸甲酯混合标准样品来计算脂肪酸及gla含量的含量。脂肪酸混合标准样品(c8-c24famemix)、十三碳脂肪酸(c13:0)及正十五烷购自sigmaaldrich(usa)，分析所用其它试剂(hplc级)均购自上海国药试剂公司。

图3是野生型细鞘丝藻(wt)和细鞘丝藻ppsba-desd的脂肪酸组成的气相色谱图，可看出，野生型细鞘丝藻的脂肪酸中含有ala，检测不到gla；细鞘丝藻ppsba-desd的脂肪酸中含有大量的gla，检测不到ala。由此可见，本发明的工程藻株细鞘丝藻ppsba-desd可大量产生gla，并且不产生ala。

图4为不同温度下培养的细鞘丝藻ppsba-desd中gla含量的对比图。从图中可知，在20-40℃之间，细鞘丝藻ppsba-desd均可大量产生gla，并且gla含量随温度的提高而提高。

5、细鞘丝藻ppsba-desd的开放式半连续培养

在自制的1m²(100l)环形跑道池中进行。跑道池水深10cm，上下双面光照强度均为100μe·m^-2·s^-1，持续光照。培养过程中水温保持28-30℃，培养过程中持续通入4％co2(v/v)，初始培养5天后收集50l培养液，同时补充50l新鲜的培养基。之后每培养2天收集50l培养液并补充同等体积新鲜培养基，共计收集三次50l培养液，整个半连续培养过程持续16天。细胞起始浓度为od730nm＝0.1，培养过程中每天补充约4l的培养基，跑道池培养液的循环流动由一个直径为0.3m的电动搅拌轮(转速20rpm)来实现。

细鞘丝藻ppsba-desd的开放式半连续培养中生长曲线如图5所示，细鞘丝藻ppsba-desd在跑道池中生长良好，最高od达到3左右，生物量最高达到1.2g/l左右。

细鞘丝藻ppsba-desd的开放式半连续培养独立进行了两次，对收集的藻细胞按上文的方法提取总脂并通过gc分析脂肪酸组成，计算gla产率。两次独立实验的平均生物质产率为19.1±4.9g·m^-2·d^-1，平均gla产率为0.35±0.07g·m^-2·d^-1。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国科学院水生生物研究所

<120>工程化细鞘丝藻及其生产gla的应用

<141>2020-04-30

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1080

<212>dna

<213>synechocystispcc6803

<400>1

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<210>2

<211>1128

<212>dna

<213>细鞘丝藻(leptolyngbyasp.)

<400>2

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<210>3

<211>376

<212>prt

<213>细鞘丝藻(leptolyngbyasp.)

<400>3

metileleuserglyserleuleuphethrvallyspheglythrphe

151015

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