一种安息香酸类分子探针及其制备方法与流程

本发明涉及分子探针
技术领域：
，尤其涉及一种安息香酸类分子探针及其制备方法。
背景技术：
：中药天然产物，是指自然界的动物、植物、微生物等在内的生命体在其新陈代谢中所产生合成的代谢产物，其可以分为初级代谢产物以及次级代谢产物。初级代谢产物指多糖、脂类、氨基酸、核苷酸乃至维生素等，它们的特点是都是为生物自身成长代谢繁殖所必须的物质；而次级代谢产物则是以初级代谢产物为前体，产生的小分子有机化合物，次级代谢过程产生的化合物种类较多，其中包括糖类、苯丙素类、醌类、木脂素类、香豆素类、黄酮类、萜类、生物碱类、甾体等，就开发天然产物的中药而言，次级代谢产物的应用较于初级代谢产物要更为广泛。[1]由于天然产物分子结构种类的多样性，所以天然产物通常都会包含多种的生理活性。由于这些多种多样的生理活性，许多天然产物分子已被开发为药物，并被广泛用于治疗多种重大疾病，例如：恶性肿瘤，心血管系统疾病、免疫系统疾病、乃至各种传染性疾病等，越来越多的天然产物被开发作为药物治疗对应的疾病。[2]如今，天然产物，以及是以天然产物的活性成为作为先导结构而发展得到的衍生物、类似物还有全合成化合物已经占临床上应用的药物比例的三分之一以上。[3]所以，利用天然产物进行药物设计已经成为了现代创新药物产生的一种有效途径。[4]不过，由于近年来随着有机化学和药物化学的逐步发展，天然产物分子本身的性质已经逐渐被各项研究发掘，而大多数天然产物分子结构存在的缺陷也需要人工改良。所以，人工合成的小分子药物将逐步取代直接使用天然产物作为药物的主导地位，在将来天然产物新药的研发将更多围绕天然产物分子的结构修饰改良而不是通过直接开发天然药物本身了，这也是药学发展的历史进程所在。因此，新药开发的重要手段之一，就是针对天然产物分子进行改造或者利用天然产物分子的结构特征进行人工化学合成。我们可以经过对天然产物分子结构改良，对天然产物的衍生化修饰，可以改良天然产物的物理性质和化学性质，譬如通过优化该化合物的溶解度和稳定性，从而可以改善药物在体内的药物代谢动力学状态。我们还可以通过改变活性或者选择性的官能团结构，来降低天然产物的毒性作用，使天然产物的成药性得以增强。天然产物衍生化的前提条件，是基于准确无误的天然产物结构，所以在小分子药物研发尤其是天然产物药物的研发过程中，结构鉴定作为研发的基础，衍生化和药理活性的确认是必需的手段，这两者相辅相成，缺一不可。[5]药物靶标主要包括受体、酶、核酸、基因位点和离子通道蛋白质等，是药物发挥治疗作用，一般是实现药物临床疗效的生物大分子或是特定的生物大分子结构域。[6]在生物体内，活性天然产物分子发挥药性作用的基础就是其与细胞内的药物靶标相互作用，所以，靶点的确定便是基于天然产物及其衍生物新药发现首当其冲的关键步骤。[7]为了对天然产物分子的作用机制作一个深入的研究，进而为通过天然产物结构针对性改造，同时为了尽早可以发现天然产物分子结构导致潜在的缺陷，例如某些结构导致的毒副作用等，在天然产物药物研发的起始阶段便对天然产物分子的作用靶点进行明确化是非常有必要的，在起始阶段确认靶点还有利于降低药物研发的成本，减少可能存在的弯路。在生物体内，包括天然产物在内的小分子化合物通过结合大分子靶标，可在基因组,转录组，蛋白质组和代谢组等各个层面引起表型变化。在这大多数情况下，大分子靶标通常会作为靶点蛋白，即与天然产物起相互作用的蛋白质，这是因为蛋白质充当了细胞功能的主要执行者。然而现在对天然产物分子的作用机制研究较多处于滞后状态，这是因为大多数天然产物分子的化学成分较为复杂，而且天然产物具有“多重靶标”的特性，使得较难以准确找到药效成分在体内的吸收分布代谢途径，以上的困难是对天然产物的进一步开发和应用的限制。因此，中药天然产物活性成分作用靶点的确定是具有重大意义的——这将在分子水平上阐明天然产物入药的药效的物质基础，作用机制，和作用特点。[8]当前对于天然产物靶点的鉴定方法策略共可以分两大类，第一类可称为正向策略，它确定天然产物靶点的根据是天然产物引起的表型变化或者是依靠与之相关的已知信号通路和作用网络进行推测，它的方法包括差异基因组学/蛋白质组学分析，细胞形态分析差异等；而第二类则是逆向策略，它则是以小分子天然产物为起点筛选靶点蛋白，后者包括化学蛋白质组学，化学基因组学和生物物理学等方法。本次实验即是重点讨论研究逆向策略中的化学蛋白质组学方法。化学蛋白质组学是活性天然产物靶标鉴定最为常用的方法，他也被称作基于亲和性蛋白质组分析。[9]化学蛋白质组学技能的核心要素便是分子探针，分子探针，本质是将活性分子骨架和报告基团通过化学合成的手段，二者连接结合，组成的活性分子衍生物。报告基团就是可以特异性标记和富集相对应的蛋白质的特殊官能团，报告基团一般是固相介质、荧光或者生物素。当活性分子骨架与报告基团连接成功后，活性分子的骨架端结构可以结合其对应的靶点蛋白，然后就可以对报告基团相连的活性分子和靶点蛋白结合的产物进行标记和富集，完成对靶点蛋白的富集、提取、洗脱和酶解，最后可以用质谱对该蛋白进行鉴定操作。化学蛋白质组学的靶点判定的方法同样可以分成两类，亲和性探针是第一类，它的基础是建立在天然产物结构之上，并能富集在蛋白质组中与之结合的蛋白；第二类则主要是用竞争性策略筛选与目标天然产物有关联的蛋白质和结合位点，这类活性分子探针的基础则是以位于天然产物分子骨架之中的特定官能团活性或者功能而选择的。对于化学蛋白质组学的分子探针设计将会变得越来越多样化，这是因为目前天然产物靶标的确定将会越来越复杂化。在最初的时候，当时的研究方案是用惰性树脂通过化学合成的方法与天然产物相结合而固定，这些惰性树脂采用的材料一般为可与生物相容的磁珠或者琼脂糖凝胶，这些树脂即可“钓取”与蛋白质组中能与其相互作用的蛋白质。这些固定化小分子的设计便是分子探针的最经典的设计策略。但是这种早期设计存在非常大的缺陷，因为化合物的活性非常容易受到影响，若是引入空间位阻较大的亲和标签，将很容易导致前者的活性降低甚至消失。因此需要找到新的方法来克服弥补这一经典方法的不足之处。生物正交化学反应的发展有效缓解了上述的问题，最近以来应用最为广泛的靶点鉴定策略之一便是在引入生物正交反应基团到天然产物分子骨架之上。[10]有机合成引入生物正交基团，如炔基等小分子，后者对原来的化合物的化学性质干扰较小，这种探针可以允许活性天然产物的衍生物仍然可以结合对应的靶点蛋白，结合的环境可以是活细胞或是细胞裂解液中，这便大大加大了灵活性和准确性。随后利用点击反应再将叠氮修饰的报告基团(生物素或荧光)连接到探针-靶标蛋白复合物上，最后就可以对靶标进行检测、富集和鉴定。[11]本次实验，便是以后者为研究思路来对安息香和灵芝的天然产物进行若干活性分子探针的设计与合成。安息香原产地位于中亚的阿拉伯半岛和伊朗高原，其名由唐宋时经波斯语mukul和阿拉伯语aflatoon的而翻译得到。早在《酉阳杂俎》便已有安息香作为药材用，来自故安息国，龟兹国和波斯国的记载了。《新修本草》对安息香的描述记载是：“安息香，味辛，香、平、无毒。主心腹恶气鬼。西戎似松脂，黄黑各为块，新者亦柔韧”。安息香为球形颗粒压结成的团块，大小不等，外面红棕色至灰棕色，嵌有黄白色及灰白色不透明的杏仁样颗粒，表面粗糙不平坦。常温下质坚脆，加热即软化。安息香属是野茉莉科中种系最多、分布最广的一个属，约有130种，主要分布在亚洲和美洲，在我国湖南、云南、贵州、四川、广东、广西等地均有分布。安息香又名白花榔、拙贝罗香，商品名为泰国安息香，是一种常用的芳香开窍药，始载于《唐本草》，《本草从新》、《海药本草》、《本草纲目》中亦有记载。2015年版中国药典以其为安息香科植物白花树安息香科植物白花树的干燥树脂，是安息香属中研究最多、最具代表性的品种，此药味辛、苦，性平，归心、脾经，此药味辛、苦，性平，归心、脾经，具有开窍醒神、活血行气、止痛的功效，可用于治疗中风痰厥、气郁暴厥、中恶昏迷、心腹疼痛、产后血晕等症。[12]安息香的主要天然产物成分包括香脂酸类，木质素类以及三萜类。此前，对于安息香三萜已有一定的研究，但是对该天然产物分子作用靶点蛋白是什么以及该天然产物分子产生药理作用机制尚不十分明确。我们希望通过分子探针技术，来更好的鉴别天然产物分子的作用靶点及其找出其作用机制。要实现这一目的，便需要根据相关中药天然产物分子的性质，设计并合成相应的分子探针。所以本次实验的目的是根据安息香酸天然产物分子骨架形式和此类型分子探针的研究进展的基础上，探究安息香酸类天然产物分子探针的设计思路。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何制备安息香酸类天然产物分子探针。为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：一种安息香酸类分子探针，具有如下式(1)或式(2)的结构：式(1)：式(2)：本发明提供的所述的安息香酸类分子探针在生物活性的检测与生物靶点鉴定中的应用。本发明还提供制备所述的安息香酸类分子探针的方法，式(1)结构的安息香酸类分子探针的制备方法包括以下步骤：将安息香-18、丁炔胺盐酸盐按当量比1：1.8-2.5反应，加入1.8-2.5当量hatu、2-3当量diea，在溶剂的存在下搅拌反应8-24小时；反应完全后，除去溶剂得粗产物；对粗产物纯化，收集目标产物。其进一步地技术方案为，制备所述的安息香酸类分子探针的方法中，采用tlc或lc-ms检测反应进程，确认反应体系中不存在安息香-18，即表示反应完全。其进一步地技术方案为，制备所述的安息香酸类分子探针的方法中，反应完全后，将反应液用液氮冷冻，用冷冻干燥机除去溶剂。其进一步地技术方案为，制备所述的安息香酸类分子探针的方法中，所述溶剂为dmf。本发明还提供制备所述的安息香酸类分子探针的方法，式(2)结构的安息香酸类分子探针的制备方法包括以下步骤：将安息香-18、氨基生物素按当量比1：1.8-2.5反应，加入1.8-2.5当量hatu、2-3当量diea，在溶剂的存在下搅拌反应8-24小时；反应完全后，除去溶剂得粗产物；对粗产物纯化，收集目标产物。其进一步地技术方案为，制备所述的安息香酸类分子探针的方法中，采用tlc或lc-ms检测反应进程，确认反应体系中不存在安息香-18，即表示反应完全。其进一步地技术方案为，制备所述的安息香酸类分子探针的方法中，反应完全后，将反应液用液氮冷冻，用冷冻干燥机除去溶剂。其进一步地技术方案为，制备所述的安息香酸类分子探针的方法中，所述溶剂为dmf。与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：本发明提供的两种结构的安息香酸类分子探针：式(1)结构为炔基探针szu068、式(2)结构为生物素探针szu069。这两种探针对于广大拥有潜在药用价值尚未被发掘出来的安息香酸类中药天然产物，对它们的作用靶点进行鉴定非常关键。随着生物信息学、网络药理学、化学蛋白质组学等新兴学科和技术的交叉融合与不断完善,将会有更多、更新的药物靶标鉴定新方法、新技术出现，关于中药活性成分靶标蛋白质鉴定新型天然产物分子探针的报道也会越来越多，将持续推动中药现代化的研究向更高的层次迈进。对于天然产物分子的探针的设计与合成而言，本发明提供的两种结构的安息香酸类分子探针为鉴别安息香酸类中药天然产物分子的作用靶点及其找出其作用机制提供了较为有力的援助，对了解这些信号传导途径并去确定未来的直接结合靶标将非常有意义。本发明提供的制备两种结构的安息香酸类分子探针的方法，利用安息香酸类天然产物提取物axx-18为基本原料，成功制备出了上述两种结构的安息香酸类分子探针，使用薄层色谱分析法(tlc)监测反应的进行，得到粗产物后，进行液相色谱-质谱联用以(lc-ms)检测粗产物中的预期产物，得到其预期质谱峰和液相峰。然后对粗产物进行分离纯化，再采用高效液相色谱(hplc)对目标产物提取分离。然后利用核磁共振检测nmr以测定其结构，结果与预期合成目标产物一致，可用于后续生物活性的检测与生物靶点鉴定工作。附图说明图1为本发明实施例1提供的制备式(1)结构的安息香酸类分子探针的方法中，反应过夜后的tlc检测结果图；图2为本发明实施例1提供的制备式(1)结构的安息香酸类分子探针的方法中，对粗产物进行hplc检测的结果图；图3为本发明实施例1提供的制备式(1)结构的安息香酸类分子探针的方法中，对hplc分离得到的主峰馏分进行esi-ms的检测结果；图4为本发明实施例1提供的制备式(1)结构的安息香酸类分子探针的方法中，对产物进行1h-nmr检测的检测结果；图5为本发明实施例1提供的制备式(1)结构的安息香酸类分子探针的方法中，对产物进行13c-nmr检测的检测结果；图6为本发明实施例2提供的制备式(1)结构的安息香酸类分子探针的方法中，对粗产物进行hplc检测的结果图；图7为本发明实施例2提供的制备式(1)结构的安息香酸类分子探针的方法中，对hplc分离得到的主峰馏分进行esi-ms的检测结果；图8为本发明实施例2提供的制备式(1)结构的安息香酸类分子探针的方法中，对产物进行1h-nmr检测的检测结果；图9为本发明实施例2提供的制备式(1)结构的安息香酸类分子探针的方法中，对产物进行13c-nmr检测的检测结果。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。hatu：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐。diea：n,n-二异丙基乙胺。dmf：二甲基甲酰胺。tlc：薄层色谱(thinlayerchromatography)，又称薄层层析。hplc：高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography\hplc)。lc-ms：液相色谱质谱联用。实施例1本发明实施例1提供一种安息香酸类分子探针，具有如下式(1)结构：式(1)：本发明实施例1还提供制备式(1)结构的安息香酸类分子探针的方法，其中，式(1)结构的安息香酸类分子探针(炔基探针szu068)的合成路线如下：本实施例1制备式(1)结构的安息香酸类分子探针(炔基探针szu068)的各原料所需要的量(见表1)。表1.制备szu068所用的投料数据制备方法：用万分之一天平称量安息香-1814.12mg，hatu25.09mg，3-丁炔-1-胺盐酸盐6.334mg，将其混合至反应容器中。用1000μl移液枪吸取1000μldmf转移到容器，先投入搅拌磁子并设置转速为400rpm将容器小瓶置于磁力搅拌器上，再使用20μl移液枪吸取12.40μldiea(n,n-二异丙基乙胺)最后加入反应液中，拧紧瓶盖待其自行反应。3h以及过夜后分别进行tlc检测反应进行情况rf＝0.40，结果如图1所示。确认反应液中不存在原料后，反应液用液氮冷冻后用冷冻干燥机除去溶剂得到粗产物，经过hplc分离纯化得到若干峰，其中在11min位置的主峰的馏分经过lc-ms检测，结果如图2和图3所示，其电喷雾质谱(esi-ms)分子离子峰的荷质比(m/z)为522.2[m+h]+，与目标产物的分子量521.79(c34h51no3)结果一致。故将此处馏分收集并合并，用旋转蒸发仪旋蒸30min完成后，得到黄褐色油状物8.9mg。之后用氘代氯仿将该物质溶解于核磁管中利用核磁共振谱1h-nmr与13c-nmr检测其化合物结构，结果如图4和图5所示。图4的1h-nmr数据如下：1hnmr(500mhz,cdcl3)δ6.28(t,j＝5.8hz,1h),3.58(dq,j＝12.6,6.1hz,1h),3.19(ddt,j＝13.0,7.8,5.7hz,1h),2.78(ddd,j＝15.2,13.8,6.4hz,1h),2.59(d,j＝10.1hz,1h),2.39(dtd,j＝8.5,6.0,2.7hz,2h),2.27(ddd,j＝15.2,4.9,2.7hz,1h),2.13(ddd,j＝18.3,11.5,3.1hz,1h),2.07–1.94(m,3h),1.90(ddd,j＝13.2,6.5,2.8hz,1h),1.83–1.53(m,9h),1.50(dd,j＝14.7,2.7hz,4h),1.42(s,3h),1.34(qd,j＝14.1,5.0hz,2h),1.27–1.10(m,11h),1.09–1.01(m,1h),0.92(d,j＝5.1hz,5h).图5的13c-nmr数据如下：13cnmr(126mhz,cdcl3)δ216.53,178.24,143.83,123.03,81.73,77.22,70.01,69.08,56.58,48.81,47.30,46.62,46.49,42.72,42.31,41.61,40.43,38.71,37.75,36.38,34.37,34.12,32.97,32.56,30.74,27.31,25.73,23.93,23.71,23.60,23.52,19.21,18.53,16.41.实施例2本发明实施例2提供一种安息香酸类分子探针，具有如下式(2)结构：式(2)：本发明实施例2还提供制备所述的安息香酸类分子探针的方法，其中，式(2)结构的安息香酸类分子探针(生物素探针szu069)的合成路线如下：本实施例制备式(2)结构的安息香酸类分子探针(生物素探针szu069)的各原料所需要的量(见表2)。表2.反应szu069所用的投料数据投料信息分子量mw投料比/eqn/mmolm/mg安息香-18470.6910.0314.10hatu380.242.20.06625.10biotin-nh2(氨基生物素)418.5520.0625.0diea129.252.50.0759.70dmf(溶剂)1ml制备方法如下：用万分之一天平称量安息香-1814.10mg，hatu25.10mg，和原料化合物氨基生物素，将其混合至反应容器中。用1000μl移液枪吸取1000μldmf转移到容器，先投入搅拌磁子并设置转速为400rpm将容器小瓶置于磁力搅拌器上，再使用20μl移液枪吸取12.40μldiea最后加入反应液中，拧紧瓶盖待其自行反应。3h以及过夜后分别进行lc-ms检测反应进行情况。确认反应液中不存在原料后，反应液用液氮冷冻后用冷冻干燥机除去溶剂得到粗产物，经过hplc分离纯化得到若干峰，其中14min位置的主峰的馏分经过lc-ms检测，其电喷雾质谱(esi-ms)分子离子峰的荷质比(m/z)为871.6[m]+，与目标产物的分子量871.23(c48h78n4o8s)结果一致，如图6和图7所示。故将此处馏分收集并合并，冷冻干燥过夜后，称重得到黄褐色固体9.7mg，产率37.1％。之后用氘代氯仿溶解于核磁管中利用核磁共振谱1h-nmr与13c-nmr鉴定其化合物结构，见图8和图9。图8的1h-nmr数据如下：1hnmr(500mhz,cdcl3)δ6.73(s,1h),6.34(s,1h),6.14(d,j＝19.4hz,1h),5.28(s,1h),4.56–4.42(m,2h),4.40–4.28(m,1h),3.69–3.60(m,7h),3.60–3.39(m,6h),3.16(td,j＝7.2,4.4hz,1h),2.92(dd,j＝12.9,4.9hz,1h),2.84–2.69(m,2h),2.25(ddt,j＝14.5,7.1,3.1hz,3h),2.19–2.06(m,1h),2.06–1.80(m,15h),1.80–1.53(m,11h),1.47–1.38(m,4h),1.33(qd,j＝13.3,4.7hz,2h),1.23–1.10(m,10h),1.04(d,j＝13.1hz,1h),0.91(d,j＝3.6hz,6h).图9的13c-nmr数据如下：13cnmr(126mhz,cdcl3)δ143.93,122.77,77.22,70.49,70.42,70.18,70.05,70.00,69.79,68.80,61.85,60.21,56.61,55.37,8.85,47.28,46.57,46.39,42.67,42.09,41.62,40.51,40.26,39.27,39.18,38.69,36.42,35.81,34.38,34.14,33.00,32.75,30.74,28.08,28.02,27.32,25.76,25.71,25.51,23.91,23.63,23.59,18.45,16.44.需要说明的是，对于广大拥有潜在药用价值尚未被发掘出来的安息香酸类中药天然产物，对它们的作用靶点进行鉴定仍然是非常有必要的。随着生物信息学、网络药理学、化学蛋白质组学等新兴学科和技术的交叉融合与不断完善,将会有更多、更新的药物靶标鉴定新方法、新技术出现，关于中药活性成分靶标蛋白质鉴定新型天然产物分子探针的报道也会越来越多，将持续推动中药现代化的研究向更高的层次迈进。对于天然产物分子的探针的设计与合成而言，本发明提供的所述的安息香酸类分子探针为鉴别安息香酸类天然产物分子的作用靶点及其找出其作用机制提供了较为有力的援助，对了解这些信号传导途径并去确定未来的直接结合靶标将非常有意义，可用于后续生物活性的检测与生物靶点鉴定工作。在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。参考文献：[1]农产品天然产物研究与应用概况，福建农业科技，2018,10,18-23.[2]koehn,f.e.；carter,g.t.nat.rev.drugdiscov.2005,4,206.[3]caiy,luoq,sunm,etal.antioxidantactivityandphenoliccompoundsof112traditionalchinesemedicinalplantsassociatedwithanticancer.lifesci,2004,74:2157–2184.[4]schenone,m.；dancik,v.；wagner,b.k.；clemons,p.a.nat.chem.biol.2013,9,232.[5]徐悦,程杰飞.基于天然产物衍生优化的小分子药物研发.科学通报,2017,62:908–919.[6]evanswe,rellingmv.pharmacogenomics:translatingfunctionalgenomicsintorationaltherapeutics.science,1999,286:487–491.[7]kawatani,m.；osada,h.medchemcomm2014,5,277.[8]梁祖青,罗群,郑伟,等.生物质谱鉴定中药活性成分靶标蛋白质的研究进展.中国科学:生命科学,2018,48:140–150.[9]kawatani,m.；osada,h.medchemcomm2014,5,277.[10]kolb,h.c.；finn,m.g.；sharpless,k.b.angew.chem.int.ed.2001,40,2004.[11]周怡青,肖友利,活性天然产物靶标蛋白的鉴定.actachim.sinica2018,76,177—189.[12]谢巧,车静,廖莉,栗圣榕,胡攀,夏厚林.安息香属植物化学成分及药理作用研究进展.2020,48,1001-4454。当前第1页12