本发明属于基因工程和微生物
技术领域：
，具体涉及一种具有增强的l-赖氨酸生产能力的棒杆菌属的菌株及其构建方法与应用。
背景技术：
：l-赖氨酸具有促进发育、增强免疫力和提高中枢神经组织功能等生理功效，是人体和动物不能自身合成且生长必需的8种基本氨基酸之一。目前，l-赖氨酸是世界上的第二大氨基酸品种，主要生产方法是发酵法，其中谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)等是赖氨酸的重要生产菌株。l-赖氨酸工业产量的约90％用作饲料工业中的营养强化剂，10％用作食品工业中的鲜味剂和甜味剂，以及医药行业中的药物中间体。对发酵法生产l-赖氨酸的改进可以涉及发酵技术如搅拌和供应氧气；或涉及营养培养基的组成，例如发酵过程中的糖浓度；或涉及将发酵液加工成合适的产品形式，例如通过干燥和造粒发酵液或离子交换色谱；或可以涉及相关微生物本身的固有性能性质。用于改善这些微生物的性能性质的方法包括是诱变、突变体的选择和筛选。以这种方式获得的菌株对抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷型并产生l-赖氨酸。技术实现要素：本发明提供了生成l-赖氨酸的属于棒杆菌属的微生物，其中编码seqidno:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达改善。本发明还提供了通过使用所述微生物生产l-赖氨酸的方法。本发明的第一个方面提供了生成l-赖氨酸的属于棒杆菌属的微生物，其具有编码seqidno:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达。根据本发明，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码seqidno:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码seqidno:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。所述seqidno:3的氨基酸序列是基因ncgl1089编码的蛋白。所述微生物与野生型或亲本菌株相比具有增强的l-赖氨酸生产能力。所述多核苷酸可以编码与seqidno:3的氨基酸序列具有约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性的氨基酸序列。如本文中使用的，术语“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽模块之间的百分比同一性。可以通过使用本领域中已知的方法测定一种模块和另一种模块之间的序列同源性。例如，可以通过blast算法测定此类序列同源性。可以如下增强多核苷酸的表达：通过取代或突变表达调节序列、对多核苷酸序列引入突变、通过经由染色体插入或载体导入的多核苷酸拷贝数的增加、或其组合等。可以修饰多核苷酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核苷酸的表达，并且例如可以包括启动子、终止子、增强子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密码子的变化。可以将多核苷酸掺入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本文，特定的位点可以包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可以将多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。在本发明的一种实施方式中，通过将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本发明的一种实施方式中，通过将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而过表达所述核酸序列。在本发明的一种实施方式中，将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。在本发明的一种实施方式中，将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而过表达所述核酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，所述多核苷酸可以包含seqidno:1的核苷酸序列。在本发明的一种实施方式中，编码seqidno:3的氨基酸序列的多核苷酸的具有点突变，使得seqidno:3的氨基酸序列的第170位谷氨酸被不同的氨基酸所取代。根据本发明，优选第170位谷氨酸被赖氨酸所取代。根据本发明，seqidno:3所示的氨基酸序列，其中第170位谷氨酸(e)被赖氨酸(k)所取代后的氨基酸序列如seqidno:4所示。在本发明的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列是由seqidno:1所示多核苷酸序列第508位碱基发生突变而形成的。根据本发明，所述突变包括seqidno:1所示多核苷酸序列第508位碱基由鸟嘌呤(g)突变为腺嘌呤(a)。在本发明的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列包括seqidno:2所示的多核苷酸序列。如本文中使用的，术语“可操作连接”指调节序列和多核苷酸序列之间的功能性连接，由此调节序列控制多核苷酸序列的转录和/或翻译。调节序列可以是能提高多核苷酸的表达水平的强启动子。调节序列可以是源自属于棒杆菌属的微生物的启动子或者可以是源自其它微生物的启动子。例如，启动子可以是trc启动子、gap启动子、tac启动子、t7启动子、lac启动子、trp启动子、arabad启动子或cj7启动子。在本发明的一个具体实施方式中，所述启动子是编码seqidno:3的氨基酸序列的多核苷酸(ncgl1089基因)的启动子。如本文中使用的，术语“载体”指含有基因的调节序列和基因序列并且配置为在合适的宿主细胞中表达靶基因的多核苷酸构建体。或者，载体又可以指多核苷酸构建体，其含有可用于同源重组的序列，从而由于对宿主细胞导入的载体，可以改变宿主细胞的基因组中的内源基因的调节序列，或者可以将可以表达的靶基因插入宿主的基因组的特定位点中。在这点上，本发明中使用的载体可以进一步包含选择标志物以确定载体对宿主细胞的导入或者载体对宿主细胞的染色体的插入。选择标志物可以包含赋予可选择表型，诸如药物抗性、营养缺陷型、针对细胞毒剂的抗性、或表面蛋白的表达的标志物。在用此类选择剂处理的环境中，由于仅表达选择标志物的细胞可以存活或者显示不同表型性状，可以选择经转化的细胞。在本发明的一些具体实施方式中，使用的载体是pk18mobsacb质粒，pxmj19质粒。如本文中使用的，术语“转化”指将多核苷酸导入宿主细胞中，从而多核苷酸可以作为基因组外元件或者以插入宿主细胞的基因组中能复制。转化本发明中使用的载体的方法可以包括将核酸导入细胞的方法。另外，如相关技术中公开的，可以根据宿主细胞实施电脉冲方法。根据本发明，属于棒杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、黄色短杆菌(brevibacteriumflavum)、乳糖发酵短杆菌(brevibacteriumlactofermentum)、产氨棒杆菌(corynebacteriumammoniagenes)、北京棒杆菌(corynebacteriumpekinense)。在本发明的一个实施方案中，所述属于棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌yp97158，保藏编号：cgmccno.12856，保藏日期：2016年8月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话：010-64807355。根据本发明，所述微生物还可以具有与提高l-赖氨酸产量有关的其他改进，例如，与nadph生成相关的基因(例如编码葡萄糖脱氢酶的基因、编码葡糖酸激酶的基因、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因、或编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的基因)和/或与l-赖氨酸生物合成或分泌相关的其他基因(例如编码天冬氨酸氨基转移酶的基因、编码天冬氨酸激酶的基因、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因、编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因、编码间-二氨基庚二酸脱氢酶的基因、编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因，lyse)的增强或降低的表达，或者可以使基因被外来基因取代。本发明的第二个方面，提供一种多核苷酸序列，由该多核苷酸序列编码的氨基酸序列，包括所述多核苷酸序列的重组载体，含有所述多核苷酸序列的重组菌株。根据本发明，所述多核苷酸序列包括编码含有seqidno:3所示的氨基酸序列的多核苷酸，其中第170位谷氨酸被不同的氨基酸所取代。根据本发明，优选第170位谷氨酸被赖氨酸所取代。根据本发明，seqidno:3所示的氨基酸序列，其中第170位谷氨酸(e)被赖氨酸(k)所取代后的氨基酸序列如seqidno:4所示。根据本发明，优选所述编码含有seqidno:3所示的氨基酸序列的多核苷酸序列含有如seqidno:1所示的多核苷酸序列。在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸序列是由seqidno:1所示多核苷酸序列第508位碱基发生突变而形成的。根据本发明，所述突变是指所述位点的碱基/核苷酸发生变化，所述突变方法可以选自诱变、pcr定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。在本发明中，优选采用pcr定点突变法和/或同源重组。根据本发明，所述突变包括seqidno:1所示多核苷酸序列第508位碱基由鸟嘌呤(g)突变为腺嘌呤(a)。在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸序列包括seqidno:2所示的多核苷酸序列。根据本发明，所述氨基酸序列包括如seqidno:4所示的氨基酸序列。根据本发明，所述重组载体是将所述多核苷酸序列导入质粒构建而成。在本发明的一个实施方式中，所述质粒为pk18mobsacb质粒。在本发明的另一个实施方式中，所述质粒为pxmj19质粒。具体地，可以将所述多核苷酸序列和所述质粒通过nebuider重组系统构建成重组载体。根据本发明，所述重组菌株含有所述的多核苷酸序列。作为本发明的一个实施方案，所述重组菌株的出发菌为yp97158。本发明的第三个方面，还提供一种棒杆菌重组菌株的构建方法。根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：改造宿主菌株中如seqidno:1所示的野生型ncgl1089的多核苷酸序列，使其第508位碱基发生突变，得到包含突变ncgl1089编码基因的棒杆菌重组菌株。根据本发明的构建方法，所述改造包括诱变、pcr定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。根据本发明的构建方法，所述突变是指seqidno:1中第508位碱基由鸟嘌呤(g)突变为腺嘌呤(a)；具体地，所述包含突变ncgl1089编码基因的多核苷酸序列如seqidno:2所示。进一步地，所述构建方法包括如下步骤：(1)改造如seqidno:1所示的野生型ncgl1089基因的核苷酸序列，使其第508位碱基发生突变，得到突变的ncgl1089基因多核苷酸序列；(2)将所述突变的多核酸序列与质粒通过nebuider重组系统，构建重组载体；(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含突变ncgl1089编码基因的棒杆菌重组菌株。根据本发明的构建方法，所述步骤(1)包括：点突变的ncgl1089基因构建：根据谷氨酸棒杆菌的基因组序列，合成两对扩增ncgl1089基因片段的引物p1和p2及p3和p4，通过pcr定点突变法在野生型ncgl1089基因seqidno:1中引入点突变，得到点突变的ncgl1089基因核苷酸序列seqidno:2，记为ncgl1089g508a。在本发明的一个实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌基因组可以来源于atcc13032菌株，其基因组序列可以从ncbi网站获取。在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)中，所述引物为：p1:5'cagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagcgcgtgggatccacgccag3'(seqidno:5)p2:5'caatgagggctttcgccacctcgcgggc3'(seqidno:6)p3:5'gcccgcgaggtggcgaaagccctcattg3'(seqidno:7)p4:5'cagctatgaccatgattacgaattcgagctcggtaccccatgcgttggcgatcttc3'(seqidno:8)。在本发明的一个实施方案中，所述pcr扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸40s(30个循环)。在本发明的一个实施方案中，所述重叠pcr扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸90s(30个循环)。根据本发明的构建方法，所述步骤(2)包括重组质粒的构建，包括：将分离纯化后的ncgl1089g508a和pk18mobsacb质粒，通过nebuider重组系统组装，获得重组质粒pk18-ncgl1089g508a。根据本发明的构建方法，所述步骤(3)包括重组菌株的构建，将重组质粒pk18-ncgl1089g508a转化至宿主菌株，得到重组菌株。在本发明的一个实施方案中，所述步骤(3)的转化为电转化法。在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是yp97158。在本发明的一个实施方式中，所述重组是通过同源重组实现的。本发明的第四个方面，还提供一种棒杆菌重组菌株的构建方法。根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：扩增ncgl1089基因的上下游同源臂片段、ncgl1089基因编码区、ncgl1089g508a基因编码区、和所述基因的启动子区序列，以同源重组的方式在宿主菌株的基因组中引入ncgl1089或ncgl1089g508a基因，以实现所述菌株过表达ncgl1089或ncgl1089g508a基因。在本发明的一个实施方式中，扩增上游同源臂片段的引物是：p7：5'cagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaatgcgttctggactgagg3'(seqidno:11)p8：5'catgagtataaaatcactgtcgtgcaccgagaacagatg3'(seqidno:12)。在本发明的一个实施方式中，扩增下游同源臂片段的引物是：p13：5'cgtgcccacagaagaggtgagatggcgcaattaaatcaag3'(seqidno:17)p14：5'cagctatgaccatgattacgaattcgagctcggtacccgctatgacaccttcaacggatc3'(seqidno:18)在本发明的一个实施方式中，扩增所述基因的启动子区序列的引物是：p9：5'catctgttctcggtgcacgacagtgattttatactcatg3'(seqidno:13)p10：5'gacgtttccagatgctcatcaccgaacccgctgcactgt3'(seqidno:14)在本发明的一个实施方式中，扩增ncgl1089基因编码区或ncgl1089g508a基因编码区的引物是：p11：5'acagtgcagcgggttcggtgatgagcatctggaaacgtc3'(seqidno:15)p12：5'cttgatttaattgcgccatctcacctcttctgtgggcacg3'(seqidno:16)在本发明的一个实施方式中，以前述p9/p12为引物，以扩增得到的ncgl1089基因启动子片段和ncgl1089或ncgl1089g508a为模板，扩增获得带有自身启动子的ncgl1089或ncgl1089g508a片段。在本发明的一个实施方式中，以前述p7/p14为引物，以扩增获得的上游同源片段、下游同源片段和带有自身启动子的ncgl1089或ncgl1089g508a三个片段混合为模板进行扩增，获得整合同源臂片段。在本发明的一个实施方式中，所采用的pcr体系：10×extaqbuffer5μl，dntpmixture(各2.5mm)4μl，mg2+(25mm)4μl，引物(10pm)各2μl，extaq(5u/μl)0.25μl，总体积50μl；pcr扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。在本发明的一个实施方式中，采用nebuider重组系统，将穿梭质粒pk18mobsacb和整合同源臂片段组装，获得整合质粒。在本发明的一个实施方式中，将整合质粒转染宿主菌株，以同源重组的方式在宿主菌株的基因组中引入ncgl1089或ncgl1089g508a基因。在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是yp97158。在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是携带有seqidno:2所示多核苷酸序列的菌株。本发明的第五个方面，还提供一种棒杆菌重组菌株的构建方法。根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：扩增ncgl1089或ncgl1089g508a基因编码区及启动子区序列，构建过表达质粒载体，将所述载体转入宿主菌株中，以实现所述菌株过表达ncgl1089或ncgl1089g508a基因。在本发明的一个实施方式中，扩增ncgl1089启动子片段的引物是：p19：5'gcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgacagtgattttatactcatg3'(seqidno:23)p20：5'gacgtttccagatgctcatcaccgaacccgctgcactgt3'(seqidno:24)。在本发明的一个实施方式中，扩增获得ncgl1089或ncgl1089g508a基因片段的引物是：p21：5'acagtgcagcgggttcggtgatgagcatctggaaacgtc3'(seqidno:25)p22：5'atcaggctgaaaatcttctctcatccgccaaaactcacctcttctgtgggcacg3'(seqidno:26)。在本发明的一个实施方式中，以前述p19/p22为引物，以扩增得到的ncgl1089基因启动子片段和ncgl1089或ncgl1089g508a为模板，经重叠pcr扩增获得带有自身启动子的ncgl1089或ncgl1089g508a片段。在本发明的一个实施方式中，所述pcr体系：10×extaqbuffer5μl，dntpmixture(各2.5mm)4μl，mg2+(25mm)4μl，引物(10pm)各2μl，extaq(5u/μl)0.25μl，总体积50μl；所述pcr扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。在本发明的一个实施方式中，采用nebuider重组系统，将穿梭质粒pxmj19和带有自身启动子的ncgl1089或ncgl1089g508a片段组装，获得过表达质粒。在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是yp97158。在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是携带有seqidno:2所示多核苷酸序列的菌株。本发明获得重组菌株可以单独应用于发酵生产l-赖氨酸中，也可以和其他产l-赖氨酸的细菌混合发酵生产l-赖氨酸。本发明的另一个方面提供了生产l-赖氨酸的方法，该方法包括培养微生物；并且从培养物中获得l-赖氨酸。可以在本领域中已知的培养条件下在合适的培养基中进行微生物的培养。培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素、及其组合。在培养中，可以调节培养物的ph。此外，培养时可以包括防止气泡产生，例如通过使用消泡剂进行气泡产生的防止。此外，培养时可以包括将气体注射入培养物中。气体可以包括能够维持培养物的需氧条件的任何气体。在培养中，培养物的温度可以是20至45℃。可以从培养物回收生成的l-赖氨酸，即用硫酸或氢氯酸处理培养物，接着进行诸如阴离子交换层析、浓缩、结晶和等电点沉淀的方法的组合。在本发明中：seqidno:1：ncgl1089野生型orf序列atgagcatctggaaacgtctgttagtgcagtacccgcgcttcgccgacaccctcacagccggccaacccatcacgctcgaggaattagcaaccccggaagtgatcttggaagctgttgccaaaggccaagaaattttcggcattgagcagccaaaacatgcagcacaactctggtttcactccctgtgcaccgcaattgtcggccccgccgtcaccgccatggtggaattcgatgtcatccccagcctcgacatacgtcgaggtcagctgcataacatcgacggttactggttcggcttcaggccggaggagatgcttgtcgacgcctccctccacctgtcgggcacccaattcggcgagagtatccgcgtggtgattgatgcattatgcgctgccacggatctgcgaccggcacccctgtgggcggttgcctcagatgcgttgggaatcgcagctagcggcgcaggtgtcgaggcctttgaagaagaacatgcccgcgaggtggcggaagccctcattgaaggaatgaatagtgtgaactcagttccatcgccgcggtttaacgacgacgattatttcattcgagctggatgctgcatgattttccactcaccacgagctgatttttgcacgtcgtgcccacagaagaggtgaseqidno:2：ncgl1089g508aorf序列atgagcatctggaaacgtctgttagtgcagtacccgcgcttcgccgacaccctcacagccggccaacccatcacgctcgaggaattagcaaccccggaagtgatcttggaagctgttgccaaaggccaagaaattttcggcattgagcagccaaaacatgcagcacaactctggtttcactccctgtgcaccgcaattgtcggccccgccgtcaccgccatggtggaattcgatgtcatccccagcctcgacatacgtcgaggtcagctgcataacatcgacggttactggttcggcttcaggccggaggagatgcttgtcgacgcctccctccacctgtcgggcacccaattcggcgagagtatccgcgtggtgattgatgcattatgcgctgccacggatctgcgaccggcacccctgtgggcggttgcctcagatgcgttgggaatcgcagctagcggcgcaggtgtcgaggcctttgaagaagaacatgcccgcgaggtggcgaaagccctcattgaaggaatgaatagtgtgaactcagttccatcgccgcggtttaacgacgacgattatttcattcgagctggatgctgcatgattttccactcaccacgagctgatttttgcacgtcgtgcccacagaagaggtgaseqidno:3：ncgl1089野生型编码蛋白氨基酸序列msiwkrllvqyprfadtltagqpitleelatpevileavakgqeifgieqpkhaaqlwfhslctaivgpavtamvefdvipsldirrgqlhnidgywfgfrpeemlvdaslhlsgtqfgesirvvidalcaatdlrpaplwavasdalgiaasgagveafeeeharevaealiegmnsvnsvpsprfndddyfiragccmifhspradfctscpqkrseqidno:4：ncgl1089e170k编码蛋白氨基酸序列msiwkrllvqyprfadtltagqpitleelatpevileavakgqeifgieqpkhaaqlwfhslctaivgpavtamvefdvipsldirrgqlhnidgywfgfrpeemlvdaslhlsgtqfgesirvvidalcaatdlrpaplwavasdalgiaasgagveafeeeharevakaliegmnsvnsvpsprfndddyfiragccmifhspradfctscpqkr有益效果本发明通过对ncgl1089基因的弱化或敲除，发现该基因编码的产物对l-赖氨酸生产能力产生影响，通过在编码序列引入点突变，或者增加该基因的拷贝数或过表达获得重组菌株，所获得的菌株与未改造的菌株相比，有利于生产高浓度的l-赖氨酸。具体实施方式下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备；所进行的操作都是本领域已知的，或者按照市售商品的用户手册进行。以下实施例中培养所述菌株使用的基础培养基组成相同，在此基础培养基组成上添加相应需要的蔗糖、卡那霉素或氯霉素等，基础培养基组成如下：成分配方蔗糖10g/l多聚蛋白胨10g/l牛肉膏10g/l酵母粉5g/l尿素2g/l氯化钠2.5g/l琼脂粉20g/lph7.0培养温度32度实施例1构建包含点突变的ncgl1089基因编码区的转化载体pk18-ncgl1089g508a依据ncbi公布的野生型谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组序列，设计并合成两对扩增ncgl1089基因编码区序列的引物，以等位基因置换的方式在菌株yp97158(保藏编号：cgmccno.12856，保藏日期：2016年8月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话：010-64807355，记载于中国专利申请cn106367432a(申请日2016年9月1日，公开日2017年2月1日)中)背景中的ncgl1089基因编码区(seqidno:1)中引入点突变，对应编码蛋白的氨基酸序列为seqidno:3，ncgl1089基因的核苷酸序列第508位g变为a(seqidno:2：ncgl1089g508a)，对应编码蛋白的氨基酸序列第170位谷氨酸变为赖氨酸(seqidno:4：ncgl1089e170k)。引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：p1:5'cagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagcgcgtgggatccacgccag3'(seqidno:5)p2:5'caatgagggctttcgccacctcgcgggc3'(seqidno:6)p3:5'gcccgcgaggtggcgaaagccctcattg3'(seqidno:7)p4:5'cagctatgaccatgattacgaattcgagctcggtaccccatgcgttggcgatcttc3'(seqidno:8)构建方法：以谷氨酸棒杆菌atcc13032为模板，分别以引物p1和p2，p3和p4，进行pcr扩增。pcr体系：10×extaqbuffer5μl，dntpmixture(各2.5mm)4μl，mg2+(25mm)4μl，引物(10pm)各2μl，extaq(5u/μl)0.25μl，总体积50μl。所述pcr扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸40s(30个循环)，72℃过度延伸10min，获得两条大小分别为724bp和839bp，含有ncgl1089基因编码区的dna片段(ncgl1089up和ncgl1089down)。将上述两条dna片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以上述两条dna片段为模板，以p1和p4为引物，通过重叠pcr扩增长约1535bp的片段。pcr体系：10×extaqbuffer5μl，dntpmixture(各2.5mm)4μl，mg2+(25mm)4μl，引物(10pm)各2μl，extaq(5u/μl)0.25μl，总体积50μl。所述pcr扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。此dna片段(ncgl1089g508a)导致yp97158ncgl1089基因编码区的第508位的鸟嘌呤(g)变为腺嘌呤(a)，最终导致编码蛋白的第170位氨基酸由谷氨酸(e)变为赖氨酸(k)。将pk18mobsacb质粒(购自addgene公司)用xbai酶切后，用琼脂糖凝胶电泳分离纯化线性化pk18mobsacb质粒和ncgl1089g508a，再通过nebuider重组系统组装，获得载体pk18-ncgl1089g508a，该质粒上含有卡那霉素抗性标记。并将载体pk18-ncgl1089g508a送测序公司测序鉴定，将含有正确点突变(g-a)的载体pk18-ncgl1089g508a保存备用。实施例2构建包含点突变的ncgl1089g508a的工程菌株构建方法：将等位替换质粒pk18-ncgl1089g508a通过电击转化入l-赖氨酸生产菌专利菌株yp97158中(其构建方法可参见wo2014121669a1；经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的ncgl1089基因编码区)，对培养产生的单菌落分别通过引物p1和通用引物m13r进行鉴定，能扩增出1542bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行pcr鉴定：p5:5'ggtgattgatgcattatgcgc3'(seqidno:9)p6:5'cctagcctttcacctcttctgt3'(seqidno:10)上述pcr扩增产物通过高温变性、冰浴后进行sscp电泳(以质粒pk18-ncgl1089g508a扩增片段为阳性对照，yp97158扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。以引物p5和p6再次通过pcr扩增等位替换成功的菌株目的片段，并连接到pmd19-t载体测序，通过序列比对碱基序列发生突变的序列验证菌株的等位替换成功，并被命名为ypl-4-017。sscp电泳page的制备及条件实施例3构建基因组上过表达ncgl1089或ncgl1089g508a基因的工程菌株依据ncbi公布的野生型谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组序列，设计并合成四对扩增上下游同源臂片段及ncgl1089基因编码区、ncgl1089g508a基因编码区、和所述基因启动子区序列的引物，以同源重组的方式在菌株yp97158中引入ncgl1089或ncgl1089g508a基因。引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：p7：5'cagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaatgcgttctggactgagg3'(seqidno:11)p8：5'catgagtataaaatcactgtcgtgcaccgagaacagatg3'(seqidno:12)p9：5'catctgttctcggtgcacgacagtgattttatactcatg3'(seqidno:13)p10：5'gacgtttccagatgctcatcaccgaacccgctgcactgt3'(seqidno:14)p11：5'acagtgcagcgggttcggtgatgagcatctggaaacgtc3'(seqidno:15)p12：5'cttgatttaattgcgccatctcacctcttctgtgggcacg3'(seqidno:16)p13：5'cgtgcccacagaagaggtgagatggcgcaattaaatcaag3'(seqidno:17)p14：5'cagctatgaccatgattacgaattcgagctcggtacccgctatgacaccttcaacggatc3'(seqidno:18)构建方法：以谷氨酸棒杆菌atcc13032为模板，分别以引物p7/p8，p9/p10，p13/p14进行pcr扩增，获得上游同源臂片段805bp，ncgl1089基因启动子片段318bp，及下游同源臂片段628bp；再分别以谷氨酸棒杆菌atcc13032和ypl-4-017菌为模板，以p11/p12为引物，pcr扩增获得ncgl1089或ncgl1089g508a基因片段694bp；然后以p9/p12为引物，以ncgl1089基因启动子片段和ncgl1089或ncgl1089g508a为模板，获得带有自身启动子的ncgl1089或ncgl1089g508a片段972bp；再以p7/p14为引物，以上同源片段、下同源片段和带有自身启动子的ncgl1089或ncgl1089g508a三个片段混合为模板进行扩增，获得整合同源臂片段。pcr反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式dna凝胶回收试剂盒(tiangen)进行回收所需要的2365bp的dna片段，采用nebuider重组系统与xbai酶切回收的穿梭质粒pk18mobsacb组装，获得整合质粒pk18mobsacb-ncgl1089或pk18mobsacb-ncgl1089g508a。质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。pcr体系：10×extaqbuffer5μl，dntpmixture(各2.5mm)4μl，mg2+(25mm)4μl，引物(10pm)各2μl，extaq(5u/μl)0.25μl，总体积50μl。所述pcr扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。将2个整合质粒分别电转化入l-赖氨酸生产菌专利菌株yp97158中，对培养产生的单菌落通过p15/p16引物进行pcr鉴定，pcr扩增出含有大小1332bp的片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。阳性菌株在15％蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用p17/p18引物进行pcr鉴定，扩增出大小为1187bp的菌为基因整合到yp97158基因组上的菌株，其分别被命名为ypl-4-018(不含点突变)和ypl-4-019(含有点突变)。p15:5'tccaaggaagatacacgcc3'(seqidno:19)p16:5'ctgcgattcccaacgcatct3'(seqidno:20)p17:5'gagcagccaaaacatgcagc3'(seqidno:21)p18:5'cgttggaatcttgcgttg3'(seqidno:22)实施例4构建质粒上过表达ncgl1089或ncgl1089g508a基因的工程菌株依据ncbi公布的野生型谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组序列，设计并合成两对扩增ncgl1089或ncgl1089g508a基因编码区及启动子区序列的引物，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：p19：5'gcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgacagtgattttatactcatg3'(seqidno:23)p20：5'gacgtttccagatgctcatcaccgaacccgctgcactgt3'(seqidno:24)p21：5'acagtgcagcgggttcggtgatgagcatctggaaacgtc3'(seqidno:25)p22：5'atcaggctgaaaatcttctctcatccgccaaaactcacctcttctgtgggcacg3'(seqidno:26)构建方法：以ypl-4-018为模板，以引物p19/p20pcr获得ncgl1089启动子片段378bp；再分别以野生型谷氨酸棒杆菌atcc13032和ypl-4-017为模板，以引物p21/p22pcr获得ncgl1089或ncgl1089g508a基因片段708bp；再以上述启动子和基因片段为模板，以引物p19/p22经重叠pcr，获得带有自身启动子的ncgl1089或ncgl1089g508a基因片段1066bp。对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式dna凝胶回收试剂盒进行回收所需要的1066bp的dna片段，采用nebuider重组系统与经ecori酶切回收的穿梭质粒pxmj19组装，获得过表达质粒pxmj19-ncgl1089或pxmj19-ncgl1089g508a。质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素筛选获得质粒转化到菌株中。pcr体系：10×extaqbuffer5μl，dntpmixture(各2.5mm)4μl，mg2+(25mm)4μl，引物(10pm)各2μl，extaq(5u/μl)0.25μl，总体积50μl。所述pcr扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。将pxmj19-ncgl1089或pxmj19-ncgl1089g508a分别电转化入l-赖氨酸生产菌专利菌株yp97158中，对培养产生的单菌落通过m13(-48)和p22引物进行pcr鉴定，pcr扩增出含有大小1104bp的片段的为转入菌株，其分别被命名为ypl-4-020(不含点突变)或ypl-4-021(含有点突变)。实施例5构建基因组上缺失ncgl1089基因的工程菌株根据ncbi公布的谷氨酸棒杆菌atcc13032的基因组序列，合成两对扩增ncgl1089基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海英俊公司合成)：p23：5'cagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagcaccgcattcccttcatgat3'(seqidno:27)p24：5'acgaatccgcgcctagccttttatctacttccaaaaaactgc3'(seqidno:28)p25：5'gcagttttttggaagtagataaaaggctaggcgcggattcgt3'(seqidno:29)p26：5'cagctatgaccatgattacgaattcgagctcggtaccccgagggaaaggatatcga3'(seqidno:30)以谷氨酸棒杆菌atcc13032为模板，分别以引物p23/p24及p25/p26进行pcr扩增，获得上游同源臂片段779bp及下游同源臂片段800bp，再用引物p23/p26进行重叠pcr，得到整个同源臂片段1539bp。pcr反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式dna凝胶回收试剂盒进行回收所需要的1539bp的dna片段，并通过nebuider重组系统与经xbai酶切回收的穿梭质粒pk18mobsacb质粒相连接，获得敲除质粒。该质粒上含有卡那霉素抗性标记。将敲除质粒电转化入赖氨酸生产专利菌株yp97158，对培养产生的单菌落分别通过如下引物(上海英俊公司合成)进行pcr鉴定：p27:5'caccgcattcccttcatgat3'(seqidno:31)p28:5'cgagggaaaggatatcga3'(seqidno:32)上述pcr扩增出大小1429bp及2401bp条带的菌株为阳性菌株，扩增出2401bp条带的菌株为原菌。阳性菌株在15％蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用p27/p28引物进行pcr鉴定，扩增出大小为1429bp条带的菌株为ncgl1089基因编码区被敲除的基因工程菌株，其被命名为ypl-4-022。实施例6l-赖氨酸发酵实验将实施例构建的菌株和原始菌株yp97158在blbio-5gc-4-h型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表1所示的培养基和表2所示的控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表3所示。表1发酵培养基配方成分配方淀粉水解糖30g/l硫酸铵12g/l硫酸镁0.87g/l糖蜜20g/l酸化玉米浆3ml/l磷酸0.4ml/l氯化钾0.53g/l消泡剂(2％泡敌)4ml/l硫酸亚铁120mg/l硫酸锰120mg/l烟酰胺42mg/l泛酸钙6.3mg/l维生素b16.3mg/l铜、锌盐溶液0.6g/l生物素0.88mg/l表1发酵控制工艺表2l-赖氨酸发酵实验结果菌株l-赖氨酸产量(g/100ml)od(660nm)yp9715818.837.5ypl-4-01719.137.3ypl-4-01819.337.6ypl-4-01919.537.8ypl-4-02019.437.2ypl-4-02119.836.5ypl-4-02218.037.7结果如表3所示，在谷氨酸棒杆菌中对ncgl1089基因过表达，或者对ncgl1089基因编码区进行点突变ncgl1089g508a及过表达，有助于l-赖氨酸产量的提高，而对基因进行弱化或敲除，不利于l-赖氨酸的积累。以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>宁夏伊品生物科技股份有限公司<120>一种产l-赖氨酸的重组菌株及其构建方法与应用<130>cpcn20410444<160>32<170>patentinversion3.5<210>1<211>654<212>dna<213>corynebacteriumglutamicum<400>1atgagcatctggaaacgtctgttagtgcagtacccgcgcttcgccgacaccctcacagcc60ggccaacccatcacgctcgaggaattagcaaccccggaagtgatcttggaagctgttgcc120aaaggccaagaaattttcggcattgagcagccaaaacatgcagcacaactctggtttcac180tccctgtgcaccgcaattgtcggccccgccgtcaccgccatggtggaattcgatgtcatc240cccagcctcgacatacgtcgaggtcagctgcataacatcgacggttactggttcggcttc300aggccggaggagatgcttgtcgacgcctccctccacctgtcgggcacccaattcggcgag360agtatccgcgtggtgattgatgcattatgcgctgccacggatctgcgaccggcacccctg420tgggcggttgcctcagatgcgttgggaatcgcagctagcggcgcaggtgtcgaggccttt480gaagaagaacatgcccgcgaggtggcggaagccctcattgaaggaatgaatagtgtgaac540tcagttccatcgccgcggtttaacgacgacgattatttcattcgagctggatgctgcatg600attttccactcaccacgagctgatttttgcacgtcgtgcccacagaagaggtga654<210>2<211>654<212>dna<213>artificialsequence<220><223>人工序列<400>2atgagcatctggaaacgtctgttagtgcagtacccgcgcttcgccgacaccctcacagcc60ggccaacccatcacgctcgaggaattagcaaccccggaagtgatcttggaagctgttgcc120aaaggccaagaaattttcggcattgagcagccaaaacatgcagcacaactctggtttcac180tccctgtgcaccgcaattgtcggccccgccgtcaccgccatggtggaattcgatgtcatc240cccagcctcgacatacgtcgaggtcagctgcataacatcgacggttactggttcggcttc300aggccggaggagatgcttgtcgacgcctccctccacctgtcgggcacccaattcggcgag360agtatccgcgtggtgattgatgcattatgcgctgccacggatctgcgaccggcacccctg420tgggcggttgcctcagatgcgttgggaatcgcagctagcggcgcaggtgtcgaggccttt480gaagaagaacatgcccgcgaggtggcgaaagccctcattgaaggaatgaatagtgtgaac540tcagttccatcgccgcggtttaacgacgacgattatttcattcgagctggatgctgcatg600attttccactcaccacgagctgatttttgcacgtcgtgcccacagaagaggtga654<210>3<211>217<212>prt<213>corynebacteriumglutamicum<400>3metseriletrplysargleuleuvalglntyrproargphealaasp151015thrleuthralaglyglnproilethrleuglugluleualathrpro202530gluvalileleuglualavalalalysglyglngluilepheglyile354045gluglnprolyshisalaalaglnleutrpphehisserleucysthr505560alailevalglyproalavalthralametvalglupheaspvalile65707580proserleuaspileargargglyglnleuhisasnileaspglytyr859095trppheglypheargprogluglumetleuvalaspalaserleuhis100105110leuserglythrglnpheglygluserileargvalvalileaspala115120125leucysalaalathraspleuargproalaproleutrpalavalala130135140seraspalaleuglyilealaalaserglyalaglyvalglualaphe145150155160gluglugluhisalaarggluvalalaglualaleuilegluglymet165170175asnservalasnservalproserproargpheasnaspaspasptyr180185190pheileargalaglycyscysmetilephehisserproargalaasp195200205phecysthrsercysproglnlysarg210215<210>4<211>217<212>prt<213>artificialsequence<220><223>人工序列<400>4metseriletrplysargleuleuvalglntyrproargphealaasp151015thrleuthralaglyglnproilethrleuglugluleualathrpro202530gluvalileleuglualavalalalysglyglngluilepheglyile354045gluglnprolyshisalaalaglnleutrpphehisserleucysthr505560alailevalglyproalavalthralametvalglupheaspvalile65707580proserleuaspileargargglyglnleuhisasnileaspglytyr859095trppheglypheargprogluglumetleuvalaspalaserleuhis100105110leuserglythrglnpheglygluserileargvalvalileaspala11512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