一株分离的拉乌尔菌及其在制备絮凝剂中的应用的制作方法

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株分离的拉乌尔菌及其在制备絮凝剂中的应用。

技术背景

在猪场废水的处理过程中絮凝剂起到了重要的作用。当前应用中的絮凝剂主要可分为三大类：无机絮凝剂、有机絮凝剂和生物絮凝剂。

无机高分子絮凝剂不仅包括传统的铝铁盐类物质，还包括诸如聚合氯化铝、聚合硫酸铝、聚合硫酸铁、活化硅酸等新型无机高分子聚合物。这类物质因絮凝活性稳定，价格低廉而得到广泛应用。但无机高分子絮凝剂在使用过程中不仅需要引入大量离子且铁盐类絮凝剂还具有一定的腐蚀性同时还会导致铁盐残留影响出水水质；至于铝盐类絮凝剂在广泛使用过程中不仅有导致老年痴呆的潜在影响，同时使用后的絮体如果选择还田处理还可能给植物造成严重的铝害，影响其对钙磷离子吸收导致植物减产。近年来尽管无机絮凝剂收到一定的争议，但不可否认其应用还是较为普遍的。

有机絮凝剂主要是是指聚丙烯酰胺及其衍生的产物。这类物质虽然得到了较为广泛的应用，但因为此类聚合物的单体物质大多具有较强的神经毒性和“三致”(致癌、致畸、致突变)效应。因此多数国家都对其适用范围和用量做了相对严格的规定，例如美国规定使用聚丙烯酰胺的最大允许浓度为1mg/d·m3，英国则不仅规定平均投加量不得超过0.5mg/d·m3，同样还有最大投加量不得超过1mg/d·m3。这类有机絮凝剂作为化工产品不仅高价同时效果发挥也不够稳定，因此其生产与使用均受到了一定的限制。

生物絮凝剂则是指由微生物产生的具有絮凝活性的高分子代谢物。其成分主要有蛋白、多糖、糖蛋白、纤维素、几丁质等。生物絮凝剂具有安全高效无二次污染的特点，因此也逐渐成为研究的热点。现阶段生物絮凝剂还有效果不够稳定，单一使用效果不够理想的特点，因此筛选优质的生物絮凝剂的生产菌也是重要的研究方向。

拉乌尔菌属为肠杆菌科，革兰氏阴性好氧菌，兼性厌氧，运动性差。曾经属于克雷伯菌属，2001年该菌属从克雷伯菌属分出成为独立菌属拉乌尔菌属。目前该菌属下有四种菌：raoultellaelectrica(该菌种未查到正式中文译名)、解鸟氨酸拉乌尔菌、植生拉乌尔菌、土生拉乌尔菌。拉乌尔菌功能多样，王鸿等人使用拉乌尔菌pan22x为发酵菌种可以用于抗菌物质生产；土生拉乌尔菌y20可以用于乳糖氧化酶的生产；拉乌尔菌sari01具有较好的异养硝化好氧反硝化功能；拉乌尔菌ht15-8的次级代谢产物具有良好的抗癌活性。

武香玉等人曾经分离到具有一定絮凝活性的解鸟氨酸拉乌尔菌。本发明所分离到的拉乌尔菌属在絮凝活性上面明显高于该研究中的拉乌尔菌。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株能够产生生物絮凝剂的拉乌尔菌，该细菌的保藏编号为cctccno：m2020219。该菌株具有产生生物絮凝剂发挥絮凝活性的能力。

本发明的另一个目的在于提供了拉乌尔菌a1在污水处理中的应用，在给定培养条件下经过48-72小时发酵后，将菌液或离心后上清液投加至猪场废水中作为猪场废水的絮凝剂进行预处理或尾水处理，能够有效的降低水中的污染物浓度，减少后续工艺负荷保证出水水质的稳定。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

具有絮凝作用的拉乌尔菌的获得：

(1)样品采集与预处理

取华中农业大学精品猪场兼性塘塘泥、实验鱼塘塘泥、试验田土壤各20g，加入到250ml锥形瓶中，进行原始样品的采集与预处理。

(2)菌种的富集

使用富集培养基针对上一步获得的样品处理液进行菌群的富集培养，整个过程循环进行2-3轮以保证有足够大的菌群供后续步骤进行筛选。

(3)菌种的初次筛选

以富集后菌液为种子液利用初筛培养基进行培养并测定发酵液絮凝活性。挑选出其中絮凝活性较好的样品至固体富集培养基平板划线分离，选出其中较大或长势较好菌落。

(4)菌种的二次筛选

将上一步获得的较大较好菌落利用絮凝培养基进行发酵培养，分别利用高岭土絮凝法测定不同菌落的絮凝活性。挑选出其中絮凝活性好的菌落发酵液多次划线分离获得纯化菌株。

通过综合比较絮凝菌的菌落形态，生长状态以及发酵液的絮凝效果，最终从17株样品中筛选出一株絮凝剂生产菌，其16srdna序列为seqidno.1所示，该菌株已于2020年6月18日送至中国典型培养物保藏，分类命名：raoultellasp.a1，保藏编号：cctccno：m2020219,地址：中国武汉武汉大学。

所述的raoultellasp.a1的发酵培养基为：葡萄糖15-25g、k2hpo43-6g、kh2po41-3g、尿素0.5-3g、氯化钠0.05-0.2g、酵母浸粉0.3-0.6g、mgso4·7h2o0.1-0.3g、蒸馏水定容至1l，ph6.0-7.0。

拉乌尔菌a1为革兰氏阴性菌，呈现短杆状有芽孢，菌落颜色为乳白色、不透明状且明显观察到随着生长的进行会在菌落周围分泌大量粘液。

拉乌尔菌a1在污水处理中的应用，包括利用该菌株发酵液或发酵上清液制备成污水处理剂，或是制备成絮凝剂。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明筛选出具有较好的生物絮凝剂生产性能的的菌种，为生物絮凝剂的生产提供了优质的种子菌株。此方法生产的絮凝剂效果好，针对猪场废水进行了一定的优化筛选，为猪场废水的絮凝处理提供了有效絮凝剂来源。

附图说明

图1为本发明拉乌尔菌a1的菌落形态及革兰氏染色后的示意图；

其中a为拉乌尔菌a1的菌落形态；b为拉乌尔菌a1革兰氏染色后的形态。

图2为拉乌尔菌a1的生长情况与絮凝能力的关系图。

图3为不同的氮源和碳源对于拉乌尔菌a1的絮凝能力影响。

图4为ph和温度对于拉乌尔菌a1的絮凝能力影响。

图5为絮凝体系条件对絮凝效果的影响。

图6为拉乌尔菌a1发酵液的不同处理方式对于絮凝能力的影响。

具体实施方式

本发明技术方案中，所述试剂，如未特别说明，均购自生化商店，所述技术方案如未特别说明，均为本领域的常规技术。

实施例1：

拉乌尔菌a1的分离纯化与鉴定

1.样品采集与预处理

取华中农业大学精品猪场兼性塘塘泥、实验鱼塘塘泥、试验田土壤各20g，加入到250ml锥形瓶中，加入100ml生理盐水，封口摇床震荡30min，静置分层后收集上清液。

2.菌种的富集

在100ml富集培养基中，加入上清液5ml，封口震荡培养(30℃、160r/min)24h以上。吸取5ml培养液作为种子液，与100ml富集培养基混合后封口再次震荡培养(30℃、160r/min)24h以上，取5ml培养后菌液与100ml富集培养基混合重复进行震荡培养。此过程重复2-3次。

所用富集培养基配方如下：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水定容至1l，调节ph7.0-7.2。

3.菌种的初次筛选

取5ml菌液与100ml液体初筛培养基混合后，封口震荡培养(30℃、160r/min)72h以上。利用kurane等人的高岭土絮凝法(kuraneetal.1986)分别测定不同菌液的絮凝活性。挑选出其中絮凝活性较好的样品，吸取0.5ml发酵液与4.5ml生理盐水混合制成稀释菌液。重复上述操作分别制成稀释倍数为10^-1、10^-2、10^-3的稀释发酵液。各取200μl的稀释发酵液涂至固体富集培养基平板，恒温培养24小时以上直至长出较大菌落。

初筛培养基配方如下：葡萄糖10g、k2hpo45g、kh2po42g、尿素0.5g、氯化钠0.1g、酵母浸粉0.5g、mgso4·7h2o0.2g、蒸馏水定容至1l，调整ph7.0-8.0。

4.菌种的二次筛选

将初次筛选中选出的较大菌落投入液体絮凝培养基中，封口震荡培养72h以上，利用高岭土絮凝法测定不同菌落的絮凝活性。挑选出其中絮凝活性好的菌落发酵液，重复进行稀释平板分离直至再次获得单菌菌落。用接种环挑取长势较好菌落在固体富集培养基上多次划线分离获得若干种菌株。

所述的液体絮凝培养基配方如下：葡萄糖20g、k2hpo45g、kh2po42g、尿素1.5g、氯化钠0.1g、酵母浸粉0.5g、mgso4·7h2o0.2g、蒸馏水定容至1l，ph7.0-8.0。

5.絮凝菌株纯化鉴定

将分离到的菌株通过多次划线分离获得纯种单菌落后，观察菌落形态进行生化鉴定，同时提取其基因组dna对其16srdna进行测序比对分析，本发明所述菌株的的序列为seqidno.1所示，经比对后，其与raoultellaornithinolyticaatcc31898和raoultellaplanticolaatcc33531的相似度为100％，与其他拉乌尔菌的相似度达到了99％以上，综合各项鉴定分析该菌为拉乌尔菌属；

拉乌尔菌a1为革兰氏阴性菌，呈现短杆状有芽孢，菌落颜色为乳白色、不透明状且明显观察到随着生长的进行会在菌落周围分泌大量粘液(图1)。

其生化鉴定结果如下表所示：

+：阳性，-：阴性

该菌株已于2020年6月18日送至中国典型培养物保藏，分类命名：raoultellasp.a1，保藏编号：cctccno：m2020219，地址：中国，武汉，武汉大学。

实施例2：

拉乌尔菌a1的发酵条件探索：

1.拉乌尔菌a1生长状况与絮凝强弱关系

使用液体絮凝培养基制成该菌的培养种子液，种子液是100ml液体絮凝培养基接种单菌落后经过60h，32℃、160r/min，培养获得。将种子液按照体积比(v/v)5％比例接种至液体絮凝培养基中，每4h进行一次采样测定菌液od600和菌液的絮凝率。实验总计进行72h，将所得到的数据以培养时间为横坐标，以od600与发酵液絮凝率为纵坐标制成的生长-絮凝的曲线图(图2)。可以发现该菌作为生物絮凝剂生产菌时最佳发酵时间应控制在28-36h。

注：絮凝率的检测方法即为实施例1中的高岭土絮凝法，本申请中的絮凝率测试方法如未特别说明，均采取的是高岭土絮凝法。本发明实施例5中则是采取其他指标来侧面展示本发明菌株在实际应用中的絮凝效果。

2.拉乌尔菌a1最佳碳源氮源选择试验

基于液体絮凝培养基通过选择试验选择该菌最佳的碳源氮源种类。通过对不同试验条件下发酵液的絮凝性进行测试来对受试的碳源和氮源种类进行判断。受试的碳源有葡萄糖、蔗糖、淀粉三种；待测氮源有尿素、硫酸铵和硝酸钾三种。所有试验接种量为种子液体积比(v/v)5％,培养条件均为32℃、160r/min，检测时间为培养后48h。具体实验结果见下表与图3。从试验结果中可以发现该菌的最佳碳源和氮源分别为葡萄糖和尿素，最佳浓度分别为葡萄糖20g/l，尿素1.5g/l。

碳源选择实验的培养基为：

待测碳源20g、k2hpo45g、kh2po42g、尿素1.5g、氯化钠0.1g、酵母浸粉0.5g、mgso4·7h2o0.2g、蒸馏水定容至1l，ph7.0-8.0。

氮源选择实验的培养基为：

尿素培养基：葡萄糖20g、k2hpo45g、kh2po42g、尿素1.5g、氯化钠0.1g、酵母浸粉0.5g、mgso4·7h2o0.2g、蒸馏水定容至1l，ph7.0-8.0；

硫酸铵培养基：葡萄糖20g、k2hpo45g、kh2po42g、硫酸铵3.4g、氯化钠0.1g、酵母浸粉0.5g、mgso4·7h2o0.2g、蒸馏水定容至1l，ph7.0-8.0；

硝酸钾培养基：葡萄糖20g、k2hpo45g、kh2po42g、硝酸钾5.1g、氯化钠0.1g、酵母浸粉0.5g、mgso4·7h2o0.2g、蒸馏水定容至1l，ph7.0-8.0。

3.拉乌尔菌a1最佳发酵条件试验

在发酵生产中不仅是培养基的碳氮源会对发酵产生影响，发酵条件的控制也会影响到发酵的效果。本实施例选择探究ph值和发酵温度对发酵效果产生的影响。温度因素设置25、30、35、40四个试验组，；ph值设置6、7、8、9、10四个试验组。

所用的培养基为：葡萄糖20g、k2hpo45g、kh2po42g、尿素1.5g、氯化钠0.1g、酵母浸粉0.5g、mgso4·7h2o0.2g、蒸馏水定容至1l。

所有试验种子液接种量为体积比(v/v)5％，转速为160r/min，检测时间为培养后48h菌液，其他条件参考受试条件调整。

具体实验结果见下表与图4。试验结果表面，该菌在ph6-7，30℃的条件下能够有效的发酵产生絮凝活性物质。

实施例3：

拉乌尔菌a1作为絮凝剂使用时絮凝体系的条件优化：

在絮凝剂的实际使用过程中，影响絮凝效果的因素主要有絮凝体系的ph值、絮凝剂(即拉乌尔菌a1菌剂)的添加量和助凝剂的添加量。本实施例针对这三个变量设计了相应的单因素试验进行研究。

所用的培养基为：葡萄糖20g、k2hpo45g、kh2po42g、尿素1.5g、氯化钠0.1g、酵母浸粉0.5g、mgso4·7h2o0.2g、蒸馏水定容至1l。

所有试验种子液接种量为体积比(v/v)5％，转速为160r/min，培养温度为30℃，培养基ph为7，检测时间为培养后48h菌液。

具体实验结果见下表与图5。根据试验结果得知，絮凝体系控制在ph在8-10之间，絮凝剂添加量为体积比(v/v)2％，助凝剂只有在体积比(v/v)2.5％～4.5％之间表现出了良好的絮凝效果。

本实施例中使用的助凝剂为质量分数5％cacl2溶液。

实施例4：

拉乌尔菌a1絮凝活性物质的性质探索

本实施例中主要是针对在最佳絮凝条件下，探究絮凝活性物质的具体分布位置以及其热稳定性状况，为之后的絮凝剂生产应用奠定基础。

具体方法是首先将菌种接入到液体絮凝培养基中震荡培养(30℃，160r/min)48h，得到发酵液，将絮凝发酵液离心分离(4℃，11000r/min，10min)获得上清液和沉淀菌体。

所用液体絮凝培养基为：葡萄糖20g、k2hpo45g、kh2po42g、尿素1.5g、氯化钠0.1g、酵母浸粉0.5g、mgso4·7h2o0.2g、蒸馏水定容至1l，ph7。

调整絮凝体系的ph＝9，絮凝剂添加量为体积比(v/v)2％,助凝剂添加量体积比(v/v)为3.5％的条件，均匀混合后反应15min进行高岭土絮凝测定。测定上清液、沉淀菌体、原发酵液三者的絮凝活性。

之后将三者同时放入高压蒸汽灭菌锅中进行高温高压处理，条件为121℃，20min。将处理过后的上清液、沉淀菌体、原发酵液三者再次测定其絮凝活性强弱。最终试验结果见下表及图6.

可以看出上清液中含有大量的絮凝活性物质，同时此类物质对高温高压具有较强的抵抗性，不论处理前后，其絮凝效果变化不大。

实施例5：

拉乌尔菌a1在处理猪场废水中的应用

本实施例主要针对实际应用状况下该菌的絮凝能力测试。

使用液体絮凝培养基(同实施例4)在种子液接种量为体积比(v/v)5％，转速为160r/min，培养温度为30℃，培养基ph为7的条件下经过36h发酵后的发酵液作为絮凝剂，选择收集未经处理的粪尿冲栏水直接进行试验，絮凝条件为体系ph调整至8.5，絮凝剂添加量为体积比(v/v)2％,助凝剂体积比(v/v)3.5％，絮凝时间为30min。

经过处理后分别检测絮凝前后猪场废水当中cod、氨氮、总磷、tss四项指标，并参考高岭土测试中测试絮凝性的od550判断方法，对猪场废水絮凝前后中的od550进行测定并计算各样品相应的絮凝率。具体实验结果见下表。

从结果来看该菌对猪场废水具有较好的处理效果。同时生物絮凝剂对总磷的处理能力要明显优于针对氨氮的去除。针对tss，由于实效实验使用的冲栏水过高的浓度尽管从处理的实际量上来说效果较为显著，但是从处理的去除率来言还有一定优化提高的空间。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一株分离的拉乌尔菌及其在制备絮凝剂中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1403

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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