一种绒山羊毛乳头细胞的分离、鉴定方法与流程

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种绒山羊毛乳头细胞的分离、鉴定方法。

背景技术：

绒山羊毛乳头细胞(dermalpapilla,以下简称dp细胞)由中胚层来源的真皮间充质细胞分化而成，在绒山羊毛囊形态发生、周期性生长调控和维持毛囊生长发育中起重要作用。现有观点认为：dp细胞是毛囊生长发育过程中的“信号中心”，控制着由隆突区毛囊干细胞向毛母质细胞的分化过程，参与毛囊周期的调控。dp细胞的数量可能参与决定初级毛囊/次级毛囊的差异发育过程，进而决定毛囊的大小。同时，dp细胞分泌的多种细胞因子、生长因子，可通过异种移植的方法实现体外条件下诱导毛囊的重建过程，有助于分析其在毛囊发育生物学过程中的功能。

绒山羊毛囊周期调控是提高绒用山羊产能的重要课题，绒山羊dp细胞作为最具代表性的毛囊周期调控关键细胞之一，其鉴定、分离工作势在必行。随着绒山羊毛囊相关研究的深入，越来越多的研究表明，绒山羊毛囊细胞组成极为复杂，绒山羊毛囊的周期发育过程与小鼠模型存在明显差异，细胞间的互作更为繁琐。而作为最主要类型的dp细胞，其功能研究、介导的调控机制更是难以准确描述，这也阻碍了对绒山羊增绒增产的相关研究。

截止目前，在绒山羊dp细胞相关研究中，仍使用小鼠模型研究中发现的sox2⁺作为dp细胞的标记基因，而缺少针对绒山羊dp细胞的标记基因。但由于物种间存在差异，直接将小鼠模型研究中采用的sox2基因作为绒山羊dp细胞的标记基因，对dp细胞的鉴定效果并不理想。

因此，亟需提供一种新的绒山羊dp细胞的分离、鉴定方法，以为探究绒山羊毛囊周期调控，描绘绒山羊毛囊发育过程奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种绒山羊毛乳头细胞的鉴定、分离和培养方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种绒山羊毛乳头细胞的鉴定方法，使用apod⁺和/或hhip⁺作为毛乳头细胞的标记基因。

优选的，使用sox2⁺和/或fgf7⁺和/或apod⁺和/或hhip⁺作为毛乳头细胞的标记基因。

优选的，将待鉴定细胞经免疫荧光染色，判断标记基因转录蛋白的表达情况，能够表达所述标记基因的为所需绒山羊毛乳头细胞。

优选的，将所述待鉴定细胞分离出来的方法包括如下步骤：

(1)无菌分离绒山羊皮肤组织；

(2)联合使用机械分离法和酶消化法，从步骤(1)的皮肤组织上分离绒山羊完整毛乳头细胞所在区域，获得相互分离的毛乳头细胞；

(3)获得相互分离的毛乳头细胞后，进行贴壁组织培养，培养所得细胞即为待鉴定细胞。

优选的，步骤(1)所述皮肤组织的获得方法为：获取绒山羊肩胛部背侧皮肤组织，去除皮肤组织上残留的血渍和杂质，用含青霉素和链霉素的dmem/f12培养基刷洗皮肤组织，随后沿毛囊的生长方向将皮肤组织切为长条状。

优选的，步骤(2)所述分离绒山羊完整毛乳头细胞所在区域的方法为：将每条皮肤组织置入胶原酶中，于37℃恒温消化15min～1h，将初步消化的皮肤组织转置于胰酶溶液中继续消化15min～1h，消化至可通过体视镜观察到明显毛囊簇结构；

随后在体视镜下，将皮肤组织中的毛囊簇分离，为单根毛囊。

优选的，胶原酶的消化时长为30min；和/或；胰酶的消化时长为30min。

优选的，获得单根毛囊后，在体视镜下，使用注射器针头切下毛囊终端膨胀部分，通过挤压将梭形毛乳头细胞团分离出来。

优选的，步骤(3)所述培养的方法为：将毛乳头细胞团置于培养基中，于5％的co2培养箱中37℃恒温培养。

优选的，所述培养基为：10％fbs+dmem/f12+bfgf+egf。

本发明具有以下有益效果：本发明首次提出了一种可准确分离、鉴定绒山羊毛乳头细胞的方法。在分离上，本发明联合使用酶消化法和机械分离法共同获得细胞，并提供了一种可专用于培养绒山羊毛乳头细胞的培养基，以快速获得所需细胞。在鉴定上，本发明首次联合使用了几种新的标记基因，可快速、准确鉴定所需细胞。

附图说明

图1为标记基因(蛋白)在绒山羊毛囊中的表达情况；

图2为标记基因(蛋白)在绒山羊dp细胞中的表达情况。

具体实施方式

本发明提供了一种绒山羊dp细胞的体外分离、鉴定和培养的方法，具体包括如下步骤：

1、体外分离

(1)无菌分离绒山羊完整毛囊，分离操作方式为：获取绒山羊肩胛部背侧皮肤组织，利用眼科镊去除皮肤组织上残留的血渍和杂质，用含1％(v/v)青霉素和链霉素(质量比1:1)的dmem/f12培养基刷洗组织样品，以避免细胞污染。将刷洗后的皮肤组织用于分离毛囊，在分离毛囊过程中，使用手术刀沿着毛囊的生长方向切为厚度约为2～3mm长条，以提高后续皮肤组织与消化酶的接触面积，缩短消化时间。

(2)通过机械分离和酶消化相结合的方法，从步骤(1)处理后的皮肤组织上分离绒山羊完整毛乳头内部dp区域。

使用机械分离和酶消化法结合进行，有效降低了细胞分离难度，提高了获得的细胞纯度。具体分离的操作方案为：每条皮肤组织置入1ml胶原酶(mg/ml)中，于37℃恒温培养箱中消化15min～1h，优选消化时间为30min。随后移弃胶原酶，将初步消化的皮肤组织转置于0.25％(w/v)的胰酶溶液中继续消化15min～1h，优选的消化时间为30min。

经上两步消化后，可通过体视镜观察到明显毛囊(簇)结构。在体视镜下，使用眼科镊逐步将皮肤组织中的毛囊簇分离，并进一步分离为单根毛囊。由于真皮结构复杂，这样操作可提高分离毛囊的效率，同时减少不必要的细胞引入。

体视镜下，使用注射器针头切下毛囊终端膨胀部分即毛乳头区域，通过挤压便可将梭形毛乳头细胞团分离出来。再使用吸口管将毛乳头细胞团置于培养基中培养；培养基组分为：dmem/f12+10％(v/v)fbs++bfgf(20ng/ml)+egf(10ng/ml)。置于5％的co2培养箱中37℃恒温培养。在培养过程中，毛乳头细胞能较快从组织中分离，且生长状态较好。培养5～7d后，即可观测到毛乳头细胞逐渐从细胞团中分离。

(3)获得相互分离的毛乳头细胞后，再使用完全培养基进行贴壁组织培养。根据细胞差异贴壁性和不同的酶消化对其消化时间的差异性，分离纯化细胞。

所述完全培养基为：在dmem/f12培养基中加入10％(v/v)胎牛血清，10ng/ml表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,全文简称egf)、20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,全文简称bfgf)、1％(v/v)的青链霉素。

2、选择sox2⁺、fgf7⁺、apod⁺、hhip⁺共同作为标记基因。对获得的细胞分别进行鉴定，通过细胞免疫荧光选取sox2⁺/fgf7⁺/apod⁺/hhip⁺的细胞，即为所需的绒山羊dp细胞。

具体方法为：将步骤1分离出的细胞经过免疫荧光染色，判断标记基因转录蛋白的表达情况，能够表达sox2⁺/fgf7⁺/apod⁺/hhip⁺的细胞即确认为绒山羊dp细胞类型，该细胞呈纤维状，具有聚集生长的特性。

下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例

1、绒山羊dp细胞的分离：剪取绒山羊肩胛部背侧皮肤组织，使用含有1％(w/v)双抗(青霉素、链霉素)的pbs溶液反复冲洗皮肤组织，以去除表面污渍。之后置于含1％(w/v)青霉素和链霉素的dmem/f12培养基中，于冰上运输至超净工作环境。转入超净工作台后，用眼科镊去除皮肤组织上残留的血渍和杂质，并用含1％青霉素和链霉素的dmem/f12培养基刷洗组织样品。随后用手术刀将皮肤组织沿着毛囊的生长方向切为长条形，厚度约为2～3mm，再次用含1％(w/v)青霉素和链霉素的dmem/f12培养基冲洗组织。

将皮肤组织转入2mg/ml的胶原酶溶液中，于37℃恒温培养箱中消化消化，时间由15min至1h。通过观察，15min后，皮肤组织开始松软，但皮肤整体结构没有较大变化；30min时，皮肤下层结缔组织消化明显，质地粘稠，表皮真皮结构显现，可观察到单根毛囊；继续消化至1h时，毛囊结构不再明显，明显消化过度，无法区分毛囊结构。因此，本次实例中，选用30min作为胶原酶的消化时间。至皮肤组织变得松软后，再将组织转置于0.25％(w/v)的胰酶溶液中继续消化15min至1h。经观察，15min后皮肤组织没有明显变化；30min后，毛囊表皮与真皮层能够较好的区分出来，毛囊结构清晰可辨；而当消化时间延长至1h后，已经无法区分毛囊结构；故最终选取的胰蛋白酶消化时长为30min。取出组织块，用dmem/f12培养基清洗三次，将组织块转移到体视镜下，用钟表镊或眼科镊从皮肤组织分离完整毛囊(簇)。将分离得到的单个毛囊转移到1.5ml离心管中，用dmem/f12培养基吹洗3遍，低速离心，弃掉上清后将毛囊移置于含有10％(v/v)胎牛血清(fbs)的dmem/f12培养基中。

用注射器针头切下毛囊终端膨胀部分即毛乳头区域，在体式镜下用眼科镊挤压毛乳头区域，梭形毛乳头细胞团逐步从毛乳头区域分离。使用吸口管将毛乳头细胞团置入新培养皿中，分别置于不同的培养基中，设置为3组：组1、dmem/f12+10％fbs培养基；组2、dmem/f12+10％fbs+egf(10ng/ml)培养基；组3、dmem/f12+10％fbs+egf(10ng/ml)+bfgf(20ng/ml)培养基。各组培养条件均为37℃，5％co2。

经过观察，与组1相比，组2中egf的添加有助于毛乳头细胞从组织中迁移出来，细胞迁移时间与组1相比能够提高1天以上；且细胞结构更为清晰，细胞碎片较少。与组1、2相比，组3中的bfgf添加则能够明显的促进细胞的增殖，迁移出的细胞更为饱满。因此，选择组3的培养基为细胞培养培养基，细胞迁移时间在3天左右。待细胞生长至密度70％以上后，用胰蛋白酶消化细胞后加入等比例含有10％fbs的dmem/f12终止消化，吸取混合液，移液器吹打至细胞完全悬浮，获得单细胞悬液，并在显微镜下检查。

2、免疫荧光验证标记蛋白在分离细胞中的表达：将获得的单细胞悬液离心弃上清，然后加入4％的多聚甲醛于4℃固定30min。随后将细胞悬液用移液器滴到apes(3-aminopropyl-triethoxysilane)处理过的载玻片上，42℃烘干。用pbs漂洗3遍，再用含0.5％tritonx-100的pbs溶液(pbst)在室温下透化10min。用封闭液(10％，v/v即用型正常山羊血清的pbst溶液)进行封闭，室温封闭40min。封闭结束后，在片子上加入50μl一抗(既兔抗sox2/fgf7/apod/hhip多克隆抗体，根据一抗说明书，用含10％山羊血清的pbst将一抗稀释100倍后使用)，然后转入水平的湿盒中，4℃孵育过夜。次日，待片子恢复到室温，先将片子用含1％(v/v)牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,bsa)的pbs溶液漂洗3遍，加入50μl带有荧光标记(cy3，红色荧光标记；fitc，绿色荧光标记的)的兔免疫球蛋白抗体(根据说明书，用含1％bsapbs溶液稀释150倍后使用)，转入37℃孵育1h。孵育结束后，将片子取出，用pbs洗3遍，加入50μl核染料(dapi)染核3min，再加上10μl抗荧光衰减封片剂封片，避光保存于4℃。

荧光显微镜检测观察细胞荧光情况，蓝色标记(dapi染色)为细胞核位置，cy3为与目标蛋白fgf7⁺/apod/hhip免疫反应所带红色荧光，fitc标记的为与sox2发生免疫反应所带绿色荧光；同时表达了sox2⁺/fgf7⁺/apod⁺/hhip⁺的细胞即为所需的dp细胞。

标记基因(蛋白)在绒山羊毛囊中的表达情况如图1所示，图中所示结构为完整毛乳头区域，蓝色标记为细胞核位置，图1的第1列均为蓝色标记，标记形状如图中阴影形状所示，形成蓝色水滴状图案，水滴中心形成“蓝色核心”；红色或绿色荧光位置即为发生免疫反应的阳性区域，图1第2列第1排位绿色荧光，第2列其余排为红色荧光，标记形状如图中阴影形状所示；merge为蓝色标记与红色标记组合图。如图所示，sox2⁺/fgf7⁺/apod⁺/hhip⁺在毛乳头区域表达量较高，具有明显特异性，染色位置正确，清楚明显。而部分早期发现于小鼠上的dp细胞标记蛋白如sox18则并非在毛乳头区域特异性表达，佐证dp细胞的标记基因在物种间存在差异。图2所示的是免疫荧光显示为sox2⁺/fgf7⁺/apod⁺/hhip⁺在分离细胞中的表达情况，均呈现阳性表达，而sox18表达未检测到，再次证明了本专利中所选用的标记基因更为准确，所使用的sox2⁺/fgf7⁺/apod⁺/hhip⁺等标记试用于绒山羊的dp细胞的分离与鉴定。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。