检测膀胱及泌尿道上皮癌的尿液小RNA指纹图谱及其应用的制作方法

1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#, hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,hsa-mir-152,hsa-mir-100,hsa-mir-27b，和 hsa-mir-497。
[0008]
在另一方面，本申请提供了一种诊断待测个体是否患有膀胱及泌尿道上皮癌或者是否处于患膀胱及泌尿道上皮癌高风险的方法，包括：
[0009]
a)获得所述待测个体的待测尿液样本；
[0010]
b)测定所述待测尿液样本中本申请提供的mirna组合中的每个mirna的表达水平；和
[0011]
c)通过所述mirna的表达水平评估所述待测个体是否患有膀胱及泌尿道上皮癌或者是否处于患膀胱及泌尿道上皮癌的高风险。
[0012]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，至少11个，至少12 个，至少13个，至少14个，至少15个，或至少16个选自下组的mirna： hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b, hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#, hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,hsa-mir-152,hsa-mir-100,hsa-mir-27b，和 hsa-mir-497。
[0013]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，至少11个，至少12 个，至少13个，至少14个，或至少15个选自下组的mirna：hsa-mir-99a, hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183, hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#, hsa-mir-29c,hsa-mir-152,hsa-mir-100,和hsa-mir-27b。
[0014]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，至少11个，至少12 个，至少13个，或至少14个选自下组的mirna：hsa-mir-99a,hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260, hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c, hsa-mir-152,和hsa-mir-100。
[0015]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，至11个，至少12个，或至少13个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100),hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260, hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,和 hsa-mir-152。
[0016]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，至少11个，或至少 12个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100),hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260, hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,和hsa-mir-29c。
[0017]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，或至少11个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100),hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a, hsa-mir-429，hsa-mir-143#,和hsa-mir-29c#。
[0018]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至
少7个、至少8个、至少9个，或至少10个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100),hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，和 hsa-mir-143#。
[0019]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，或至少10个选自下组的mirna： hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141,hsa-mir-143#, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-29c#,hsa-mir-99a,和hsa-mir-96。
[0020]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、或至少9个选自下组的mirna：hsa-mir-99a (或者hsa-mir-100),hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b, hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,和hsa-mir-429。
[0021]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、或至少9个选自下组的mirna：hsa-mir-100, hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141,hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-29c,hsa-mir-99a，和hsa-mir-29c#。
[0022]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、或至少9个选自下组的mirna：hsa-mir-100, hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141,hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-29c,hsa-mir-99a,和hsa-mir-96。
[0023]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、或至少8个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者 hsa-mir-100),hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b, hsa-mir-183,hsa-mir-1260,和hsa-mir-133a。
[0024]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、或至少8个选自下组的mirna：hsa-mir-99a,hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-143#,hsa-mir-125b,hsa-mir-29c,hsa-mir-100,和 hsa-mir-133a。
[0025]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、或至少7个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100), hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,和 hsa-mir-1260。
[0026]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、或至少7个选自下组的mirna：hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-143#,hsa-mir-125b,hsa-mir-29c,hsa-mir-100(或者hsa-mir-99a),和 hsa-mir-133a。
[0027]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少以下7个mirna：hsa-mir-99a, hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p，hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-143#,和 hsa-mir-29c；或者包括以下7个mirna：has-mir-100,hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p，hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-143#,和hsa-mir-29c。
[0028]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少5个、或至少6个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100),hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,和hsa-mir-183。
[0029]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括至少3个、至少4个、或至少5 个选自下组
497，或者包括：hsa-mir-100,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260，hsa-mir-133a, hsa-mir-429,和hsa-mir-497；
[0061]
15)所述组合15包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429， hsa-mir-143#,和hsa-mir-29c，或者包括：hsa-mir-100,hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260, hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,和hsa-mir-29c；
[0062]
16)所述组合16包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-143#,和hsa-mir-29c#，或者 hsa-mir-100,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b, hsa-mir-133a,hsa-mir-143#,和hsa-mir-29c#；
[0063]
17)所述组合17包括：hsa-mir-99a，hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#, hsa-mir-29c#，或者包括hsa-mir-100，hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-133a,hsa-mir-429， hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#；
[0064]
18)所述组合18包括：hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141, hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-29c#,hsa-mir-99a,和 hsa-mir-96；和
[0065]
19)所述组合19包括：hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141, hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,和hsa-mir-99a；
[0066]
20)所述组合20包括：hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141, hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-99a，和hsa-mir-29c#；
[0067]
21)所述组合21包括hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141, hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-99a,和hsa-mir-96；和
[0068]
22)所述组合22包括：hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-143#, hsa-mir-125b,hsa-mir-29c,hsa-mir-100,和hsa-mir-133a，或者包括： hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-143#,hsa-mir-125b,hsa-mir-29c, hsa-mir-99a,和hsa-mir-133a。
[0069]
在某些实施方式中，所述mirna的表达水平是经內源对照校正的。
[0070]
在某些实施方式中，所述內源对照包括所述mirna组合中的一个或多个 mirna。
[0071]
在某些实施方式中，所述內源对照包括hsa-mir-99a或hsa-mir-100。
[0072]
在某些实施方式中，所述每个mirna的表达水平通过使用引物、探针或嵌入剂来测定，其中所述引物或探针具有杂交区，并且该杂交区能够与所述mirna 或所述mirna的互补序列杂交；所述嵌入剂能够在插入dna双链时产生信号。
[0073]
在某些实施方式中，所述杂交区与所述mirna或所述mirna的互补序列的核苷酸序列至少60％互补或基本互补。
[0074]
在某些实施方式中，在测定所述每个mirna的表达水平之前，进一步包括将所述每个mirna逆转录为cdna。
[0075]
在某些实施方式中，所述mirna的表达水平通过基于扩增的方法、基于杂交的方法、和/或基于测序的方法来测定。
[0076]
在某些实施方式中，在测定所述mirna的表达水平之前，进一步包括富集所述待测尿液样本中的rna。
[0077]
在某些实施方式中，所述富集包括从所述待测尿液样本中离心得到的沉淀中提取rna。
[0078]
在某些实施方式中，所述步骤c)进一步包括通过所述mirna的表达水平计算所述mirna组合的表达模式。
[0079]
在某些实施方式中，所述表达模式是通过与每个mirna的表达水平以及每个mirna对于样本状态的决策权重相关的函数或模型计算的，其中所述函数或模型是通过分类算法计算得到。
[0080]
在某些实施方式中，所述分类算法选自支持向量机(support vector machines)、线性判别分析(linear discriminant analysis)、逻辑回归(logistic regression)、朴素贝叶斯分类(bayes classification)、感知器分类(perceptron classification)、二次分类(quadratic classification)、k-近邻算法(k-nearest neighbors)、boosting 算法(boosting)、决策树(decision tree)、随机森林(random forest)、神经网络 (neural network)、和学习矢量量化(learning vector quantization)。
[0081]
在某些实施方式中，所述分类算法是支持向量机。
[0082]
在某些实施方式中，所述分类算法通过阳性训练数据集和阴性训练数据集中的至少一个的训练来获得用于计算所述表达模式的函数或模型的一个或多个决策权重，所述阳性训练数据集包括多个已知患有膀胱及泌尿道上皮癌的个体的尿液样本中所述mirna组合中的每个mirna的表达水平，所述阴性训练数据集包括多个已知未患有膀胱及泌尿道上皮癌的个体的尿液样本中所述mirna组合中的每个mirna的表达水平。
[0083]
在某些实施方式中，所述训练包括通过阳性训练数据集和阴性训练数据集的训练，来获得用于计算阳性表达模式的函数或模型的一个或多个决策权重，以及用于计算阴性表达模式的函数或模型的一个或多个决策权重。
[0084]
在某些实施方式中，所述表达模式为一个0到1之间的得分。
[0085]
在某些实施方式中，基于所述阳性表达模式的得分和所述阴性表达模式的得分确定一个阈值，所述阈值能够区分所述阳性表达模式和所述阴性表达模式。
[0086]
在某些实施方式中，进一步包括将所述待测尿液样本中所述mirna的表达水平计算得到的所述表达模式的得分与所述阈值比较，以评估所述待测个体是否患有膀胱及泌尿道上皮癌或者是否处于患膀胱及泌尿道上皮癌的高风险。
[0087]
在某些实施方式中，所述阈值为在0.2到0.8之间的一个数值，并且如果所述表达模式的得分大于所述阈值，则评估所述待测个体为患有膀胱及泌尿道上皮癌或者处于患膀胱及泌尿道上皮癌高风险。
[0088]
在某些实施方式中，所述阈值为0.4。
[0089]
在某些实施方式中，进一步包括在步骤c)评估所述待测个体为患有膀胱及泌尿道上皮癌或者处于患膀胱及泌尿道上皮癌高风险时，对所述待测个体施用膀胱及泌尿道上皮癌疗法。
[0090]
在某些实施方式中，所述膀胱及泌尿道上皮癌疗法包括化疗、放疗、免疫疗法、手术、或抗癌药物治疗。
[0091]
在某些实施方式中，所述膀胱及泌尿道上皮癌包括膀胱癌、肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌、和排尿管癌。
[0092]
在另一方面，本申请提供了一组分离的包含杂交区的寡核苷酸，其中每一个所述寡核苷酸中的所述杂交区能够与本身提供mirna组合中的对应的mirna 或所述对应mirna的互补序列杂交，所述mirna组合包括：
[0093]
1)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16个选自下组的mirna：hsa-mir-99a,hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260, hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c, hsa-mir-152,hsa-mir-100,hsa-mir-27b，和hsa-mir-497；
[0094]
2)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个选自下组的的mirna：hsa-mir-99a,hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260, hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c, hsa-mir-152,hsa-mir-100,和hsa-mir-27b；
[0095]
3)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个选自下组的的mirna：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a, hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,hsa-mir-152,和 hsa-mir-100；
[0096]
4)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个选自下组的mirna： hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100),hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a, hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,和hsa-mir-152；
[0097]
5)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，至少11个，至少12个选自下组的mirna：hsa-mir-99a (或者hsa-mir-100),hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429， hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,和hsa-mir-29c；
[0098]
6)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，至少11个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者 hsa-mir-100),hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b, hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#, 和hsa-mir-29c#；
[0099]
7)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100), hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183, hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，和hsa-mir-143#；
[0100]
8)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，或至少10个选自下组的mirna：hsa-mir-100,hsa-mir-125b, hsa-mir-133a,hsa-mir-141,hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c, hsa-mir-29c#,hsa-mir-99a,和hsa-mir-96；
[0101]
9)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100),hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260, hsa-mir-133a,和hsa-mir-429；
[0102]
10)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、或至少9个选自下组的mirna：hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a, hsa-mir-141,hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-99a，和hsa-mir-29c#；
[0103]
11)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、或至少9个选自下组的mirna：hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a, hsa-mir-141,hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-99a, 和hsa-mir-96；
[0104]
12)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100),hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260, 和hsa-mir-133a；
[0105]
13)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个选自下组的mirna：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-143#, hsa-mir-125b,hsa-mir-29c,hsa-mir-100,和hsa-mir-133a；
[0106]
14)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个选自下组的mirna： hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100),hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,和hsa-mir-1260；
[0107]
15)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、或至少7个选自下组的mirna： hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-143#,hsa-mir-125b,hsa-mir-29c, hsa-mir-100(或者hsa-mir-99a),和hsa-mir-133a；
[0108]
16)至少3个、至少4个、至少5个、至少6个选自下组的mirna：hsa-mir-99a (或者hsa-mir-100),hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,和hsa-mir-183；
[0109]
17)至少3个、至少4个、至少5个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者 hsa-mir-100),hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,和 hsa-mir-125b；或
[0110]
18)至少3个、至少4个、选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100),hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,和hsa-mir-96。
[0111]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括以下mirna组合：hsa-mir-99a， hsa-mir-141,和hsa-mir-151-5p，或者包括以下mirna组合：hsa-mir-100, hsa-mir-141,和hsa-mir-151-5p。
[0112]
在某些实施方式中，所述mirna组合进一步包括hsa-mir-96。
[0113]
在某些实施方式中，所述mirna组合进一步包括hsa-mir-125b。
[0114]
在某些实施方式中，所述mirna组合进一步包括hsa-mir-183。
[0115]
在某些实施方式中，所述mirna组合进一步包括hsa-mir-1260。
[0116]
在某些实施方式中，所述mirna组合进一步包括hsa-mir-133a。
[0117]
在某些实施方式中，所述mirna组合进一步包括hsa-mir-429。
[0118]
在某些实施方式中，所述mirna组合进一步包括hsa-mir-143#。
[0119]
在某些实施方式中，所述mirna组合进一步包括hsa-mir-29c#。
[0120]
在某些实施方式中，所述mirna组合进一步包括hsa-mir-29c。
[0121]
在某些实施方式中，所述mirna组合进一步包括hsa-mir-152。
[0122]
在某些实施方式中，所述mirna组合进一步包括hsa-mir-100。
[0123]
在某些实施方式中，所述mirna组合进一步包括hsa-mir-29b。
[0124]
在某些实施方式中，所述mirna组合进一步包括hsa-mir-497。
[0125]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括hsa-mir-99a,hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183，hsa-mir-133a。
[0126]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括hsa-mir-99a,hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260， hsa-mir-133a,和hsa-mir-429。
[0127]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括选自组合1，组合2，组合3，组合4，组合5，组合6，组合7，组合8，组合9，组合10，组合11、组合12、组合13、组合14、组合15，组合16、组合17、组合18、组合19、组合20、组合21、和组合22的任一mirna组合，其中：
[0128]
1)所述组合1包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#, hsa-mir-152,和hsa-mir-100；
[0129]
2)所述组合2包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-143#，hsa-mir-29c#, hsa-mir-29c,hsa-mir-152,和hsa-mir-100；
[0130]
3)所述组合3包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p， hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#, hsa-mir-29c,和hsa-mir-152；或者包括：hsa-mir-100,hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p，hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#, hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,和hsa-mir-152；
[0131]
4)所述组合4包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183, hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#，和hsa-mir-27b；或者包括： hsa-mir-100,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-429， hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#，和hsa-mir-27b；
[0132]
5)所述组合5包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183, hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,和hsa-mir-152；或者包括：hsa-mir-100,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-429， hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,和hsa-mir-152；
[0133]
6)所述组合6包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-143#,hsa-mir-29c,和 hsa-mir-27b；或者包括：hsa-mir-100,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-96,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-143#, hsa-mir-29c,和hsa-mir-27b；
[0134]
7)所述组合7包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-1260,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,和hsa-mir-152；或者包括：hsa-mir-100,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-1260,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,和 hsa-mir-152；
29c#，或者包括hsa-mir-100，hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-133a, hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#；
[0145]
18)所述组合18包括：hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141, hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-29c#,hsa-mir-99a,和 hsa-mir-96；
[0146]
19)所述组合19包括：hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141, hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,和hsa-mir-99a；
[0147]
20)所述组合20包括：hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141, hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-99a，和hsa-mir-29c#；
[0148]
21)所述组合21包括hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141, hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-99a,和hsa-mir-96；和
[0149]
22)所述组合22包括：hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-143#, hsa-mir-125b,hsa-mir-29c,hsa-mir-100,和hsa-mir-133a，或者包括： hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-143#,hsa-mir-125b,hsa-mir-29c, hsa-mir-99a,和hsa-mir-133a。
[0150]
在某些实施方式中，进一步含有能够特异性结合內源对照核酸的对照寡核苷酸。
[0151]
在某些实施方式中，所述杂交区与所述对应的mirna或所述mirna的互补序列的核苷酸序列互补或基本互补。
[0152]
在某些实施方式中，所述基本互补是指包括不超过1个、2个、或3个碱基错配。
[0153]
在某些实施方式中，所述寡核苷酸包括寡核苷酸引物。
[0154]
在某些实施方式中，所述寡核苷酸包括寡核苷酸探针。
[0155]
在某些实施方式中，所述寡核苷酸引物或所述寡核苷酸探针进一步具有可检测标记物。
[0156]
在某些实施方式中，所述可检测标记物包括：生色基团、同位素标记物、重金属、荧光基团、化学发光基团、可见或荧光颗粒、核酸、结合配体、或催化剂 (例如酶)。
[0157]
在某些实施方式中，所述引物或所述探针含有荧光基团，并且进一步含有淬灭基团。
[0158]
在某些实施方式中，所述寡核苷酸固定在固相载体上。
[0159]
在另一方面，本申请还提供了用本申请提供的分离的寡核苷酸用于制备检测所述mirna组合的试剂盒的用途。
[0160]
在另一方面，本申请还提供了用本申请提供的分离的寡核苷酸用于制备诊断待测个体是否患有膀胱及泌尿道上皮癌或者是否处于患膀胱及泌尿道上皮癌的高风险的试剂盒的用途。
[0161]
在另一方面，本申请提供了mirna检测芯片，包括：固定在固相载体上的本申请提供的所述分离的寡核苷酸。
[0162]
在某些实施方式中，所述分离的寡核苷酸以空间上彼此分离的方式固定。
[0163]
在某些实施方式中，所述分离的寡核苷酸包括寡核苷酸引物或寡核苷酸探针。
[0164]
在某些实施方式中，所述寡核苷酸探针进一步具有可检测的标记物。
[0165]
在某些实施方式中，所述标记物包括：生色基团、同位素标记物、重金属、荧光基团、化学发光基团、可见或荧光颗粒、核酸、结合配体、或催化剂(例如酶)。
[0166]
在另一方面，本申请还提供了用本申请提供的分离的寡核苷酸、和/或用本申请提供的mirna检测芯片用于制备诊断膀胱及泌尿道上皮癌的诊断试剂盒的用途。
[0167]
在另一方面，本申请提供了用于检测mirna组合的试剂盒，其中含有本申请提供的分离的寡核苷酸或本申请提供的mirna检测芯片。
[0168]
在某些实施方式中，试剂盒进一步含有一种或多种选自下组的试剂：用于逆转录的试剂、用于富集rna的试剂、用于裂解细胞的试剂、用于保护rna不受降解的试剂、用于dna扩增的试剂、和用于检测dna双链形成的试剂。
[0169]
在某些实施方式中，试剂盒进一步包含非暂态计算机可读介质，所述非暂态计算机可读介质含有通过所述mirna的表达水平计算所述mirna组合的表达模式的计算机可执行指令。
[0170]
在某些实施方式中，所述计算机可执行指令包含分类算法。
[0171]
在某些实施方式中，所述分类算法已经经过阳性训练数据集和阴性训练数据集的训练，所述阳性训练数据集包括多个已知患有膀胱及泌尿道上皮癌的个体的尿液样本中所述mirna组合中的每个mirna的表达水平，所述阴性训练数据集包括多个已知未患有膀胱及泌尿道上皮癌的个体的尿液样本中所述mirna组合中的每个mirna的表达水平。
[0172]
在另一方面，本申请还提供了利用本申请提供的所述mirna组合筛选治疗膀胱及泌尿道上皮癌的候选药物的方法，其包括：
[0173]
a)测定实验组的膀胱及泌尿道上皮癌细胞的mirna组合中每个mirna 的表达水平以获得实验组表达水平，并且通过所述实验组表达水平计算实验组的所述mirna组合的表达模式以得到实验组表达模式，所述mirna组合包括至少3个选自下组的mirna：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a, hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,hsa-mir-152, hsa-mir-100,hsa-mir-27b，和hsa-mir-497；所述实验组的膀胱及泌尿道上皮癌细胞经所述候选药物处理；
[0174]
b)测定对照组的膀胱及泌尿道上皮癌细胞的所述mirna组合中每个 mirna的表达水平以获得对照组表达水平，并且通过所述对照组表达水平计算对照组的所述mirna组合的表达模式以得到对照组表达模式，所述对照组是未经该候选药物处理的膀胱及泌尿道上皮癌细胞；以及
[0175]
c)比较所述实验组表达模式和所述对照组表达模式是否具有显著差异。在某些实施方式中，所述表达模式计算为一个0到1之间的得分。
[0176]
在某些实施方式中，如果所述实验组的得分显著小于所述对照组的得分，则表明所述待测物质对膀胱及泌尿道上皮癌有潜在的治疗作用。
[0177]
在某些实施方式中，所述对照组的膀胱及泌尿道上皮癌细胞来自于未经该候选药物处理的实验组的膀胱及泌尿道上皮癌细胞。
[0178]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0179]
图1a显示了20个示例性mirna组合中第11b组mirna组合的svm模型对癌症组和非癌症组建模样本的预测结果。
[0180]
图1b显示了20个示例性mirna组合中第11b组mirna组合的建模样本roc 曲线图。
[0181]
图2显示了检测样本的信息总表。
[0182]
图3a至图3d显示了检测的125个mirnas、2个内源性对照和一个空白对照的信息。
[0183]
图4a显示了检测建模样本的信息表。
[0184]
图4b显示了盲检测样本的信息表。
[0185]
图5a显示了20个示例性的mirna组合，其中表格中的列示出了mirna标志物的名字，行示出了20个mirna组合，每一个符号“v”的含义是，在该所在列对应的mirna组合中包括了该所在行对应的这个mirna标志物。图5b显示了这20个示例性的mirna组合在建模模型中的灵敏度，特异性，准确度及相对准确度。
[0186]
图6显示了20个示例性的mirna组合在盲检测模型中的灵敏度，特异性，准确度及相对准确度。
[0187]
图7显示了在20个示例性mirna组合中的出现的16种mirna对应的序列和 seq id no。
[0188]
图8显示了分析1到分析8使用的mirna组合用于建模分析及预测双盲样本的结果，以及与本申请提供的示例性mirna组合-11b的建模分析及预测双盲样本的结果比较。
[0189]
图9a和图9b总结了盲样本预测准确度较好的20组mirna组合，其中表格中的列示出了mirna标志物的名字，行示出了20个mirna组合，每一个符号“v”的含义是，在该所在列对应的mirna组合中包括了该所在行对应的这个mirna 标志物。
[0190]
图10显示了8个mirna在癌症样品与正常样品表达水平的差异，及它们在20 组膀胱与泌尿道上皮癌特异性的指纹图谱中的出现频率。
具体实施方式
[0191]
本申请的发明人发现，某些mirna组合与膀胱及泌尿道上皮癌高度相关，通过检测生物样本(例如尿液样本)中的这些mirna组合的水平，可以准确地反映个体是否患有膀胱及泌尿道上皮癌或者是否处于患膀胱及泌尿道上皮癌的高风险，可以作为膀胱及泌尿道上皮癌的指纹图谱。至少部分基于发明人的上述发现，本申请提供了诊断个体是否患有膀胱及泌尿道上皮癌或者是否处于患膀胱及泌尿道上皮癌高风险的方法，以及可用于此类诊断的试剂和试剂盒。此外，本申请还提供了用于筛选治疗膀胱及泌尿道上皮癌的药物的方法。
[0192]
mirna组合
[0193]
在一方面，本申请提供了与膀胱及泌尿道上皮癌高度相关的mirna组合。
[0194]
如本文所用，“mirna”是一种短的、天然存在的非编码的单链rna分子，长度约为16-26个核苷酸(nt)(例如约16-29nt，19-22nt，20-25nt，或21-23nt)，通常在体内参与调控基因表达。在本申请中，mirna、小rna、microrna、和 mir可互换使用并且具有相同的含义。
[0195]
在真核细胞中，mirna基因通过dna转录酶ii(dna transcriptase ii)转录为“初产物”(pri-mirna)，pri-mirna很快被一种核糖核酸酶iii(drosha)加工为mirna“前体”(pre-mirna)，pre-mirna从细胞核转运到细胞质中，然后经另一种核糖核酸酶iii(dicer)
识别剪切为成熟的mirna。成熟的mirna分子与一种或多种mrna部分互补，并且调控蛋白的表达。已知的mirna的序列可以通过公开的数据库获得，例如mirbase数据库(www.mirbase.org)，其中提供了包括mirna序列信息、功能注释、以及预测的基因靶标等信息。
[0196]
通常mirna以“mir”的前缀加上数字的方式命名。关于mirna的命名原则可以参见www.mirbase.org的公开内容，或参见文章ambros et al.,rna 9:277-279 (2003)。例如，为表明mirna来源的物种，可以在名字前面加上指代物种的缩写，例如hsa指代来自于人的mirna。再例如，成熟的mirna通常以“mir”前缀命名，其前体或编码基因通常用“mir”的前缀表示，例如，mir-141是mir-141 的前体。当多个前体或编码基因产生同一个成熟mirna时，通常在前体的名字后用数字后缀进行区分，例如mir-141-1和mir-141-2表示对mir-141的不同的前体。当同一个前体或编码基因产生不同的成熟的mirna时，在mirbas-20以前的版本，通常在较为不常见的成熟mirna的名字后加上#号，例如mir-141#表示较为不常见的mirna，而mir-141则是较为常见的。在mirbase version 21 (mirbase-21)以后的版本，通常在较为不常见的成熟mirna的名字后加上星号(即“*”)，例如mir-141*是表示较为不常见的mirna。由于本文是以 mirbase-21的版本命名mirna，所以是以#表示较不常见的mirna，如mir-141#。如果没有常见不常见之分，则用-5p的后缀表示成熟mirna衍生自mirna前体的5’端(例如mir-151-5p)，-3p的后缀表示衍生自mirna前体的3’端(例如 mir-151-3p)。当两种成熟的mirna的序列差异不大时，可以在名字后加上字母后缀，例如mir-99a和mir-99b是同一mirna家族中两种序列相近的mirna。
[0197]
在本申请中提供的mirna的名字是基于mirbase数据库中的名称。但是应理解，在本申请中的每个mirna名字并不仅仅指代其在mirbase数据库中对应的mirna，还进一步包括其前体(例如pre-mirna)、初产物(例如pri-mirna)、剪接变体、功能等效的突变体、不同物种中的同源物、或衍生物等。
[0198]
在mirna成熟的过程中，由于dicer剪切mirna前体的位点并不准确，当剪切位点不同时会产生序列不完全相同的成熟mirna，也称为mirna的“剪接变体”。与mirbase中的mirna的标准序列比较，剪接变体的3’末端可能增加或减少数个(例如1到3个)核苷酸。mirna的剪切变体可以被认为与具有标准序列的mirna具有相同的功能，因为mirna通过其核心区域(seed region，通常位于5’端的2到8个核苷酸)识别目标基因，因此在其他区域的核苷酸微小差异，并不影响mirna的功能。在某些实施方式中，mirna的剪切变体可以包括：1)在所述mirna的3’端包括1到3个核苷酸的增加或减少的序列；或2) 在所述mirna的5’端第2个至第8个核苷酸的核心区域以外的其它区域有1个、 2个或3个核苷酸改变(例如突变、插入或删除)的序列。
[0199]
如本申请所用，“mirna组合”是指多于一个(例如至少3个、至少4个，至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、或至少16个)mirna组成的集合。本申请提供的mirna组合能够用于特异地、灵敏地区分来自膀胱及泌尿道上皮癌个体的样本和来自非膀胱及泌尿道上皮癌个体的样本。因此，本申请提供的mirna组合也被称为mirna指纹图谱。
[0200]
在某些实施方式中，本申请提供的mirna组合包括至少3个选自下组的 mirna：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b, hsa-mir-183,
hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#, hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,hsa-mir-152,hsa-mir-100,hsa-mir-27b，和 hsa-mir-497。在某些实施方式中，本申请提供的mirna组合也可以包括与上述人类mirna相对应的其他物种的mirna。
[0201]
上述mirna在mirbase中的登录号以及标准序列如以下的表a所示。但是如前所述，上述mirna名称不仅包括具有表a所示标准序列的mirna，还包括其前体、初产物、剪接变体、功能等效的突变体、不同物种中的同源物、和衍生物等。
[0202]
表a.mirna组合中的mirna的标准序列
[0203][0204][0205]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少 5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，或至少16个选自下组的mirna： hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b, hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#, hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,hsa-mir-152,hsa-mir-100,hsa-mir-27b，和 hsa-mir-497。
[0206]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少 5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，或至
少15个选自下组的mirna：hsa-mir-99a, hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183, hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#, hsa-mir-29c,hsa-mir-152,hsa-mir-100,和hsa-mir-27b。
[0207]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少 5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，或至少14个选自下组的mirna：hsa-mir-99a,hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260, hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c, hsa-mir-152,和hsa-mir-100。
[0208]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少 5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，至11个，至少 12个，或至少13个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100), hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183, hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#, hsa-mir-29c,和hsa-mir-152。
[0209]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少 5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，至少11个，或至少12个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100),hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260, hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,和hsa-mir-29c。
[0210]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少 5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，至少10个，或至少11个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100),hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a, hsa-mir-429，hsa-mir-143#,和hsa-mir-29c#。
[0211]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少 5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，或至少10个选自下组的mirna： hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100),hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，和 hsa-mir-143#。
[0212]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少 5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个，或至少10个选自下组的mirna： hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141,hsa-mir-143#, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-29c#,hsa-mir-99a,和hsa-mir-96。
[0213]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少 5个、至少6个、至少7个、至少8个、或至少9个选自下组的mirna：hsa-mir-99a (或者hsa-mir-100),hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b, hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,和hsa-mir-429。
[0214]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少 5个、至少6个、至少7个、至少8个、或至少9个选自下组的mirna：hsa-mir-100, hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141,hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-29c,hsa-mir-99a，和hsa-mir-29c#。
[0215]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少 5个、至少6
个、至少7个、至少8个、或至少9个选自下组的mirna：hsa-mir-100, hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141,hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-29c,hsa-mir-99a,和hsa-mir-96。
[0216]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少 5个、至少6个、至少7个、或至少8个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100),hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b, hsa-mir-183,hsa-mir-1260,和hsa-mir-133a。
[0217]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少 5个、至少6个、至少7个、或至少8个选自下组的mirna：hsa-mir-99a, hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-143#,hsa-mir-125b,hsa-mir-29c, hsa-mir-100,和hsa-mir-133a。
[0218]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少 5个、至少6个、或至少7个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100), hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,和 hsa-mir-1260。
[0219]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少 5个、至少6个、或至少7个选自下组的mirna：hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-143#,hsa-mir-125b,hsa-mir-29c,hsa-mir-100(或者hsa-mir-99a),和 hsa-mir-133a。
[0220]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、至少 5个、或至少6个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100), hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,和hsa-mir-183。
[0221]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、至少4个、或至少5个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100),hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,和hsa-mir-125b。
[0222]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括至少3个、或至少4个选自下组的mirna：hsa-mir-99a(或者hsa-mir-100),hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p, 和hsa-mir-96。
[0223]
在某些实施方式中，本申请提供的所述mirna组合包括以下mirna组合： hsa-mir-99a，hsa-mir-141,和hsa-mir-151-5p，或者包括以下mirna组合： hsa-mir-100，hsa-mir-141,和hsa-mir-151-5p。在某些实施方式中，本申请提供的所述mirna组合中包括hsa-mir-99a。在某些实施方式中，本申请提供的所述 mirna组合中进一步包括hsa-mir-141和/或hsa-mir-151-5p。在某些实施方式中，本申请提供的所述mirna组合进一步包括hsa-mir-96，和/或进一步包括 hsa-mir-125b，和/或进一步包括hsa-mir-183，和/或进一步包括hsa-mir-1260，和/或进一步包括hsa-mir-133a，和/或进一步包括hsa-mir-429，和/或进一步包括hsa-mir-143#，和/或进一步包括hsa-mir-29c#，和/或进一步包括hsa-mir-29c，和/或进一步包括hsa-mir-152，和/或进一步包括hsa-mir-100，和/或进一步包括 hsa-mir-29b，和/或进一步包括hsa-mir-497。
[0224]
在某些实施方式中，所述mirna组合包括hsa-mir-99a,hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183，hsa-mir-133a。在某些实施方式中，所述mirna组合包括hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260，hsa-mir-133a,和 hsa-mir-429。
[0225]
在某些实施方式中，其中所述mirna组合包括选自组合1，组合2，组合3，组合4，组
合5，组合6，组合7，组合8，组合9，组合10，组合11、组合12、组合13、组合14、组合15，组合16、组合17、组合18、组合19、组合20、组合21和组合22的任一mirna组合，其中：
[0226]
所述组合1包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#, hsa-mir-152,和hsa-mir-100；
[0227]
所述组合2包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-143#，hsa-mir-29c#, hsa-mir-29c,hsa-mir-152,和hsa-mir-100；
[0228]
所述组合3包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p，hsa-mir-1260, hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,和 hsa-mir-152；或者包括：hsa-mir-100,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p， hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#, hsa-mir-29c,和hsa-mir-152；
[0229]
所述组合4包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183, hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#，和hsa-mir-27b；或者包括： hsa-mir-100,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-429，hsa-mir-143#, hsa-mir-29c#，和hsa-mir-27b；
[0230]
所述组合5包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183, hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,和hsa-mir-152；或者包括： hsa-mir-100,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-429，hsa-mir-143#, hsa-mir-29c#,和hsa-mir-152；
[0231]
所述组合6包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-143#,hsa-mir-29c,和 hsa-mir-27b；或者包括：hsa-mir-100,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-143#,hsa-mir-29c,和 hsa-mir-27b；
[0232]
所述组合7包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-1260, hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,和hsa-mir-152；或者包括：hsa-mir-100,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-1260,hsa-mir-429， hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,和hsa-mir-152；
[0233]
所述组合8包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#, hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,和hsa-mir-152；或者包括：hsa-mir-100,hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a, hsa-mir-429，hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,和hsa-mir-152；
[0234]
所述组合9包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#, hsa-mir-29c,hsa-mir-152,和hsa-mir-100；
[0235]
所述组合10包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-143#, hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,hsa-mir-152，和hsa-mir-27b，或者包括hsa-mir-100, hsa-mir-141,
hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183, hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-143#,hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c, hsa-mir-152，和hsa-mir-27b；
[0236]
所述组合11包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260，hsa-mir-133a,和hsa-mir-429，或者包括：hsa-mir-100,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b, hsa-mir-183,hsa-mir-1260，hsa-mir-133a,和hsa-mir-429；
[0237]
所述组合12包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183，和hsa-mir-133a，或者包括：hsa-mir-100, hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183，和 hsa-mir-133a；
[0238]
所述组合13包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429,和 hsa-mir-29c，或者包括hsa-mir-100,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429,和 hsa-mir-29c；
[0239]
所述组合14包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260，hsa-mir-133a,hsa-mir-429,和 hsa-mir-497，或者包括：hsa-mir-100,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260，hsa-mir-133a,hsa-mir-429,和 hsa-mir-497；
[0240]
所述组合15包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,和hsa-mir-29c，或者包括：hsa-mir-100,hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-1260, hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,和hsa-mir-29c；
[0241]
所述组合16包括：hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-143#,和hsa-mir-29c#，或者hsa-mir-100, hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a, hsa-mir-143#,和hsa-mir-29c#；
[0242]
所述组合17包括：hsa-mir-99a，hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#,和 hsa-mir-29c#，或者包括hsa-mir-100，hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96, hsa-mir-125b,hsa-mir-183,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#, hsa-mir-29c#；
[0243]
所述组合18包括：hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141, hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-29c#,hsa-mir-99a,和 hsa-mir-96；
[0244]
所述组合19包括：hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141, hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,和hsa-mir-99a；
[0245]
所述组合20包括：hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141, hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-99a，和hsa-mir-29c#；
[0246]
所述组合21包括hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141, hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-99a,和hsa-mir-96；和
nos:1-14的mirna，选自seq id nos:1-13的mirna，选自seq idnos:1-12的mirna，选自seq id nos:1-11的mirna，选自seq id nos:1-10 的mirna，选自seq id nos:1-9的mirna，选自seq id nos:1-8的mirna，选自seq id nos:1-7的mirna，选自seq id nos:1-6的mirna，选自seq idnos:1-5的mirna，选自seq id nos:1-4的mirna，选自seq id nos:1-5， 8，10-12，和14的mirna；选自seq id nos:1-3，5，8，10-12，和14的mirna；选自seq id nos:1-5，8，10，12，和14的mirna；选自seq id nos:2，3， 5，8，10，12，和14的mirna；选自seq id nos:1-3，5，8，10，12，和14 的mirna。在某些实施方式中，所述mirna组合进一步包括至少一个选自下组的mirna或其任意组合：seq id nos:1-3的mirna。在某些实施方式中，所述mirna组合进一步包括seq id no:1。在某些实施方式中，本申请提供的所述分离的寡核苷酸可用于检测本申请提供的mirna组合中一种或多种mirna。在某些实施方式中，所述分离的寡核苷酸包含引物或探针。
[0255]“引物”在本申请中是指能够与靶核酸特异性杂交并允许其被扩增的寡核苷酸序列。引物通常具有7-40个核苷酸、10-38个核苷酸、15-30个核苷酸、15-25 个核苷酸，或者17-20个核苷酸。例如，引物可以是长度为7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或30的寡聚核苷酸。引物可以包含dna、rna、核酸类似物、或其任意的组合。示例性引物可以是化学合成的。应当理解，通常会期望某些碱基(例如，引物的 3’末端碱基)与靶核酸序列的相应碱基完全互补，以利于在扩增反应中引物的延伸。在某些实施方式中，引物还可以保护不与靶核酸特异性杂交的部分，比如用于固定、标记等的核酸序列。
[0256]“探针”在本申请中是指通过一种或多种类型的化学键(一般是通过互补碱基配对，例如通过氢键的形成)能够与具有至少部分互补序列的靶核酸结合并形成双链结构的寡核苷酸。探针可以是dna探针、rna探针、或pna(蛋白核酸) 探针。探针的大小可以变化。通常，探针长度为至少7至15个核苷酸，也可以为至少20、30或40个核苷酸长度，或者也可以更长，为至少50、60、70、80 或90个核苷酸长度，甚至更长，例如为至少100、150、200个或更多个核苷酸长度。探针还可以具有以任何上述值为界限的任何范围内的任何长度(例如， 15-20个核苷酸长度)。
[0257]
可根据所需检测的mirna或所述mirna的互补序列的序列对引物和探针的序列进行设计。在某些实施方式中，扩增时所用引物的杂交区通常是与mirna 完全互补的互补序列。
[0258]
在某些实施方式中，所述分离的寡核苷酸进一步含有能够与內源对照杂交的对照寡核苷酸，例如对照寡核苷酸引物或对照寡核苷酸探针。
[0259]
在某些实施方式中，所述寡核苷酸引物或所述寡核苷酸探针进一步具有可检测标记物。“可检测标记物”在本申请中是指，能够被检测到或能够被允许检测的标记物。可检测标记物可用于标记探针以允许便捷的探针检测，尤其是一旦探针已与其互补靶序列杂交时。molecular cloning:a laboratory manual，j.sambrook 等人，eds.，第2版，cold spring harbor laboratory出版社，1989年，第10章和第11章中描述了标记dna和rna探针的制备方法及其与靶核苷酸序列杂交的条件，其公开内容通过引用并入本申请。
[0260]
在某些实施方式中，所述可检测标记物包括，但不限于，生色基团、同位素标记物、重金属、荧光基团、化学发光基团、可见或荧光颗粒、核酸、结合配体、催化剂例如酶等。
[0261]
生色基团的例子包括地高辛分子(dig)。
[0262]
同位素标记物的例子包括，但不限于，3h，
32
p，
33
p，
14
c，
35
s，
123
i,
124
i,
125
i, 131
i,
35
s,3h,
111
in,
112
in,
14
c,
64
cu,
67
cu,
86
y,
88
y,
90
y,
177
lu,
211
at,
186
re,
188
re,
153
sm, 212
bi和
32
p。
[0263]
荧光基团的例子包括，但不限于，吖啶，7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(amca)，氟硼荧(bodipy)，级联蓝(cascade blue)，cy2，cy3，cy5，cy7，1—氨基萘—8—羧酸(edans)，曙红(eosin)，赤藓红(erythrosin)，荧光素(fluorescein)， 6-羧基荧光素，四氯－6－羧基荧光素(tet)，2，7－二甲基－4，5－二氯－6 －羧基荧光素(joc)，六氯－6－甲基荧光素(hex)，俄勒冈绿(oregon green)，罗丹明(rhodamine)，rhodol green，tamra.rox和texas red tm
(分子探针公司，尤金市，俄冈州)。
[0264]
重金属的例子包括纳米金。
[0265]
配体的例子包括，但不限于，生物素，抗生物素蛋白，抗体或抗原。
[0266]
酶的例子包括，但不限于，碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β
-ꢀ
半乳糖苷酶和核糖核酸酶。
[0267]
应当理解，可检测标记物本身并不必然产生可检测的信号。例如，在某些实施方式中，可检测标记物可以与可检测的配体反应，或与一种或多种其他化合物反应以产生可检测信号。例如，可检测标记物可以是一种配体，所述配体能够与另一个标记的配体(例如标记的二抗)特异性结合。又例如，酶可作为可检测标记物，因为其催化活性可以催化能产生颜色、荧光或化学发光的底物，进而产生可检测的信号。
[0268]
在某些实施方案中，所述可检测标记的引物或探针可进一步包含淬灭基团。淬灭基团是指，当与荧光基团充分接近时，由于例如荧光共振能量转移(fret) 而使荧光基团发出的荧光被淬灭的基团。
[0269]
淬灭基团的例子包括，但不限于，tamra，dabcyl，black hole quencher(bhq， biosearch technologies)，ddq(eurogentec)，iowa black fq(integrated dnatechnologies)，qsy-7(分子探针公司)，和eclipse淬火剂(epoch biosciences)。
[0270]
在某些实施方式中，所述引物或所述探针含有荧光基团，并且进一步含有淬灭基团。
[0271]
在另一些实施方式中，所述引物或所述探针也可以不具有可检测标记物，即未标记的引物或探针。未标记的探针可以通过直接地或间接地与被标记的配体或者被标记的待测物特异性结合，从而允许待测物被检测。例如，可以将待检测的靶核酸以可检测标记物进行标记，当与未标记的探针杂交时，可以被检测。再例如，可以将dttp类似物5-(n-(n-生物素-ε-氨基己基)-3-氨基烯丙基)脱氧尿苷三磷酸掺入探针分子，由此得到的生物素化的探针可与生物素结合蛋白(例如抗生物素、链霉亲和素和抗体(例如抗生物素抗体))结合，而所述生物素结合蛋白可以进一步地标记有产生颜色反应的荧光染料或酶。
[0272]
在某些实施方式中，所述分离的寡核苷酸固定在固相载体上。所述固相载体可以是被修饰的，以包含适合于分离的寡核苷酸附着或结合的离散的独立位点，并且适合于至少一种检测方法。固相载体的代表性实例包括玻璃和改性或功能化玻璃，塑料(包括丙烯酸树脂，聚苯乙烯和苯乙烯和其他材料的共聚物，聚丙烯，聚乙烯，聚丁烯，聚氨酯，teflonj等)，多糖，尼龙或硝化纤维素，树脂，二氧化硅或二氧化硅基材料，包括硅和改性硅，碳，金属，无机玻璃和塑料。载体可以允许光学检测而不发出明显的荧光。
[0273]
诊断方法
[0274]
在一方面，本申请提供了诊断待测个体是否患有膀胱及泌尿道上皮癌或者是否处于患膀胱及泌尿道上皮癌高风险的方法，包括：
[0275]
a)获得所述待测个体的待测尿液样本；
[0276]
b)测定所述待测尿液样本中本申请提供的mirna组合中的每个mirna的表达水平；
[0277]
c)通过所述mirna的表达水平评估所述待测个体是否患有膀胱及泌尿道上皮癌或者是否处于患膀胱及泌尿道上皮癌的高风险。
[0278]
在一方面，本申请提供了一组包含杂交区的寡核苷酸用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于诊断待测个体是否患有膀胱及泌尿道上皮癌或者是否处于患膀胱及泌尿道上皮癌高风险，所述每一个所述寡核苷酸中的所述杂交区能够与本申请提供的mirna组合中的对应的mirna或所述mirna的互补序列杂交。在某些实施方式中，所述试剂盒用于本申请提供的诊断方法。
[0279]
1.样本获得
[0280]
本申请的方法使用待测个体的待测尿液样本。尿液样本的例子包括，但不限于：全尿液、尿液沉淀、尿液上清、尿液所含细胞，或者从上述一项或多项样本中分离得到的rna等。
[0281]
在某些实施方式中，进一步包括富集所述待测尿液样本中的rna。例如，可以浓缩尿液样本以富集其中的rna，或者也可以对尿液样本进行离心处理。
[0282]
在某些实施方式中，所述富集包括从所述待测尿液样本中离心得到的沉淀中提取rna。提取rna的方法是本领域技术人员熟知的，例如trizol法。trizol 是一种新型总rna抽提试剂，含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶，以保持rna完整。通过trizol法可以从细胞或组织中提取总rna。
[0283]
在某些实施方式中，所述富集进一步包括从所述待测尿液样本中分离具有一定长度的rna，例如长度一般在10-100个碱基之间的小片段rna。通过富集小片段rna进行后续的表达水平的检测，可以提高对mirna捕获和检测的准确性。本领域人员可方便地分离出具有一定片段长度的rna，例如，通过亲和柱色谱法、凝胶电泳法和磁珠捕获法等。还可以使用常规的试剂盒从尿液样本中纯化mirna。代表性的抽提mirna试剂盒包括但并不限于，qiagen公司的 mirnas抽提试剂盒。
[0284]
在某些实施方式中，进一步包括对富集的rna上引入可检测标记物。任何适合在核酸上标记的可检测标记物都可以使用，例如但不限于本申请提供的那些可检测标记物的实例。
[0285]
2.测定mirna表达水平
[0286]
本申请提供的方法进一步包括在所述待测尿液样本中测定本申请提供的所述 mirna组合中每个mirna的表达水平。
[0287]
mirna的“表达水平”，在本申请中是指测得的该mirna在样本中的量、浓度或相对的丰度。mirna的表达水平可以通过适当的方法进行测定，例如但不限于，通过基于扩增的方法、基于杂交的方法、和/或基于测序的方法来测定。
[0288]
基于扩增的方法
[0289]
基于扩增的方法是指包含核酸扩增反应的方法。核酸扩增测定包括复制靶核酸
(例如dna或rna)，从而增加扩增的核酸序列的数量。扩增可以指数或以线性扩增。示例性核酸扩增方法包括，但不限于，使用聚合酶链式反应扩增(“pcr”，请参见美国专利4,683,195和4,683,202；pcr protocols：a guide tomethods and applications(innis et al.,eds,1990))，逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)，实时荧光定量pcr(qrt-pcr)，定量pcr，例如荧光染料定量pcr,巢式pcr，连接酶链式反应(请参见abravaya,k.,et al.,nucleic acids research, 23:675-682,(1995))，分支dna信号扩增(请参见urdea,m.s.,et al.,aids,7 (suppl 2):s11-s14,(1993))，可扩增的rna报告子，q-β复制(请参见lizardi etal.,biotechnology(1988)6:1197)，基于转录的扩增(请参见kwoh et al.,proc.natl. acad.sci.usa(1989)86:1173-1177)，回旋镖dna扩增，链置换激活，循环探针技术，自持序列复制(请参见guatelli et al.,proc.natl.acad.sci.usa(1990)87： 1874-1878)，滚环复制(请参见美国专利5,854,033)，基于等温核酸序列的扩增 (nasba)和基因表达的连续分析(sage)等等。作为示例，cn10267663a 中公开的一种具有高灵敏度和高特异性的扩增技术也可以用在本发明中。这些方法都适用于扩增mirna、其前体、其编码基因或其逆转录的dna等。
[0290]
在某些实施方案中，所述核酸扩增反应包括基于pcr的方法。在某些实施方案中，所述mirna的表达水平通过基于pcr的方法来测定。pcr是一种通过在体外使用可以与靶核酸杂交的一条、两条或更多的引物，在酶的催化下，通过以靶核酸为模板，通过延伸引物合成新的与靶核酸互补的核酸链，从而扩增核酸 (例如dna或rna)的方法。
[0291]
在某些实施方式中，本申请所述的每个mirna的表达水平可以通过逆转录 pcr测定。在这样的实施方式中，在测定所述每个mirna的表达水平之前，进一步包括将所述每个mirna逆转录为cdna。可以通过本领域公知的方法进行逆转录，例如通过对mirna进行polya加尾(例如通过polya聚合酶)，然后用polyt作为引物进行逆转录，或者也可以将mirna与一个接头序列连接(例如通过t4 rna连接酶)，再通过与接头序列互补的引物进行逆转录。可以使用多种逆转录酶，包括但不限于，mmlv rt，mmlv rt的r,nase h突变体，例如superscript和superscript ii(life technologies，gibco brl，gaithersburg， md.)，amv rt，以及来自嗜热细菌的热稳定逆转录酶。例如，可以用于将rna 转化为cdna的一种方法是改编自superscript ii预扩增系统的方案(lifetechnologies，gibco brl，gaithersburg，md.；目录号18089-011)，参见rashtchian, a.,pcr methods applic.,4:s83-s91(1994)。
[0292]
在某些实施方案中，所述mirna的表达水平在核酸扩增反应后被定量。例如，可以在琼脂糖凝胶上分离扩增产物，并用溴化乙锭染色，然后使用标准凝胶电泳方法进行检测和定量。或者，可以用合适的可检测标记物(例如放射性或荧光核苷酸)整体标记扩增产物，然后使用x射线胶片或在适当的激发光谱下进行观察。
[0293]
在某些实施方案中，所述mirna的表达水平在核酸扩增反应期间定量，这类方案也称为实时扩增或定量扩增。定量扩增的方法在以下文献中公开：例如美国专利6,180,349，6,180,349以及6，033，854；又例如gibson et al.,genomeresearch(1996)6:995-1001；degraves,et al.,biotechniques(2003)34(1):106-10, 112-5；deiman b,et al.,mol biotechnol.(2002)20(2):163-79。通过在扩增(例如 pcr)反应的循环中监测可以表征模板拷贝数的可检测信号，从而据此定量。
[0294]
在某些实施方案中，所述mirna的表达水平可以使用嵌入剂(例如dna双链嵌入剂)来测定。嵌入剂在插入dna双链时可以产生可检测信号。示例性嵌入剂包括sybr green
tm
和sybr gold
tm
。引物或探针可以具有可检测标记，或者不具有可检测标记。
[0295]
在某些实施方案中，所述mirna的表达水平可以使用本申请提供的引物或探针来测定。所述引物或探针可以具有可检测标记物，或者也可以不具有可检测标记物。
[0296]
在某些实施方案中，标记的引物或标记的探针包含含有荧光基团的可检测标记物。在某些实施方案中，标记的引物或标记的探针进一步包含淬灭基团。此类同时具有荧光基团和淬灭基团的引物或探针可作为自淬灭引物或探针。在完整的引物或探针中，淬灭基团和荧光基团非常接近，因而当荧光基团被激发时，它通过荧光共振能量转移(fret)将能量转移到同一探针中的淬灭基团中，从而不发出信号。例如，荧光基团和淬灭基团中的一个可以位于引物或探针的一端，另一个可以位于相对的末端或者可选地连接至内部核苷酸。或者，荧光基团和淬灭基团都可以连接到内部核苷酸上并且彼此相距一定距离，只要可以发生fret即可。自淬灭引物或探针的示例包括，但不限于，taqman(请参见美国专利5,210,015 和5,538,848)或molecular beacon探针(请参见美国专利5,118,801和5,312,728)，或其他无茎或线性信标探针(请参见livak et al.,1995,pcr method appl., 4:357-362；tyagi et al,1996,nature biotechnology,14:303-308；nazarenko et al., 1997,nucl.acids res.,25:2516-2521；美国专利5,866,336和6,117,635)。
[0297]
用荧光基团和淬灭基团标记的引物或探针可用于5'
→
3'外切核酸酶“水解
”ꢀ
pcr的方法(也称为测定)(请参见美国专利5,210,015和5,487,972； holland et al.,pnas usa(1991)88:7276-7280；lee et al,nucleic acids res.(1993) 21:3761-3766)。该测定通过在扩增反应期间对标记探针(探针) 进行杂交和切割从而检测特定pcr产物的累积。在pcr过程中，当且仅当该探针与被扩增的区段杂交时，其才能被dna聚合酶的5'
→
3'外切核酸酶活性切割。探针的切割引起荧光团的荧光强度的相应增加。
[0298]
也可以使用其他类型的具有可检测标记物的引物或探针。在一个实施方案中，标记的引物或探针被构造成使得当引物或探针与靶核酸杂交时会产生荧光变化。例如，可以设计两个分别具有荧光基团或淬灭基团标记的探针，使其能够以头尾朝向在靶核酸上杂交，并且杂交后两个探针的距离允许其中分别带有的荧光基团和淬灭基团之间发生fret，例如lightcycler tm
杂交探针。在另一个实施方案中，标记引物或探针被构造成在与核酸结合或掺入延伸产物时可以发出信号，请参见例如scorpions tm
探针(例如，whitcombe et al.,nature biotechnology(1999) 17:804-807和美国专利6,326,145)，sunrise tm
(或amplifluor tm
)探针(例如 nazarenko et al.,nuc.acids res.(1997)25:2516-2521和美国专利6,117,635)。在另一个实施方案中，标记引物或探针被构造成具有二级结构，该二级结构本身(即：无需淬灭基团)可以导致信号降低，但是在与靶核酸杂交后由于二级结构被破坏，则可发出增强的信号(例如lux probes
tm
探针)。
[0299]
在定量扩增反应(例如实时pcr)中，检测到的信号可以使用本领域已知的方法定量，以得到所述mirna的水平。在某些实施方式中，在扩增期间，嵌入剂、标记引物或标记探针的信号强度与扩增的mirna的量成正比，从而允许对样本中原始mirna的量进行定量。在某些实施方式中，可以在每个pcr扩增循环期间监测和计算荧光信号，该荧光信号随着循环数的增加而增加。在某些实施方式中，可进一步计算循环阈值或ct值。ct值是当荧光达到预
定值时所需的循环数。
[0300]
基于杂交的方法
[0301]
基于杂交的方法是指包含使用核酸杂交进行检测的方法。基于杂交的方法的示例包括但不限于，northern blotting法、southern blotting法、原位杂交、微阵列分析、基于微球技术的杂交、多重杂交等。在某些实施方式中，基于杂交的方法可以不经过核酸扩增。
[0302]
在某些实施方案中，可以分离待检测的核酸(例如mirna)，例如通过凝胶电泳，然后在合适的滤膜(例如硝酸纤维素滤膜)上转移所述分离的核酸，允许探针与分离的靶核酸杂交并检测(请参见，例如molecular cloning:a laboratorymanual,j.sambrook et al.,eds.,2nd edition,cold spring harbor laboratory press, 1989,chapter 7)。探针和靶核酸的杂交可通过本领域已知的方法检测或测量。例如，可以将杂交后的滤膜在感光胶片进行放射自显影检测。通过对曝光后的感光胶片进行光密度扫描，可以提供对靶核酸水平的精确测量。计算机成像系统也可用于计算靶核酸的水平。
[0303]
在某些实施方式中，用于杂交的探针可以具有可检测的标记物。例如，可以将样本中的待检测核酸(例如mirna)与标记的探针杂交，洗去未杂交的标记探针后，检测样本中的待测核酸。
[0304]
在某些实施方式中，用于杂交的探针可以不具有可检测的标记物。例如，可以将未标记的探针以空间上彼此分离的方式固定在固相载体上，并且可以与标记的靶核酸分子杂交。
[0305]
在某些实施方式中，可以通过微阵列(microarry)进行杂交检测。微阵列提供了同时测量大量靶核酸分子水平的方法。微阵列包括固相基底和以空间上可分离的方式固定在所示固相基底上的多个核酸探针。所述核酸探针可以以每平方厘米多达数百万个探针的密度在固相基地表面排列。当样本中的靶核酸分子(例如 mirna)与微阵列上的探针杂交后，可以通过激光扫描进行检测，以确定在微阵列上每个探针的杂交信号强度，并将其转换为表示靶核酸分子(例如mirna) 的水平的定量值(请参见美国专利6,040,138,5,800,992和6,020,135,6,033,860和 6,344,316)。
[0306]
基于测序的方法
[0307]
基于测序的方法是指包含核酸测序的方法。测序方法的例子包括，但不限于， rna测序，焦磷酸测序和高通量测序。以平行大规模测序为特征的高通量测序 (也称为二代测序)可以用于测量目标核酸(例如mirna)的表达水平。高通量测序的例子包括，大规模并行特征测序(mpss)polony测序，454焦磷酸测序，illumina(solexa)测序，solid测序，离子半导体测序，dna纳米球测序， helioscope
tm
单分子测序，单分子smrt
tm
测序，单分子实时(rnap)测序，和纳米孔dna测序等。
[0308]
高通量测序可以包括合成测序(sequence-by-synthesis)，连接测序和超深度测序(例如marguiles et al.,nature 437(7057):376-80(2005)中所述)。合成测序通常在测序中使用4种被不同标记的核苷酸，当某个标记的核苷酸被掺入到延长中的互补链时，该核苷酸的标记信号被检测并识别，随后该核苷酸上的3’终止基团和检测标记被去除，以允许下一个标记的核苷酸被掺入。通过重复上述掺入、检测和识别的步骤，得以完成测序。更多关于合成测序的例子和具体描述可以参见美国专利7,056,676、美国专利8,802,368和7,169,560。合成测序可以通过使用折返pcr和锚定引物在固相载体表面(或微阵列或芯片)上
进行操作。在某些实施方式中，由于mirna长度较短，可以将样本中的rna(例如富集的rna) 或者由其逆转录得到的dna上引入接头序列，例如在5’和/或3’末端连接上接头序列。所述接头序列可以与固相基底或核酸微阵列上固定的互补序列杂交，由此将样本中具有接头序列的核酸分子结合到微阵列上，并通过例如桥式pcr对进行扩增和测序。这个技术被用于，例如测序平台。
[0309]
焦磷酸测序包括在聚合酶的存在下，通过依次掺入对应于碱基a，c，g和t (u)的脱氧核苷酸三磷酸来使靶核酸区域与引物进行杂交并延伸新链。每个碱基的掺入伴随着焦磷酸盐的释放，并通过硫酸化酶转化为atp，所述硫酸化酶驱动氧化荧光素的合成和可见光的释放。由于焦磷酸盐释放与掺入的碱基的数量等摩尔，因此释放的可见光与任何一步中掺入的核苷酸的数量成比例。可以重复该过程直到确定整个序列。
[0310]
在某些实施方案中，所述mirna的水平通过全转录组鸟枪测序(rna测序) 测量。rna测序的方法已被公开(请参见wang z,gerstein m and snyder m, nature review genetics(2009)10:57-63；maher ca et al.,nature(2009)458:97-101； kukurba k&montgomery sb,cold spring harbor protocols(2015)2015(11): 951-969)。
[0311]
通过对测序的靶核酸的拷贝数进行计数，可以对靶核酸进行定量。
[0312]
mirna表达水平
[0313]
可以通过本领域技术人员知晓的方法来确定mirna的表达水平。例如，可以通过外标标准曲线法或者内标法，将测得的信号转化成mirna的表达水平。
[0314]
在某些实施方式中，所述mirna的表达水平可以是经校正的。例如，可以将mirna的表达水平用标准水平进行校正。在某些实施方式中，标准水平可以是已知标准品的测定水平，或者是內源存在于待测样本中的某个內源对照的测定水平。在某些实施方式中，标准水平也可以是多个标志物的测定水平的集合。例如，所述标准水平可以是在测序反应中得到的测序总读数。所述标准水平可以预先确定、或者与待测样本同时测定。对mirna的表达水平的校正，可以排除不同样本之间由于例如样本量的不同而导致的mirna表达水平测定值上的不同，使得不同样本之间或者不同实验之间的mirna水平具有可比性。
[0315]
在某些实施方式中，所述mirna的表达水平是经內源对照校正的。內源对照也称为内标，是指內源存在于待测样本中的核酸分子。在某些实施方式中，內源对照可以包括来自同一样本中的保守基因的mrna水平。作为內源对照使用的保守基因包括，例如肌动球蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(g3pdh)和核糖体 rna(如16s-rrna)等。
[0316]
在某些实施方式中，所述內源对照可以包括所述mirna组合中的一个或多个mirna。在某些实施方式中，所述內源对照可以是在膀胱及泌尿道上皮癌个体和非膀胱及泌尿道上皮癌个体中表达水平没有显著差异或差异较小的mirna。在某些实施方式中，在所述mirna组合中，所述內源对照的mirna包括， hsa-mir-99a或hsa-mir-100、hsa-mir-143#等。hsa-mir-99a和hsa-mir-100在序列上只相差一个碱基，在生物活性和功能上也较为类似，在本发明的mirna组合中预期有相似的作用，在本发明的某些组合中预期hsa-mir-99a和hsa-mir-100 可以相互替换。
[0317]
在某些实施方式中，所述mirna的表达水平可以是所述mirna的相对表达水平。相对表达水平可以通过将所述mirna组合中的一个mirna的表达水平与所述组合中的另一个mirna的表达水平相比，或者与所述组合中的另两个或多个mirna的表达水平的总和相比，
计算比值而得到。例如，可以将 has-mir-151-5p的表达水平与hsa-mir-99a的表达水平相比计算比值，该比值可以作为hsa-mir-151-5p的相对表达水平，或者作为hsa-mir-99a的相对表达水平。
[0318]
在某些实施方式中，所述mirna的相对表达水平可以通过与所述mirna组合中的某个mirna的表达水平相比来计算得到。例如，可以与某个或某几个內源对照mirna(例如hsa-mir-99a)的表达水平相比，计算所述mirna的相对表达水平。在某些实施方式中，被比较的对象也可以是非內源对照mirna，例如，在膀胱及泌尿道上皮癌个体和非膀胱及泌尿道上皮癌个体中表达水平具有较大差异的mirna。在某些实施方式中，在所述mirna组合中，每个mirna可以与同一个mirna的表达水平比较，或者也可以分别与不同的mirna的表达水平比较。例如，hsa-mir-151-5p与hsa-mir-99a比较，hsa-mir-125b与hsa-mir-96 比较。本领域技术人员可以根据实际情况，将所述mirna组合中的mirna进行组对以计算每个mirna的相对表达水平。例如，在本申请中提供的mirna 组合11和组合11a、组合11b、组合11c都具有相同的mirna的组成，但通过不同的mirna组对来计算每个mirna的相对表达水平。
[0319]
因此，在本申请中，术语“表达水平”应理解为既包括测得的表达水平、经校正的表达水平，也包括mirna组对计算得到的相对表达水平。
[0320]
计算表达模式
[0321]
在某些实施方式中，所述步骤c)包括比较所述实验组表达模式和所述对照组表达模式是否具有显著差异，并且进一步包括通过所述mirna的表达水平计算所述mirna组合的表达模式。
[0322]“表达模式”在本申请中是指由多个mirna的表达水平所综合体现的一种模式，其能够反映样本状态(例如正常样本，或者癌症样本)。两个样本在某一个特定mirna上可能具有类似的表达水平，但在多个mirna上可能表现出不完全相同的表达水平。不同的mirna可能对样本状态的影响程度不同，举例来说，某些mirna的过表达可能更倾向于反映样本的疾病状态，或者更倾向于反映样本的正常状态。这反映出不同mirna在对于样本状态的分类中可能占有不同的决策权重。因此，表达模式可以被认为是通过与每个mirna的表达水平以及每个mirna对于样本状态的决策权重相关的函数或模型计算的。在一些实施例中，计算结果可以表示为数值。
[0323]
在某些实施方式中，用于计算所述表达模式的函数或模型是通过分类算法计算得到。分类算法是一种以一组变量来将事件进行分类的算法。分类算法可以根据从病人、个体、或事件获得的参数或数据，将其归为一类或者归为不同的类别，例如，可以将病人分为疾病高风险或疾病低风险，或者分为需要治疗或不需要治疗等类别。在某些实施方式中，所述计算得到的表达模式可以反映样本分类的类别。例如，表达模式可以是被计算为一种决策得分，该得分将有助于样本的分类。
[0324]
在某些实施方式中，所述分类算法选自支持向量机(support vector machines)、线性判别分析(linear discriminant analysis)，判别分析(pattern classification，请参见duda et al.,pattern classification,2nd ed.,john wiley,new york 2001)、逻辑回归(logistic regression)、朴素贝叶斯分类(bayes classification)、感知器分类(perceptron classification)、二次分类(quadratic classification)、k-近邻算法(k-nearest neighbors)、boosting算法(boosting)、决策树(decision tree，请参见
hsatie et al.,the elements ofstatistical learning,springer,new york 2001)、随机森林(random forest，请参见breiman,randomforests,machine learning 45:5 2001)、神经网络(neural network，请参见bishop,neural networks forpattern recognition, clarendon press,oxford 1995)、微阵列预测分析(pam,请参见tibshirani etal.,2002,proc.natl.acad.sci.usa 99:6567-6572)，类比软件独立建模分类法(simca,请参见wold,1976,pattern recogn.8:127-139)和学习矢量量化(learning vector quantization)。在某些实施方式中，所述分类算法为支持向量机。在某些方式中，可以使用提供分类算法的软件。某些此类软件是开源的，公开可获得。例如r软件(https://www.r-project.org/)。本领域技术人员可以通过选择r软件中合适的程序包，并在程序包中选择合适的分类算法或函数用于本发明中的方法。
[0325]
在某些实施方式中，所述分类算法可以通过阳性训练数据集和阴性训练数据集中的至少一个的训练来获得用于计算所述表达模式的函数或模型的一个或多个决策权重。可以理解，取决于分类算法的不同，可以用于计算表达模式的函数或模型也可以不同。本领域技术人员可以通过被选择的分类算法来确定适合的函数或模型。阳性训练数据集包括多个已知患有膀胱及泌尿道上皮癌的个体的尿液样本中所述mirna组合中的每个mirna的表达水平，阴性训练数据集包括多个已知未患有膀胱及泌尿道上皮癌的个体的尿液样本中所述mirna组合中的每个mirna的表达水平。
[0326]
在表达水平的数据被用于算法之前，可以进行适当的转化或预处理步骤，例如进行标准化处理。在训练中，将每个已知样本的所述mirna组合中每个 mirna的表达水平，以及已知的分类标签(例如患有膀胱及泌尿道上皮癌或者不患有膀胱及泌尿道上皮癌)用于训练所述分类算法。分类算法可以将阳性训练数据集和阴性训练数据集中的每个mirna的表达水平，分割为对应于不同临床分类的互斥的两部分，例如，一部分对应于患有膀胱及泌尿道上皮癌或处于患膀胱及泌尿道上皮癌高风险的表达模式，另一部分对应于不患有膀胱及泌尿道上皮癌的表达模式。可以通过多种线性分类方法获得每个mirna表达水平的预测强度值，包括但不限于偏最小二乘法(pls,(nguyen et al.,2002,bioinformatics18(2002)39-50))或支持向量机(svm,(et al.learning with kernels,mitpress,cambridge 2002))。在某些实施方式中，对于每个样本，计算其mirna组合中的每个mirna表达水平的预测强度值的加权和。在某些实施方式中，在应用加权和之前可以将数据转化为非线性的。该非线性转化可以包括增加数据的维数。该非线性转化以及加权和可以隐式地进行，例如通过使用核函数( et al.learning with kernels,mit press,cambridge2002)。预测强度值的加权和越高，则表明越接近于阳性预测结果(例如，患有膀胱及泌尿道上皮癌或膀胱及泌尿道上皮癌高风险)，预测强度值越低，则表明越接近于阴性预测结果(例如，不患有膀胱及泌尿道上皮癌或膀胱及泌尿道上皮癌低风险)。利用来自阳性训练数据集和阴性训练数据集的已知信息，可以优化分类算法中相关函数的各个参数，也即决策权重，从而达到对未分类样本的最佳分类预测。在该训练步骤中，所述分类算法被训练或被参数化。
[0327]
在某些实施方式中，所述训练包括通过阳性训练数据集和阴性训练数据集的训练，来获得用于阳性表达模式的函数或模型的一个或多个决策权重，以及用于计算阴性表达模式的函数或模型的一个或多个决策权重。阳性表达模式是指表示阳性预测结果的表达
模式，而阴性表达模式是指表示阴性预测结果的表达模式。在某些实施方式中，所述表达模式被计算为预测强度值的加权和。在某些实施方式中，所述表达模式计算为一个0到1之间的得分。例如，越接近于0，则越接近于阴性预测结果(即不患有膀胱及泌尿道上皮癌)；越接近于1，则越接近于阳性预测结果(即患有膀胱及泌尿道上皮癌或者处于膀胱及泌尿道上皮癌高风险)。
[0328]
在某些实施方式中，所述训练进一步包括基于所述阳性表达模式的得分和所述阴性表达模式的得分确定一个阈值，所述阈值能够区分所述阳性表达模式和所述阴性表达模式。在一些实施例中，可以根据历史数据预先计算并确定该阈值，或者根据其他数据或需求进行确定或调整。在一些实施例中，预定的阈值可以根据所需的灵敏度和特异性进行设定。例如，如果希望获得更高的灵敏度，并且可以适当牺牲特异性，可以选择较低的阈值，反之，如果希望获得更高的特异性，并且可以适当牺牲灵敏度，则可以选择较高的阈值。
[0329]
在某些实施方式中，通过经训练的分类算法计算待测尿液样本的表达模式。该表达模式可以是，例如，在待测尿液样本中所述mirna组合中的每个mirna 表达水平的预测强度值的加权和。
[0330]
在某些实施方式中，可以将待测尿液样本的表达模式与由训练数据集得到的阳性表达模式和/或阴性表达模式相比较。该比较利用适当的相似方式来进行，例如，但不限于，欧几里德距离(duda et al.pattern classification,2nd ed.,johnwiley,new york 2001)，相关系数(van’t veer,et al.2002,nature 415:530)等。然后可以将待测尿液样本分配到具有最接近的表达模式的组或者在附近具有最高数量的表达模式的组。
[0331]
在某些实施方式中，所述方法进一步包括将对所述待测尿液样本计算得到的所述表达模式的得分与所述阈值比较，以评估所述待测个体是否患有膀胱及泌尿道上皮癌或者是否处于患膀胱及泌尿道上皮癌高风险。在某些实施方式中，当所述表达模式计算为一个0到1之间的得分时，所述阈值可以被设定在0.2到0.8 之间的一个适当的数值，具体取决于对灵敏度和特异性的具体要求。在某些实施方式中，所述阈值被设定为0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7或0.8。在某些实施方式中，所述阈值被设定为0.4。如果所述待测尿液样本计算得到的所述表达模式的得分大于所述阈值，则评估所述待测个体为患有膀胱及泌尿道上皮癌或者处于患膀胱及泌尿道上皮癌高风险。
[0332]
在某些实施方式中，本申请提供的方法进一步包括，在步骤c)评估所述待测个体为患有膀胱及泌尿道上皮癌或者处于患膀胱及泌尿道上皮癌高风险时，对所述待测个体施用膀胱及泌尿道上皮癌疗法。在某些实施方式中，所述膀胱及泌尿道上皮癌疗法包括放疗、手术、抗癌药物治疗、或其任意组合。抗癌药物治疗可以使用对膀胱及泌尿道上皮癌有效的任何抗癌药物。抗癌药物可以包括用于靶向治疗的化合物、非靶向常规化疗的化合物或免疫疗法的药物。
[0333]
抗癌药物的例子包括，但不限于，烷化剂、抗代谢剂、生物碱、细胞毒性/ 抗癌抗生素、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白抑制剂、蛋白、抗体、激酶抑制剂(例如丝氨酸-苏氨酸激酶拮抗剂、酪氨酸激酶拮抗剂)、成纤维细胞生长因子受体抑制剂、转录抑制剂、g-蛋白质偶联受体拮抗剂、生长因子拮抗剂、免疫检查点调节剂等。免疫检查点的例子包括：pd-1、pd-l1、pd-l2、ctla-4、tim-3、lag3、 cd160、2b4、tgfβ、vista、btla、tigit、lair1、ox40、cd2、cd27、 cds、icam-1、nkg2c、slamf7、nkp80、b7-h3、lfa-1、1cos、4-1bb、 gitr、cd30、cd40、baffr、
hvem、cd7、light或cd83配体。免疫检查点调节剂是可以调节免疫检查点分子，进而恢复t细胞的抗肿瘤活性和/或阻断对t细胞的抑制。
[0334]
示例的抗癌药物可以包括，erdafitinib、噻替哌、卡介苗、吉西他滨、顺铂、卡铂、奥沙利铂、多柔比星、表柔比星、伊达比星、戊柔比星、紫杉醇、伊马替尼、放线菌素、全反式维甲酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博莱霉素、硼替佐米、卡培他滨、氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、阿霉素、埃博霉素、依托泊苷、替尼泊苷、氟尿嘧啶、硫鸟嘌呤、脱氧氟尿苷、巯嘌呤、羟基脲、伊立替康、甲氨蝶呤、米托蒽醌、培美曲塞、拓扑替康、威罗菲尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、羟基喜树碱、pd-1抗体(例如帕博利珠单抗(pembrolizumab)、nivolumab)、ctla-4抗体(例如伊匹木单抗、 tremelimumab)、或pd-l1抗体(例如atezolizumab，durvalumab、avelumab)等等。
[0335]
核酸芯片
[0336]
另一方面，本发明还提供了一种mirna检测芯片(或者也叫检测微阵列)，包括：固定在固相载体上的如本申请所提供的分离的寡核苷酸。在本申请提供的方法中，为获得所述mirna组合中多个mirna的表达水平，可能需要同时检测样本中多个不同的mirna。mirna检测芯片在这样的情形下将是有用的。
[0337]“芯片”在本申请中是指一种核酸微阵列，即一种具有多个可寻址位置(即，以区别性的、可访问的地址为特征的位置)的阵列，在每个可寻址位置均含有一个与之相连的具有特定序列的寡核苷酸。每个微阵列上可以有几十、上百、甚至上千个可寻址位置以及与之相连的寡核苷酸。根据需要，还可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。在某些实施方式中，mirna芯片上的寡核苷酸以一定的密度(例如至少100个/cm2)以及以空间上彼此分离的方式固定在所述固相载体上。对于一个待检测的mirna来说，在核酸微阵列上可以有不同的核酸探针，其序列可以是部分重合的，或者也可以是针对所述待检测的mirna的不同区段。
[0338]
适用于mirna检测芯片的固相载体可以采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片、微球、凝胶、聚合物表面以及包括光纤、玻璃或任何其他适当的基材在内的纤维上(参见美国专利5,770,358,5,789,162,5,708,153,6,040,193 和5,800,992)。
[0339]
所述的mirna检测芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dt串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，固定后，就可得到本申请提供的mirna芯片。示例的方法可参见，美国专利6,329,209；6,365,418；6,406,921；6,475,808；和 6,475,809。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；j.l.erisi,v.r.iyer,p.o.brown.exploring themetabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.science, 278:680(1997)；和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社， 2000，1-130。尽管通常采用平面芯片表面，但芯片可以构建于几乎任何形状的表面或甚至多个表面上。
[0340]
使用mirna芯片检测mirna的表达水平有几个优点。首先，可以在同一个时间点在同一个样本中识别出多个mirna的整体表达。第二，通过适当设计寡核苷酸探针，可以识别成熟分子和前体分子的表达。第三，与northern blot 分析相比，芯片需要较少量的rna，使
用2.5微克的总rna即可提供具有重现性的结果。mirna芯片可以对mirna基因表达谱进行分析，分析mirna的表达模式和表达水平。不同的mirna特征可以与已建立的疾病标记相关，或者直接与疾病状态相关。
[0341]
本申请提供的mirna检测芯片或核酸微阵列上的寡核苷酸可以包括本申请提供的寡核苷酸探针(例如单链核酸探针)或者寡核苷酸引物。所述引物或探针可以与待测个体的尿液样本中的待检测的mirna杂交，以允许待检测的mirna 的扩增和/或检测。在某些实施方式中，本申请提供的mirna芯片针对每个 mirna可能包含两种不同的寡核苷酸探针，一种对含有活性成熟序列的mirna 具有特异性，另一个对mirna前体具有特异性。在某些实施方式中，本申请提供的mirna芯片还可以包含一些对照，例如一个或多个与人同源基因仅相差几个碱基的小鼠序列，所述小鼠序列可以作为杂交严格条件的对照。两个物种的 mirna也可以打印在芯片上，为特异性杂交提供一个内部的、相对稳定的、阳性对照。芯片上还可以包括一个或多个非特异性杂交的适当对照。为此，可以根据已知mirna的序列，选择序列差异较大的序列作为非特异性杂交的对照。在某些实施方式中，本申请提供的mirna芯片还含有阳性对照，例如合成的某些 mirna，或同源的内源小rna如hsa-rnu48，hsa-7sl-scrna等。
[0342]
在某些实施方式中，所述寡核苷酸探针进一步具有可检测的标记物。
[0343]
在某些实施方式中，在mirna检测芯片或核酸微阵列上的寡核苷酸可以进一步含有用于与固相载体相连的连接区。
[0344]
在某些实施方式中，在将待检测样本中的rna与mirna芯片进行杂交时，可以先将mirna芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。本发明所述的rna与mirna 芯片之间的固相杂交按照本领域的常规方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的方法。然后根据标记信号在 mirna芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪scanarray 3000等)获取待测信息。
[0345]
在另一方面，本发明提供的mirna检测芯片可用于制备诊断膀胱及泌尿道上皮癌的诊断试剂盒。
[0346]
本申请进一步提供了，用本申请提供的mirna检测芯片用于制备诊断膀胱及泌尿道上皮癌的诊断试剂盒的用途。
[0347]
检测试剂盒
[0348]
在一方面，本申请提供了一种检测mirna组合的试剂盒，其含有本申请提供的分离的寡核苷酸、和/或本申请提供的mirna检测芯片。
[0349]
在某些实施方式中，本申请提供的试剂盒进一步含有阳性对照。例如，所述试剂盒还可以含有本申请提供的所述mirna组合，或者编码上述mirna组合的寡核苷酸组合。
[0350]
在某些实施方式中，本申请提供的试剂盒进一步含有阴性对照。例如，所述试剂盒还可以包括一个或多个非特异性杂交的适当对照。阴性对照的序列可以选择与已知的待测mirna组合没有显著同源性的序列。
[0351]
在某些实施方式中，本申请提供的试剂盒进一步含有杂交条件的对照。例如，所述试剂盒中可以进一步含有一个或多个与人同源mirna基因仅相差几个碱基的小鼠序列，所述小鼠序列可以作为杂交严格条件的对照。
[0352]
在某些实施方式中，本申请提供的试剂盒进一步含有用于标记rna样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。
[0353]
在某些实施方式中，本申请提供的试剂盒进一步含有一种或多种选自下组的试剂：用于逆转录的试剂、用于富集rna的试剂、用于核酸扩增的试剂(例如扩增液)、用于杂交的试剂(例如杂交液)、用于显色的试剂(例如显色液)、用于裂解细胞的试剂、用于保护rna不受降解的试剂、用于dna扩增的试剂、和用于检测dna双链形成的试剂。
[0354]
用于检测dna双链形成的试剂可以包括，例如，嵌入剂(如evagreen、 sybrgreen等)、引物、荧光探针等。
[0355]
在某些实施方式中，本申请提供的试剂盒还包含对照参比物，例如可以与内源对照的核酸序列杂交的引物或探针，或者已知成分和/或含量的对照mirna。在某些实施方式中，所述分离的寡核苷酸进一步含有能够与內源对照杂交的对照寡核苷酸，例如对照寡核苷酸引物或对照寡核苷酸探针。
[0356]
在某些实施方式中，本申请提供的试剂盒中包含的各种试剂可以分别置于不同的容器中(例如小管、小瓶)，或者其中至少部分试剂以混合物的形式置于容器中(例如pcr的反应混合物)。
[0357]
在某些实施方式中，本申请提供的试剂盒还包含对所述尿液样本取样的装置。
[0358]
另外，在某些实施方式中，本申请提供的试剂盒还可包括使用说明书。
[0359]
在某些实施方式中，本申请提供的试剂盒还可包含非暂态计算机可读介质，所述非暂态计算机可读介质含有通过所述mirna的表达水平计算所述mirna 组合的表达模式的计算机可执行指令。在某些实施方式中，所述计算机可执行指令包含分类算法。在某些实施方式中，其中所述分类算法已经经过阳性训练数据集和阴性训练数据集的训练，所述阳性训练数据集包括多个已知患有膀胱及泌尿道上皮癌的个体的尿液样本中所述mirna组合中的每个mirna的表达水平，所述阴性训练数据集包括多个已知未患有膀胱及泌尿道上皮癌的个体的尿液样本中所述mirna组合中的每个mirna的表达水平。
[0360]
在另一方面，本申请还提供了mirna检测试剂和/或mirna检测芯片用于制备评估个体是否患有膀胱及泌尿道上皮癌或者是否处于患膀胱及泌尿道上皮癌高风险的诊断试剂盒的用途。
[0361]
筛选候选药物的方法
[0362]
本申请还提供了通过本申请提供的mirna组合来筛选治疗膀胱及泌尿道上皮癌的候选药物的方法。在某些实施方式中，可用于本申请的方法的候选药物可以包括，例如，蛋白质、肽、核酸如dna、rna等、小分子例如分子量小于50kd 的有机分子和无机分子。候选药物可以是内源性生理化合物、或天然或合成化合物。在某些实施方式中，合适候选药物包括但不限于转录抑制剂、g-蛋白质偶联受体拮抗剂、生长因子拮抗剂、丝氨酸-苏氨酸激酶拮抗剂、酪氨酸激酶拮抗剂。所述候选药物也可以是如上所述的几种药物联用。通过比较在候选药物处理前和处理后，癌细胞中的所述mirna组合的表达水平的变化情况，可以判断候选药物对膀胱及泌尿道上皮癌是否存在潜在的治疗效果。
[0363]
在某些实施方式中，所述方法包括测定经候选药物处理的实验组膀胱及泌尿道上皮癌细胞中，所述mirna组合中每个mirna的表达水平，以获得实验组表达水平。可以对实验组表达水平进行计算，得到实验组中所述mirna组合的表达模式，为实验组表达模式。
[0364]
在某些实施方式中，所述方法还包括测定未经候选药物处理的对照组膀胱及泌尿道上皮癌细胞中，所述mirna组合中每个mirna的表达水平，以获得对照组表达水平。可以对对照组表达水平进行计算，得到对照组中所述mirna组合的表达模式，为对照组表达模式。
[0365]
实验组表达模式和对照组表达模式可以通过，例如分类算法进行计算。在某些实施方式中，实验组表达模式和对照组表达模式可以各自计算得到一个0到1 之间的得分。如果所述实验组的得分显著小于所述对照组的得分，则表明所述待测物质对膀胱及泌尿道上皮癌有潜在的治疗作用。
[0366]
在某些实施方式中，所述实验组和对照组的膀胱及泌尿道上皮癌细胞是来源相同的膀胱及泌尿道上皮癌细胞。例如，都是来自于一个个体的生物样本，或者都是来自于一个膀胱及泌尿道上皮癌细胞系。对照组细胞与实验组细胞的区别可以仅在于是否经待测药物处理。
[0367]
在某些实施方式中，本申请提供的药物筛选方法进一步包括：分别提取实验组膀胱及泌尿道上皮癌细胞与对照组膀胱及泌尿道上皮癌细胞中的rna。
[0368]
在某些实施方式中，mirna的表达水平可以通过基于扩增的方法、基于杂交的方法、或基于测序的方法来测定。在某些实施方式中，mirna的表达水平使用mirna芯片来测定。
[0369]
在某些实施方式中，所述药物筛选方法进一步包括测定经阳性药物处理的阳性组膀胱及泌尿道上皮癌细胞中，所述mirna组合中每个mirna的表达水平，以获得阳性组表达水平。可以对阳性组表达水平进行计算，得到阳性组中所述 mirna组合的表达模式，为阳性组表达模式。
[0370]
在某些实施方式中，阳性组表达模式也可以计算得到一个0到1之间的得分。如果所述实验组的得分显著小于所述对照组的得分，和/或接近所述阳性组的得分，则表明所述待测物质对膀胱及泌尿道上皮癌有潜在的治疗作用。
[0371]
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0372]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york: cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0373]
实施例概述
[0374]
本发明人通过大量的筛选首次筛选出图7中的16个mirna，并且通过实验证明，这些mirna中的不同组合可非常有效地区分膀胱及泌尿道上皮癌的尿液样本与非膀胱及泌尿道上皮癌尿液样本。
[0375]
具体地，在本研究中，检测并分析膀胱及泌尿道上皮癌的尿液样本与非膀胱及泌尿道上皮癌尿液样本中mirna组合的表达情况，并通过生物信息学的方法筛选出用于区分膀胱及泌尿道上皮癌的尿液样本与非膀胱及泌尿道上皮癌的尿液样本的mirna指纹图谱。
9000006)，16.67ul去核酸酶的超纯水至总体积50ul。总rna量为80ng，轻柔混匀后，1000rpm离心10秒，放入abi9700 pcr仪进行反转录反应，反应程序： 37℃60min，95℃10min，4℃保持。
[0387]
取出pcr管，震荡离心后-20℃保存或者直接用于qpcr反应。
[0388]
实施例4荧光定量pcr检测
[0389]
在1.5ml的离心管中加入30.72ul实施例3得到的反转录产物，加入768ul 盛元公司生产的荧光定量pcr酶反应液(产品编号：9000008，2xuniversal qpcr master mix high rox)，276.5ul去核酸酶超纯水(产品编号： 9000015)，轻柔混匀。
[0390]
将翔琼公司生产的小rna反应板芯片，其为每块384孔的qpcr反应板，每块反应板含3个128孔矩阵，每个矩阵包含125个小rna反应液孔,2个内源性对照反应孔，1个空白对照孔(图3a至图3d，sharpvue
tm bladder cancer mirnaarray(产品编号：1000030)从-20℃冰箱中取出，待回复到室温后打开包装袋，置于离心机上，2000g离心5min(thermo、st16r，转头型号：m-20)。小心解开封膜。
[0391]
将前述步骤得到的混合液，使用连续移液器将混合液分别加入翔琼公司生产的小rna反应板芯片中，每孔7ul。加样完毕后检查每个孔液体量是否均一。每个小rna反应板芯片每次可以检测三个样本，每个样本检测125个小rna 反应,2个内源性对照反应，1个空白对照。
[0392]
使用定量封板膜(abi，4711971)封板后颠倒混匀，室温1000g离心2min。
[0393]
放入定量pcr仪中(abi，7900ht fast)做定量pcr。程序为：95℃10min，后运行96℃5sec，58℃1min，3个循环；之后96℃5sec，60℃30sec，37个循环，溶解曲线。报告荧光设为sybr，参比荧光设为rox。收集数据，进行生物信息学分析。
[0394]
实施例5 mirna生物统计数据的计算分析
[0395]
尿液样本共计673例，其中227例膀胱及泌尿道上皮癌样本，446例非膀胱及泌尿道上皮癌样本。膀胱及泌尿道上皮癌样本包括膀胱癌与其它尿道上皮性癌症，如肾盂癌，输尿管癌，膀胱癌，排尿管癌等。非膀胱及泌尿道上皮癌样本包括正常、尿路炎症，泌尿系统结石、泌尿系统良性肿瘤，泌尿系统其他癌症(前列腺癌等)，非泌尿系统癌症(如肝癌，胃癌，肺癌等)，膀胱炎。具体信息请见图2。673例尿液样本共被分为两大部分。第一部分为建模样本，包括106例膀胱及泌尿道上皮癌，228例非膀胱及泌尿道上皮癌，共计334例建模样本，样本的信息见图4a。第二部分为盲检测样本(数据分析人员不知道样本的信息)。包括121例膀胱及泌尿道上皮癌，218例非膀胱及泌尿道上皮癌，共计339例盲检测样本，样本的信息见图4b。
[0396]
基于荧光定量polymerase chain reaction(pcr)的方法，检测了125个小 rna，2个内源性对照，和1个空白对照(图3a至图3d)。检测得到的125个小rna与2个内源性对照的表达数据(ct值)，ct值大于32的，将其设置为 32。在分析时，用已知信息的334例样本作为训练集建模，根据建模结果，判断 339例盲样本是良性还是癌症。将盲检测样本的模型预测结果与医院提供的临床信息与病理信息进行核对，分别统计盲检测样本预测的特异性，灵敏度和准确度。分析所用的软件是r语言(https://www.r-project.org/)，具体地，软件包e1071 (https://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html)。
[0397]
我们选用support vector machine(svm)方法建模。具体方法如下：
[0398]
1)首先，筛选除掉低表达量的mirna。在剩下的表达量较高的mirna中，列出所有的单个mirna和成对的mirna作为标记物候选(成对的mirna取 ct值的差值)。
[0399]
2)通过u检验(mann-whitney u test)，选择其中最能很好地区分癌症组和非癌症组的单个mirna或成对mirna标记物。
[0400]
3)从步骤2)选取的标记物中，任意选取12个以内的标记物，列出所有可能的标记物组合。再根据交叉验证方法的准确度和area under the curve(曲线下面积，auc)值，确定最后20个最佳模型的标记物组合。
[0401]
4)最后，用这20个最佳模型，对盲样本进行预测，判断其属于癌症组还是非癌症组。
[0402]
mirna的命名是根据mirbase version 21的mirna数据库。
[0403]
实施例6对所选定的mirna标记物进行诊断特异性、灵敏度的验证
[0404]
对步骤2)选定的最能很好地区分膀胱及泌尿道上皮癌组和非膀胱及泌尿道上皮癌组的单个mirna或成对mirna标记物所形成的组合用svm的统计学方法进行验证，得到了灵敏度和特异性综合最好的20组mirna组合(图5a和图 5b)。其中组合11、组合11a、组合11b和组合11c具有相同的9个mirna，但是在计算时使用了不同的mirna组对计算比值。选取列表中所选的mirna组合对334例训练样本进行了验证。
[0405]
如图5b所示，建模的334例样本中有228例非膀胱及泌尿道上皮癌组(包括正常样品和其他疾病样品)和106例膀胱及泌尿道上皮癌组。对已知的228例非膀胱及泌尿道上皮癌组中的每一个样本，获得某个mirna组合中的每个 mirna表达水平，并用经训练的分类算法计算该样本的表达模式得分，再与阈值比较，得出所述样本是否为非膀胱及泌尿道上皮癌组的结论。如果在228例已知的非癌样本中有198例样本被正确评估为非膀胱及泌尿道上皮癌组，则该 mirna组合的特异性计算为198/228，即0.868。其他mirna组合以此类推。
[0406]
同理，对于106例已知的膀胱及泌尿道上皮癌组中的每一个样本，根据某个 mirna组合计算每个样本的表达模式得分，与阈值比较，得出所述样本是否为膀胱及泌尿道上皮癌组的结论。如果在106例已知的癌样本中有89例样本被正确评估为膀胱及泌尿道上皮癌组，则该mirna组合的灵敏度计算为89/106，即 0.840。其他mirna组合以此类推。
[0407]
对于每一个mirna组合，对建模所有样品计算准确度。如果在334例样本中，某个mirna组合正确地评估出198例非癌样本和89例癌样本，则该mirna 组合的准确度计算为(198+89)/334，即0.859。为了排除不同样本的分布不平衡对准确度计算造成的偏差，对每组mirna组合也计算了相对准确度，即对于某个mirna组合，如果其特异性为0.868，灵敏性为0.840，则相对准确度为 (0.868+0.840)/2，即0.854。相对准确度不受癌样本和非癌样本数量不平衡的影响，因此更能直接反应出mirna组合对样本预测的准确性。
[0408]
如图5b所示，每一组测试的mirna组合均具有较好的灵敏度，特异性和准确性。20组最佳mirna组合的平均灵敏度是86.9％，平均特异性是85.2％，平均准确度是85.7％，平均相对准确度(排除了非膀胱及泌尿道上皮癌样本分布不平衡的影响)是86.0％。例如，第11b组mirna组合得到的灵敏度是87.7％，特异性是86.0％，准确度是86.5％，平均相对准确度是86.9％(图1a)。roc 曲线的曲线下面积(auc)为0.914(图1b)。
[0409]
这20组mirna组合总共涉及16个mirna。这16个mirna组成的其他多种组合经验证，也表明能够以相似的灵敏度、特异性和准确性来区分膀胱及泌尿道上皮癌组和非膀胱及泌
尿道上皮癌组的效果。
[0410]
实施例7膀胱及泌尿道上皮癌特异性mirna标志物的盲检验证
[0411]
按照实施例2、3、4的方法检测339例盲样本，用实施例6中确定的20组 mirna组合并通过svm的统计学方法，计算每个盲样本的表达模式得分，再与阈值比较，得出所述盲样本是否为非膀胱及泌尿道上皮癌组的结论。揭盲后，按照实施例6所述的方法，计算每组mirna在对盲样本的预测中的特异性、灵敏度、准确度和相对准确度。
[0412]
如图6所示，在检测膀胱及泌尿道上皮癌盲样本时，选择的20组mirna 标记物组合中的每一组均具有较好的灵敏度，特异性、准确性和相对准确度(图 6)。20组mirna组合的平均灵敏度是85.4％，平均特异性是78.1％,平均准确度是81.3％，平均相对准确度(排除了非膀胱及泌尿道上皮癌样本与膀胱及泌尿道上皮癌样本分布不平衡的影响)是82.2％。例如，组合11b检测样本灵敏度86.8％，特异性81.7％，准确率为83.5％，平均相对准确度是84.2％。盲检测样本检测结果充分验证了所用模型的可靠性和稳定性以及进一步验证了所选择的mirna标志物。
[0413]
可见本发明mirna指纹图谱能够高效和准确地区分膀胱及泌尿道上皮癌和非膀胱及泌尿道上皮癌。尤其是能很好地区分正常样本与膀胱及泌尿道上皮癌样本。
[0414]
实施例8膀胱及泌尿道上皮癌特异性mirna标志物的核心mirna组成
[0415]
实施例6所得的20个mirna组合包括了16个mirna。图7中小结了这些 mirna序列在20个mirna组合中的出现频率，在膀胱及泌尿道上皮癌样本及非膀胱及泌尿道上皮癌样本中的表达水平，以及表达水平在癌症样本到非癌症样本的变化量。
[0416]
如图7所示，hsa-mir-99a的出现频率是100％。hsa-mir-141，hsa-mir-151-5p, hsa-mir-96的出现频率都是90％。hsa-mir-125b，hsa-mir-183，hsa-mir-1260, hsa-mir-133a，hsa-mir-429，hsa-mir-143#等6个mirna也都有很高的出现频率(65～85％)。
[0417]
这16个mirna在膀胱及泌尿道上皮癌样本的表达与在非膀胱及泌尿道上皮癌样本的表达的变化情况是：hsa-mir-96(dct-3.35)，hsa-mir-151-5p(dct
ꢀ-
3.29),hsa-mir-183(dct-3.14),hsa-mir-29c(dct-2.97)，hsa-mir-141(dct
ꢀ-
2.64)，hsa-mir-29c#(dct-2.37)，hsa-mir-429(dct-2.35)的表达水平明显升高(dct小于-2)；hsa-mir-152(dct-1.17),hsa-mir-27b(dct-1.17), hsa-mir-100(dct-1.06)的表达水平升高(dct在-1至-2之间)；hsa-mir-1260 (dct-0.79),hsa-mir-497(dct-0.67),hsa-mir-125b(dct-0.57)的表达水平稍微升高(dct在0至-1之间)；hsa-mir-99a(dct 0)的表达水平不变；hsa-mir-143# (dct 0.35)，hsa-mir-133a的表达水平稍微降低(dct在0至1之间)(见图7)。 ct值反映mirna的表达水平，ct值越大，表明表达水平越低，ct值越小，则表达水平越高。dct值反映在两个样本中的表达量的差异。如果从癌样本到正常样本的dct值为正值，则表明该mirna在癌样本中表达低，在正常样本中表达高；dct值为负值，则表明该mirna在癌样本中表达高，在正常样本中表达低。dct值的绝对值越大，表明该mirna在癌样本和正常样本中的表达差异越大。
[0418]
如图7所示，hsa-mir-96，hsa-mir-151-5p,hsa-mir-183,hsa-mir-29c，hsa
-ꢀ
mir-141，hsa-mir-29c#，hsa-mir-429在癌样本中的表达水平比正常样本中明显升高，因为dct是负值，而且绝对值比较大，而且在20个mirna组合中出现的频率也比较高。这些mirna在尿液样本表达水平的升高是膀胱及泌尿道上皮癌的重要指标。有意思的是，hsa-mir-99a的表
达水平在膀胱及泌尿道上皮癌样本与在非膀胱及泌尿道上皮癌样本基本不变，但是在20个mirna组合中出现频率为100％。考虑到hsa-mir-99a的表达水平基本不变，其在本申请提供的 mirna组合中可能作为内源对照mirna。hsa-mir-133a在癌样本中的表达水平降低。
[0419]
基于此：hsa-mir-96，hsa-mir-151-5p,hsa-mir-183,hsa-mir-29c， hsa-mir-141，hsa-mir-29c#，hsa-mir-429，hsa-mir-99a，hsa-mir-133a是膀胱及泌尿道上皮癌特异性mirna指纹图谱的重要组成。
[0420]
从图5a和图5b可见：组合12只有7个mirna(hsa-mir-99a,hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183，hsa-mir-133a)，这7个 mirna组成的指纹图谱就可以准确地判断膀胱及泌尿道上皮癌。组合11，组合 11a，组合11b，组合11c都只有9个mirna(hsa-mir-99a,hsa-mir-141, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b,hsa-mir-183，hsa-mir-1260， hsa-mir-133a，hsa-mir-429)，这9个mirna组成的指纹图谱可以更准确地判断膀胱及泌尿道上皮癌。
[0421]
实施例9对比例：膀胱及泌尿道上皮癌特异性mirna标志物的核心mirna 组成
[0422]
以前的研究报道了一些与膀胱癌可能有关的mirna，例如hsa-mir-141， hsa-mir-96，和hsa-mir-133a(例如，请参见：enokida h等,the role of micrornas in bladder cancer.investig clin urol 2016；57suppl 1:s60-76.)。为了与本发明的 mirna组合做比较。我们进行了如下分析：
[0423]
分析1：只用hsa-mir-141(seq id no:2)一个mirna标志物进行建模分析，然后双盲预测。
[0424]
分析2：只用hsa-mir-96(seq id no:4)一个mirna标志物进行建模分析，然后双盲预测。
[0425]
分析3：只用hsa-mir-133a(seq id no:8)一个mirna标志物进行建模分析，然后双盲预测。
[0426]
分析4：只用hsa-mir-141,hsa-mir-96，和hsa-mir-133a这三个mirna标志物的组合进行建模分析，然后双盲预测。
[0427]
分析5：使用hsa-mir-141(seq id no:2)以及从seq id no:17到seq id no: 128的总共113个mirna及对照(见图3)，进行建模分析，然后双盲预测。本组mirna组合中不包括seq id no:1，3-16(见图7)的15个mirna。
[0428]
分析6：使用hsa-mir-96(seq id no:4)以及从seq id no:17到seq id no: 128的总共113个mirna及对照(见图3)，进行建模分析，然后双盲预测。本组mirna组合中不包括seq id no:1-3，5-16(见图7)的15个mirna。
[0429]
分析7：使用hsa-mir-133a(seq id no:8)以及从seq id no:17到seq id no: 128的总共113个mirna及对照(见图3)，进行建模分析，然后双盲预测。本组mirna组合中不包括seq id no:1-7，9-16(见图7)的15个mirna。
[0430]
分析8：使用hsa-mir-141，hsa-mir-96，hsa-mir-133a以及从seq id no:17到 seq id no:128的总共115个mirna及对照(见图3)，进行建模分析，然后双盲预测。本组mirna组合中不包括seq id no:1，3，5-7，9-16这13个mirna。同时对比了使用mirna组合11b(见图5a)的seq id no:1-9这9个mirna 标志物的组合进行建模分析和双盲检测的结果。
[0431]
图8总结了从分析1到分析8准确度最好的建模分析及预测双盲样本的结果, 并与
我们发现的mirna组合-11b的建模分析及预测双盲样本的结果比较。
[0432]
训练集样本以及建模的方法与实施例5相同，区别仅在于用于建模的mirna 组合使用的是如本实施例所述。
[0433]
如图8所示，分析1至分析4使用hsa-mir-141、hsa-mir-96、hsa-mir-133a 中的单个或全部mirna标记物，其对建模样本和双盲样本的预测准确度都明显小于其他的mirna组合的分析。有趣的是，如图8所示，分析5到分析8使用了113到115个mirna标记物，但其预测双盲样本时的灵敏度仅为0.6，相对准确度仅为0.7。而本发明的mirna组合11b仅使用9个mirna，用于预测同样的双盲样本时，其灵敏度和相对准确度均达到0.8以上，比分析5到分析8高出 30％以上。这表明mirna组合中的具体mirna的组成(而不是mirna的数量) 对于预测结果的准确性起到了关键作用。
[0434]
此外，分析5到分析8的mirna组合都使用了被认为与膀胱癌有关的三个 mirna(hsa-mir-141、hsa-mir-96、hsa-mir-133a)中的一个或全部。但分析5 到分析8中使用的mirna组合中没有包括到本申请中提供的mirna组合中的大部分mirna(例如seq id no:1，3，5-7，9-16中一个或多个)。即使当它们与其他mirna组合时，即与本申请提供的mirna指纹图谱以外的mirna进行组合时，也不能对未知样本提供理想的预测结果。如图8所示，分析5到分析8 预测双盲样本时的灵敏度仅为0.6，相对准确度仅为0.7，远低于本发明提供的mirna组合预测双盲样品的灵敏度及相对准确度。这表明，本申请提供的mirna 组合中具体mirna的组成在预测膀胱及泌尿道上皮癌的准确性上具有意想不到的优势。
[0435]
实施例10探索其它膀胱及泌尿道上皮癌特异性mirna指纹图谱
[0436]
为了探索其它膀胱及泌尿道上皮癌特异性mirna指纹图谱，我们将673例尿液样本分为两大部分。第一部分为221例建模样本，包括103例膀胱及泌尿道上皮癌样本，60例正常对照样品与非泌尿系统其他癌症样本，58例其它非膀胱及泌尿道上皮癌样本。第二部分为487例盲检测样本(数据分析人员不知道样本的信息)，包括143例膀胱及泌尿道上皮癌样本，166例正常对照样本与非泌尿系统其他癌症样本，178例其它非膀胱及泌尿道上皮癌样本。
[0437]
本实例的mirna检测方法与实例4的mirna检测方法相同。
[0438]
本实例的分析方法与实例5的分析方法相同。
[0439]
本实例用于建模的样本数目与实例6用于建模的样本数目不同。本实例用于双盲验证的样本数目与实例7用于双盲验证的样本数目不同。在本实例中，建模样本为221例，包括103例膀胱及泌尿道上皮癌样本，60例正常对照样本与非泌尿系统其他癌症样本，58例其它非膀胱及泌尿道上皮癌样本。膀胱及泌尿道上皮癌样本：正常对照样本与非泌尿系统其他癌症本：其它非膀胱及泌尿道上皮癌样品的比例大约为1：0.5：0.5。而在实例7中，建模样本为334例，包括106 例膀胱及泌尿道上皮癌样本，121例正常对照样本与非泌尿系统其他癌症样本， 107例其它非膀胱及泌尿道上皮癌样本。膀胱及泌尿道上皮癌样本：正常对照样本与非泌尿系统其他癌症样本：其它非膀胱及泌尿道上皮癌样本的比例大约为1： 1：1。
[0440]
在本实例中，用实施例6确定的20组mirna指纹图谱中的16个mirna (hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b, hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#, hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,hsa-mir-152,hsa-mir-100,hsa-mir-27b，和 hsa-mir-497)进行建模分析，然后盲样本预测。
[0441]
图9总结了盲样本预测准确度最好的20组mirna组合。这20组mirna 组合共含有10个mirna，包括hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a, hsa-mir-141,hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-29c#, hsa-mir-99a,hsa-mir-96。其中组合1至组合3含有7个mirna，包括hsa-mir-100, hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141,hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-29c,组合4至组合14含有8个mirna，包括hsa-mir-100,hsa-mir-125b, hsa-mir-133a,hsa-mir-141,hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c, hsa-mir-99a,组合15至组合18只含有9个mirna，包括hsa-mir-100, hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141,hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p, hsa-mir-29c,hsa-mir-99a，hsa-mir-29c#,组合19至组合20只含有9个mirna，包括hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141,hsa-mir-143#, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-99a,hsa-mir-96。这些分析结果表明：8个 mirnas(hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141,hsa-mir-143#, hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-99a)，可以组成准确度最高的膀胱与泌尿道上皮癌特异性的指纹图谱。
[0442]
图10显示了这8个mirna(hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a, hsa-mir-141,hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-99a)在癌症样品与正常样品表达水平的差异，及它们在20组膀胱与泌尿道上皮癌特异性的指纹图谱中的出现频率。
[0443]
本申请提供的20个mirna组合(图5)，以及这20组合中的16个mirna (hsa-mir-99a,hsa-mir-141,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-96,hsa-mir-125b, hsa-mir-183,hsa-mir-1260,hsa-mir-133a,hsa-mir-429，hsa-mir-143#, hsa-mir-29c#,hsa-mir-29c,hsa-mir-152,hsa-mir-100,hsa-mir-27b，和 hsa-mir-497)的其他组合方式都被证明能够准确区分膀胱及泌尿道上皮癌样本和非膀胱及泌尿道上皮癌样本，尤其是区分正常样本和膀胱及泌尿道上皮癌样本，并且灵敏度高，特异性强。
[0444]
进一步，本申请提供的另外20个mirna组合(图9，以及这20组合中的 10个mirna，(hsa-mir-100,hsa-mir-125b,hsa-mir-133a,hsa-mir-141, hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c,hsa-mir-29c#,hsa-mir-99a, hsa-mir-96)，尤其是其中的8个mirna(hsa-mir-100,hsa-mir-125b, hsa-mir-133a,hsa-mir-141,hsa-mir-143#,hsa-mir-151-5p,hsa-mir-29c, hsa-mir-99a)，能够准确区分膀胱及泌尿道上皮癌样本和非膀胱及泌尿道上皮癌样本，尤其是区分正常样本和膀胱及泌尿道上皮癌样本，并且灵敏度高，特异性强。
[0445]
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。