芥蓝BoWRKY33基因及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及芥蓝bowrky33基因及其在对芸薹链格孢(alternariabrassicicola)导致的黑斑病抗性中的应用。

背景技术：

芸薹属蔬菜是中国栽培面积最大、总产量最高、消费量最大的蔬菜，芸薹属蔬菜的生产在亚洲和世界上其他地区的蔬菜供应中具有不可估量的重要作用。芸薹链格孢是一类死体营养型的真菌，其造成的黑斑病对十字花科芸薹属作物具有严重的危害性。属于芸薹属甘蓝类的芥蓝是一种中国特产蔬菜，其生产过程中易受到芸薹链格孢的侵染，影响其产量及其产品的品质和安全性，挖掘芥蓝对抗芸薹链格孢的抗性基因，并解析其功能和作用机制具有重要的生物学意义和经济价值。

链格孢菌属于菌物界，真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、链格孢属。芸薹链格孢属于链格孢菌的一种，是腐生型的真菌，主要寄生在芸薹属植物中，对芸薹属蔬菜的外观和产量具有严重的影响。芸薹链格孢还是导致植物黑斑病的主要真菌，其病斑多为圆形或近圆形，常有轮纹，具暗色霉层，对芸薹属植物的根、茎、叶和花都有严重的影响，抑制植物的生长。黑斑病对于十字花科类蔬菜的危害仅次于病毒病、软腐病和霜霉病。以大白菜为例，黑斑病在我国东北、西北和华北地区流行性爆发，严重地区发病率甚至达到了100％，造成严重的经济损失，而各种甘蓝类蔬菜的黑斑病也严重影响其产量和产品器官的商品性，造成很大的经济损失。

芥子油苷及其降解产物还在病原菌入侵的过程中起着至关重要的作用。植物对病原体或昆虫相关的防卫反应类似于动物先天的免疫防御，其过程往往伴随着胼胝质的形成，而胼胝质的形成又与植物激素乙烯和植物此生代谢物质吲哚类芥子油苷相关。吲哚类芥子油苷及其降解产物是芸薹属植物中非常重要的次生代谢物质，在植物对抗生物胁迫中发挥了重要作用。芥蓝中含有丰富的芥子油苷。

前人的研究表明，在拟南芥中，wrky33参与到植物抵抗生物胁迫等免疫反应中，对病原菌有广谱的抗性，在这个过程中，wrky33通过调控植物激素信号途径和植物次生代谢物质的代谢途径而发挥重要的作用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种提高芥蓝对芸薹链格孢抗性的基因以及蛋白质。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种调控芥蓝芸薹链格孢抗性的基因bowrky33，该基因具有seqidno：1所示的核苷酸序列。

本发明同时提供了一种上述基因编码的蛋白质，该蛋白质具有seqidno：2所示的蛋白质序列。

本发明还同时提供了含有上述基因的质粒以及含有上述基因的植物表达载体；包括基因过表达载体35spro::bowrky33-yfp，基因沉默vigs载体bowrky33-pty。

本发明还同时提供了一种宿主细胞，该宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞。

本发明还同时提供了上述基因的用途：用于构建转基因芥蓝，所述转基因芥蓝能够提高对芸薹链格孢的抗性。

bowrky33基因是芥蓝抗性相关的关键转录因子，属于第i类wrky转录因子。经本发明的研究表明，来源于芥蓝的芸薹链格孢抗性基因——转录因子bowrky33通过调控吲哚族芥子油苷的非典型性降解，从而在对抗芸薹链格孢中发挥着重要的作用。

芸薹链格孢对拟南芥野生型是不亲和的，对拟南芥产生的危害十分轻微，而对包括芥蓝在内的芸薹属蔬菜而言，芸薹链格孢引起的黑斑病会造成蔬菜叶、茎、花和角果的坏死和腐烂，严重影响芸薹属蔬菜的外观和产量。本发明首次发现了芥蓝中对抗黑斑病的抗性基因bowrky33，并验证了其能够正向调控芥蓝对芸薹链格孢黑斑病的抗性，给分子育种和基因工程改良芸薹属蔬菜的抗性品质提供了技术基础和理论支撑。

本发明通过对bowrky33基因的克隆、转基因技术和基因沉默构建芥蓝材料，在提高芥蓝和其他芸薹属蔬菜对芸薹链格孢导致的黑斑病的抗性方面，具有很好的应用前景。

综上所述，本发明首次构建了芥蓝bowrky33vigs基因沉默植株和异源过表达35spro::bowrky33-yfp拟南芥材料，并进行功能研究。通过芸薹链格孢接种实验，发现bowrky33基因调控芥子油苷在芥蓝抗芸薹链格孢黑斑病病害中起到正向调控作用。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是bowrky33在芥蓝不同组织部位的相对表达量。

图2是bowrky33基因异源过表达株系中bowrky33基因的表达量和芥子油苷相关基因的表达量；

其中，左图为bowrky33基因异源过表达株系中bowrky33基因的表达量；wt代表野生型，bowrky33ox-1、bowrky33ox-3和bowrky33ox-4代表不同的异源bowrky33过表达拟南芥株系；

右图为bowrky33基因异源过表达株系中芥子油苷相关基因的表达量；myb51代表芥子油苷转录因子，cyp83b1、cyp81f2、igmt1和igmt2代表芥子油苷的合成基因，pen2代表芥子油苷的降解基因。

图3是bowrky33vigs基因沉默芥蓝株系中bowrky33基因的表达量和芥子油苷相关基因的含量；

其中，pty代表对照组，pty-2和pty-3代表不同的bowrky33vigs基因沉默芥蓝株系。bomyb51.1为芥蓝中芥子油苷转录因子，bocyp81f2.1、boigmt1和boigmt2代表芥蓝中芥子油苷的合成基因，bopen2代表芥蓝中芥子油苷的降解基因。

图4是bowrky33基因异源过表达株系中植株对芸薹链格孢的抗性表型及菌斑面积统计；

其中，35s：bowrky33表示bowrky33基因异源过表达植株。

图5是bowrky33vigs基因沉默株系中植株对芸薹链格孢的抗性表型及菌斑面积统计；

其中，pty为接种空载的对照组，wrky33-pty为bowrky33vigs基因沉默植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

一、获得芥蓝bowrky33基因全长序列：

用ncbiprimerdesigntool设计全基因扩增引物，以brassicadatabase(brad，http：//brassicadb.org)中甘蓝(brassicaoleracea)的cds序列为参考。取种植在浙江大学农生环的培养室的芥蓝‘四季粗条’叶片cdna为模版(cdna的提取方式为常规技术，例如可参照cn104561025a)，设计特异性引物，用primerstar高保真酶pcr扩增bowrky33片段。

引物序列为：smai-bowrky33-f:tctagacccgggatggctgcttcttccctcct

bamhi-bowrky33-r:agtggatcccgacaagaacgaatcaaaaaacga

pcr扩增反应体系：2xprimerstarbuffer25ul、dntpmixture5ul、primerstardnapolymerase1ul、ddh2o16ul、cdna1ul、上下游引物各1ul，共50ul。pcr反应程序为：94℃预变性90秒；94℃变性30秒，57℃退火45秒，72℃延伸1分30秒，35个循环；最后72℃终延伸5分钟，将获得的pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后将扩增条带用axygendna凝胶试剂盒回收纯化，将回收产物构建到pcambia1300-yfp载体上，将上述重组质粒送到擎科公司测序确认。

所得的基因bowrky33的核苷酸序列如seqidno：1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seqidno：2所示。

二、bowrky33基因过表达载体的构建

bowrky33过表达载体的构建，以pcambia1300-yfp(cambia公司)为终载体，构建具有camv35s重组型过表达启动子的35spro:bowrky33载体。将第一步中扩增获得的bowrky33片段和载体pcambia1300-yfp通过smai和bamhi(37℃，1小时)进行酶切，再通过t4dnaligase(takara，japan)16℃反应14小时将片段链接到酶切后的pcambia1300-yfp上，获得重组质粒35spro:bowrky33。

反应后将35spro:bowrky33质粒转入大肠杆菌感受态dh5α中。用卡那霉素(kan)抗性的lb固体培养基进行筛选，并用菌落pcr筛选出带有目的片段的重组质粒(满足大小为1473bp条带的，即为35spro:bowrky33重组质粒)，测序鉴定。用dnaman软件分析测序结果。正确转化子命名35spro:bowrky33。

三、bowrky33vigs基因沉默载体的构建

在bowrky33的seqidno：1中寻找5’端以ntag，ntaa或者ntga开头的40bp的寡核苷酸序列，然后在这段序列后加上其反向互补序列组成长度为80bp的自定义寡核苷酸序列作为目的片段，将目的片段与载体pty进行酶切连接。80bp的片段为：

ttgattcccctgcttttgttgcctcctctgctaacgttctagaacgttagcagaggaggcaacaaaagcaggggaatcaa。

具体步骤如下：

用snabi限制性内切酶酶切pty质粒(methodsinmolecularbiology，2013，vol.975，197-210)，在37℃的金属浴里过夜(12-14小时)对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并回收10045bp大小的线性片段。用碱性磷酸酶处理上述snabi酶切后的pty质粒，纯化试剂盒纯化回收，测定浓度。用磷酸激酶处理寡核苷酸序列(80bp)，在37℃的金属浴里放置30分钟，取出后利用纯化试剂盒对其进行纯化回收。按照t4连接酶使用说明，将碱性磷酸酶处理后回收的pty质粒和退火后的80bp寡核苷酸进行连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α，氨苄青霉素(amp)抗性筛选。挑取阳性克隆进行菌液pcr验证以及测序验证。测序结果正确的阳性克隆，如果为阳性克隆，会得到560b左右的片段(seqidno：3)，测序正确载体命名为bowrky33-pty。

四、bowrky33基因异源过表达拟南芥和bowrky33vigs基因沉默芥蓝的构建

将含有重组质粒35spro:bowrky33的农杆菌gv3101接种于200mllb液体培养中，28℃200rpm振荡培养至对数生长后期(od600为1左右)。4000rpm离心10分钟，收集菌体，加入200ml浸染液(蔗糖50g·l-1，ms盐2.2g·l-1,silwet100μl·l-1,6-ba10μl·l-1)悬浮菌体。将处于盛花期的拟南芥col-0植株横置，让花序浸泡在悬浮液中10分钟。将浸染转化后的拟南芥植株平放并保湿状态下置于22℃培养间中暗培养过夜，然后将其直立正常培养。待种子成熟并干燥后，收集种子，播种于1/2ms抗性筛选培养基上，鉴定阳性转化植株。将t1代种子单株收获后，再将各单株的种子分别播种于潮霉素培养基上，观察t2代分离情况，直至获得稳定纯合的转基因株系---bowrky33基因异源过表达拟南芥。

在营养钵中播种芥蓝种子，16h光照，8小时黑暗，环境温度为25℃，环境相对湿度为60％左右。三叶一心时侵染植物叶片。侵染前浇足水对植株进行16-24h的暗处理。侵染时每棵植株大约用3μg的bowrky33-pty质粒，对照组每株接种空载pty质粒。侵染前将少量的绿色碳化硅均匀的撒在植物的两片叶子上，随后用移液枪吸取适量的质粒溶液滴在植物叶片上，并轻轻的来回摩擦3-4次，1-2分钟后，用纯净水冲洗摩擦过的地方15秒，并用吸水纸将多余的水分吸干净。接种后在黑暗条件下生长12小时后再将植物放回正常的生长环境。

备注说明：满足种子在潮霉素(50mg/l)的培养基上长侧根与未长侧根的分离比符合3：1、且基因表达量升高两倍以上条件的属于过表达；满足种子基因表达量降低50％以上条件的属于vigs基因沉默。选取基因转录水平较高的3个过表达株系bowrky33ox-1、bowrky33ox-3和bowrky33ox-4和转录水平较低的2个基因沉默的株系pty-2和pty-3作为研究对象。

五、rna的提取和表达分析

采用trizol提取方法提取rna(takara,japan)，然后稍作修改。首先，将植物材料用液氮冷冻，在研磨仪(60赫兹，60秒)磨成粉末后加入1ml提取液，剧烈震荡2min，室温静置5min。之后加入200μl氯仿，剧烈摇荡2min，用4℃离心机12000rpm离心15分钟，将最上层水相转移至至新的去除rna降解酶的离心管中，重复此步骤一次。接下来，加入等体积的异丙醇，室温静置10min，4℃离心机12000rpm离心10min。弃上清，加入1ml的75％乙醇洗涤沉淀，4℃离心机12000rpm离心5min，重复此步骤一次，室温干燥10分钟，将沉淀溶解于30μldepc水中。用nanodrop测量浓度，接下来使用primescriptrtmastermix(takara,japan)将rna反转录为cdna。实时定量pcr(real-timeqpcr)使用试剂为sybrgreenpcrmastermix(takara,japan)，仪器为appliedbiosystemssteponereal-timepcrsystems(appliedbiosystems,usa)。使用拟南芥atacin7和芥蓝boactin7为内参基因，基因相对表达量采用2^-δδct方法分析计算。

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根据图1得知，bowrky33在芥蓝根(root)和叶(leaf)中的相对表达量最高，在角果(silique)中的表达量最低。根中bowrky33的相对表达量为角果中的111倍，叶中相对表达量为角果的91倍。芥蓝花(flower)和种子(seed)中的bowrky33的相对表达量倍数处于中间的水平，分别为角果的8和24倍。bowrky33在芥蓝叶中的相对表达量非常高，意味着其对芥蓝的营养品质和抗性品质的影响较大。

根据图2得知，不同株系的异源bowrky33过表达拟南芥bowrky33ox-1、bowrky33ox-3和bowrky33ox-4中bowrky33的表达量不同程度的上升，芥子油苷转录因子myb51，芥子油苷的合成基因cyp83b1、cyp81f2、igmt1和igmt2，芥子油苷的降解基因pen2在异源bowrky33过表达拟南芥中表达量均相较于野生型wt上升。

根据图3得知，不同株系的bowrky33vigs基因沉默芥蓝pty-2和pty-3中，bowrky33的基因表达量均下降至对照组的20％左右，芥蓝中芥子油苷转录因子bomyb51.1，芥蓝中芥子油苷的合成基因bocyp81f2.1、boigmt1和boigmt2，芥蓝中芥子油苷的降解基因bopen2相较于对照组pty出现不同程度的下调。

结合图2和图3的基因表达量结果，可得知：芥蓝bowrky33正向调控芥子油苷的相关的基因的表达。

六、芸薹链格孢黑斑病病害研究

芸薹链格孢的培养采用是pda(potatodextroseagar)培养基，将活化的芸薹链格孢用灭菌移液枪头在pda培养基划线，用封口膜将培养皿封好，在20～25℃培养8～10天，然后收集孢子。用无菌水对分生孢子进行洗脱，用4层纱布过滤，用血球计数器进行统计，把分生孢子配成浓度为5×10⁵个/ml。待拟南芥生长四周后，用移液器吸取5μl点滴在叶片的中央，然后用封口膜封好置于22℃下培养，保湿3-4天观察发病情况并统计病斑大小，每组实验至少重复3次。

芥蓝的芸薹链格孢接种步骤与拟南芥类似，取生长状态类似的芥蓝叶片，取分生孢子浓度为5×10⁵个/ml的孢子悬浮液进行接种，用移液器吸取100μl点滴在叶片的中央，4到5天后观察菌斑面积大小。菌斑面积统一拍照后，用imagej软件进行测量和统计。

根据图4得知：过表达35s：bowrky33株系植株发病病况较轻；根据图5得知：基因沉默株系wrky33-pty芥蓝植株发病严重。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江大学

<120>芥蓝bowrky33基因及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1473

<212>dna

<213>芥蓝(brassicaoleraceavar.alboglabrabailey)

<400>1

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<211>490

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<400>2

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<213>芥蓝(brassicaoleraceavar.alboglabrabailey)

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