本发明涉及植物分子生物学
技术领域：
：，具体涉及一种玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1基因突变体及其分子标记和应用。
背景技术：
：：镉是重要的工业原料，同时也是毒性最大、分布最广泛的重金属污染物之一。根据镉浓度土壤镉污染可分为轻度(0.3-0.6mg/kg)、中度(0.6-0.9mg/kg)和重度(0.9mg/kg以上)三个等级。食品安全国家标准(gb2762-2017)规定谷物及其制品种镉污染物限量指标为0.1mg/kg以下。玉米是我国第一大粮食作物，其种植面积大、种植范围广，且品种间遗传变异大。已有研究表明，不同玉米品种间镉积累能力存在显著差异。杜彩艳等对20个广泛种植的不同玉米品中的镉含量进行分析，发现在镉污染农田种植后，不同玉米品种间的根系、茎叶以及籽粒中镉含量均表现出显著差异(杜彩艳等，2017，农业环境科学学报，36:16-23)。因此，筛选镉积累量低的玉米品种，尤其是降低玉米籽粒部位的镉积累量，对保障玉米食用安全具有重要意义。前期研究通过全基因组关联(gwas)定位、玉米突变体等位测验和序列差异分析等鉴定到一个控制玉米籽粒镉低积累的基因zmcd1，并根据该基因在启动子位置的插入突变开发了该位点特异性分子标记pcr-zmcd1(专利申请号：2019113183319)。但该分子标记针对于zmcd1基因启动子位置的插入突变，故不能对其他突变进行准确鉴定。技术实现要素：本发明的目的是提供一种籽粒镉低积累控制基因zmcd1基因突变体，本发明的另一目的是提供该基因突变体的分子标记和应用。为实现上述目的，本发明对镉积累高或镉积累量低的玉米种质资源进行了大量的序列分析、遗传和性状研究，对镉高积累玉米自交系ky21的zmcd1(玉米籽粒镉低积累控制基因)dna序列进行分析发现，ky21中zmcd1在第4内含子存在12959bp的转座子插入突变，导致转录本中部分内含子以及部分插入序列外显子化，以及转录本长度变短，从而导致玉米自交系ky21镉高积累，该突变型基因命名为zmcd1-2。具体而言，本发明提供的玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1基因突变体，其序列信息是以玉米b73野生型zmcd1基因的核苷酸序列为参考序列，所述zmcd1基因突变体相对于野生型zmcd1基因包含在第4内含子第9位碱基后存在12959bp的转座子插入突变，所述12959bp的核苷酸序列如seqidno.1所示。以上所述玉米b73野生型zmcd1基因的核苷酸序列参考登录号为zm00001d005190(maizegdb,https://www.maizegdb.org/)。本发明提供了与玉米籽粒镉高积累相关的indel分子标记，其为以玉米b73野生型zmcd1基因的核苷酸序列为参考序列，在zmcd1基因第4内含子第9位碱基后存在12959bp的转座子插入突变，所述12959bp的核苷酸序列如seqidno.1所示。进一步地，为了准确检测到该突变体或所述的indel分子标记，本发明开发了新的位点特异性分子标记，可用于携带该突变类型zmcd1-2玉米的准确鉴定，并且可应用于该突变类型玉米籽粒镉积累量改良育种中。本发明提供的用于检测所述基因突变体或所述indel分子标记的特异性引物组，含有3条引物，其核苷酸序列分别如seqidno.2-4所示。本发明提供一种检测试剂盒，含有3条引物，其核苷酸序列分别如seqidno.2-4所示。本发明提供了所述基因突变体或所述indel分子标记的检测试剂、或所述的特异性引物组、或所述的检测试剂盒的以下任一种应用：(1)在玉米分子辅助育种中的应用。(2)在筛选镉高积累玉米品种、或镉低积累玉米品种中的应用，若筛选为镉高积累玉米，根据育种需要保留或弃用该玉米品种。(3)在早期预测玉米是否为镉高积累、或镉低积累玉米中的应用。(4)在玉米种质资源改良中的应用。本发明还提供一种鉴定镉高积累玉米的方法，包括以下步骤：(1)提取待测玉米的基因组dna；(2)以步骤(1)中提取的dna为模板，利用本发明所述的特异性引物组(含有seqidno.2-4所示引物)进行pcr扩增反应；(3)若扩增产物片段大小为965bp，则待测玉米为镉高积累玉米。本发明提供一种鉴定镉低积累玉米的方法，包括以下步骤：(1)提取待测玉米的基因组dna；(2)以步骤(1)中提取的dna为模板，利用本发明所述的特异性引物组(含有seqidno.2-4所示引物)进行pcr扩增反应；(3)若扩增产物片段大小为529bp，则待测玉米为镉低积累玉米。本发明的有益效果在于：本发明提供了新的zmcd1基因突变体zmcd1-2，该突变体可使得玉米表现为镉高积累。该突变体相对于野生型zmcd1基因在第4内含子第9位碱基后存在12959bp的转座子插入突变。本发明提供的用于检测该突变体或分子标记的特异性引物，可用于zmcd1-2突变类型的镉高积累玉米的准确筛选鉴定，以及镉低积累玉米的准确筛选鉴定，还可用于对zmcd1-2类玉米籽粒镉积累量的改良育种，大大缩短了鉴别和育种进程，提高了育种效率，适于推广应用。附图说明图1为玉米籽粒镉低积累控制基因等位变异zmcd1-2基因结构示意图。与镉低积累玉米自交系b73(籽粒镉含量为0.045mg/kg)相比，镉高积累玉米自交系ky21(籽粒镉含量为0.14mg/kg)在zmcd1基因的第4个内含子位置存在gypsy类ltr反转座子插入突变。图2为b73和ky21的zmcd1转录本比较图。b73中zmcd1转录本包含5个外显子，ky21中其等位变异zmcd1-2有两个转录本，第5个外显子均不转录，一个转录本在第4个外显子后面有130bp的转座子插入序列和9bp的内含子序列，共139bp被外显子化(黑色)。第二在第4个外显子后面有216bp的转座子插入序列被外显子化(黑色)。1219f为基因特异性引物。利用1219f引物和3'-race试剂盒中的3'race引物获取完整3’末端序列。图3为pcr-zmcd1-2对b73和ky21中zmcd1基因分型图。功能分子标记pcr-zmcd1-2对镉高积累玉米自交系ky21(0.14mg/kg)和镉低积累玉米自交系b73(0.045mg/kg)的基因分型检测结果。pcr产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。m：dnamarker2000。泳道1和2分别为b73和ky21。图4为pcr-zmcd1-2对gwas群体中8个镉高积累和8个镉低积累玉米自交系基因分型图。功能分子标记pcr-zmcd1-2对9个镉高积累玉米自交系和9个镉低积累玉米自交系的基因分型检测结果。pcr产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。m：dnamarker2000。泳道1-9为携带zmcd1-2突变的镉高积累玉米自交系，分别为：cimbl138，cimbl142，cimbl61，cimbl62，gems24，gems25，gems32，si434，zi330；泳道10-18为镉低积累玉米自交系，分别为：238，647，832，4019，5213，526018，05w002，05wn230，a619。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本申请中所有玉米材料均来自于北京市农林科学院玉米研究中心玉米种质资源。实施例1玉米zmcd1基因突变体zmcd1-2的获得玉米籽粒镉含量测定方法为：玉米在镉污染农田(镉含量为1.8±0.3mg/kg)种植，试验采用随机区组设计，进行四次独立性重复。对于每个独立性重复，同一个玉米自交系种植一排，一排种植10株，排长3m。各自交系排间距为60cm。玉米果穗成熟后晒干脱粒，对于每个自交系的每个重复，取1kg籽粒烘干并粉碎，过100目筛，然后用硝酸-高氯酸消解，最后利用zeenit700p原子吸收光谱仪石墨炉法测定消化液中镉含量(mg/kg)(吴家梅，2019，journalofagro-environmentscience，38：502-509)。用最佳线性无偏预测(简称blup)对4个环境的数据进行整合。玉米自交系ky21为籽粒镉高积累玉米自交系(平均镉积累量0.14mg/kg)，b73为籽粒镉低积累玉米自交系(平均镉积累量0.045mg/kg)。从玉米maizegdb(https://www.maizegdb.org)数据库中下载ky21玉米基因组序列，用玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1的dna序列来检索ky21基因组，来获取ky21中的zmcd1序列。用本地化blast(下载网址为ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/latest/)进行ky21和b73的zmcd1基因dna序列比对，发现在ky21玉米中，zmcd1基因的第4内含子第9bp后面存在12959bp插入，censor软件(https://www.girinst.org/censor/index.php)分析发现该序列属于gypsy类ltr反转座子(见图1)。将zmcd1的该等位变异命名为zmcd1-2。实施例2玉米籽粒镉低积累控制基因等位变异zmcd1-2的cdna序列分析用trizol法提取ky21玉米叶片rna,用反转录试剂盒(takara)将rna反转录成cdna。利用3'-race试剂盒(takara)和位于第4个外显子上的1219f引物(表1)获得第4外显子后面的转录本序列以及完整3’末端序列。相较于b73，测序分析发现ky21中zmcd1-2存在两个长度变短的转录本。第一转录本的第5个外显子不被转录，并且在第4个外显子后面有130bp的转座子插入序列和9bp的内含子序列被外显子化。第二个转录本中第5个外显子也不被转录，并且在第4个外显子后面有216bp的转座子插入序列被外显子化(见图2)。表1位于第4外显子上的用于zmcd1-2基因cdna3'-race的扩增引物引物5′-3′序列1219fctgggcgagatcagggtc实施例3玉米zmcd1基因突变体zmcd1-2的特异性功能分子标记的开发及其应用基于镉高积累玉米自交系ky21和镉低积累玉米自交系b73在zmcd1基因第4内含子中的序列差异，开发pcr功能分子标记pcr-zmcd1-2，其引物信息见表2。利用204f/732r/965r引物，在镉高积累玉米自交系ky21中扩增片段大小为965bp，在镉低积累玉米自交系b73中扩增片段大小为529bp(图3)。表2pcr-zmcd1-2功能分子标记引物信息引物5′-3′序列204fgacgttctggagtcgctgg965racgtcaagcagataagggcc732rggtcctacagtcgtccgagapcr扩增条件为：94℃5min，然后94℃25s,61℃25s,72℃50s进行35个循环，最后72℃延伸10min。pcr扩增产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。用所开发的pcr-zmcd1-2标记对gwas群体中携带和不携带该等位变异的共18个玉米自交系进行检测，发现9个籽粒镉高积累玉米自交系cimbl138，cimbl142，cimbl61，cimbl62，gems24，gems25，gems32，si434，zi330(平均籽粒镉含量均高于0.1mg/kg)中扩增片段大小均为965bp，而9个低积累玉米自交系238，647，832，4019，5213，526018，05w002，05wn230，a619(平均籽粒镉含量均低于0.1mg/kg)中扩增片段大小均为529bp(图4)，表明该pcr功能分子标记可以将籽粒镉高积累和镉低积累玉米自交系区分开。表3所用的玉米自交系籽粒镉含量虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>北京市农林科学院湖南省作物研究所<120>一种玉米籽粒镉低积累控制基因zmcd1基因突变体及其分子标记和应用<130>khp201114952.5<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>12959<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgttaacaactccgatcactccacagagaataagaacgagaagaacggagaagtagagca60gagtggcggctgaagtagttggccttggggaagaggaaaggaattacagagttcagtttt120ctcgatacccttcctttctctcaccgcttacatatactctcttacatgggcttaattcac180ccaccacggtccagttactttagtactagcctgcttcatacgactcgaacggcgcctcgc240tccatctcctgttccgcgttcttcttcaacatcagcttctccggtgtcatgttcttcatt300atctccagacttgtcccggccaatgccttgctgcccttcagtgatgcccacattcccccc360tgctaaaatagctgattgcccccaagcagcggcattaggaaactgaatacgtagctgctg420ctcatcctcccaagtcgctagggctggtggcatgaaggaccactgcaccaggacctgtac480accagagtttacaccacgagtaacagttcgtcgctgcagaattttaagaggaacactgaa540acaataatccccagtaggtaatgaaggggaagccacaaacccccgaactgactgcgcgct600tcaactgagaaacatggatcactgggtgaatcttggatgtggctggaagccgcaacttgt660atgcaaccaagccaactctctgttcaatctgaaacggtccaaaaaatttgaacgccacct720tttggtgtgcccttactgctatggacgactgaacatatggctagaaaaacccagtctcca780acagcaaaagaacgctcggatcggcccttatctgcttgacgtttcatacggtgcttggcc840ctttccaaatgttgttttatcacttcagacatcaaatgcctctcctgcaaccaggaactc900agatcacgcgaactgacagtggattctgctgaaatgccaaactgtcgaggctgcgtgcca960tataacgcctgaaacggtgaaataccagtggctgaatgagtggaagaattataccaaaat1020tgtgcaacagacagccatttactccactggtgagggcacgcatgcacaaagcaacggaga1080aagttttccagacattgatttactctttctgattgaccgtccgtttgagggtgatacgct1140gaactcatgcgaagttggacaccggccaaccgaaagagctcctgccataatgtgctaaga1200aagattttatcccgatcagacactatggacgtaggcaacccatgatgcttgtacacctga1260tcgtgaaataggcgagccaccgataaagctgtaaaggggtgcttgagagggaggaagttt1320gcatacttggtaaaagtgtcgacaataaccaaaatgcatgtgtatgattgcgataccggt1380agtgcctcgataaagtccatagtaataatctgccacaacgacgttggtactggtaatggc1440tgcaatagaccgggcaatcgagatcgatcggccttggcttgttgacaaatgagacactga1500cgaacaaactcatgcaccgctttcttcataccatgccatgcaaataattgcttcaacctg1560gcataagtgactggtatgcccgaatgaccaccaatcgccgacacatggaaggctgcaacc1620aaacgctgttgtaactccagtgcagaccctacccagattctatttttgtagcggaggaga1680ccatcgttccatgaataattgggcactgcatttggatcaagagctaatttggtgatcatt1740gttgatgccactgcatcttgtgagtaggaatcaaccatttcagttatccaaagtggtgta1800cccgacgacaaggccaaacaagattccatcgtgtgctgttgtcgggatagtgcatcagca1860gcagtgttgtcaatgccctttttatagacaatccgatattgtagccctaacagacgggtg1920aacattttcttttgccacggtgtatggagacgttgttcatcaagctgaatcagactacga1980tgatcagtatgaatctggaactctttcaactgcagataatgacgccagtgatccacagcg2040acaattatggccaaaaactccttttcatatgttgacagtccctgcagcttgagaccaagg2100gctttgcttaaataagcaattggatggcctgcctgcatcagcaccgcacccactcctaca2160ttactggcgtctgtctcgaggcaaaagggcaaggaaaaattgggaagagccagaaccggt2220gctgtcaccaatgcctgtttcagtgcttgaaaagccgactcatggtctgatgtccagaga2280aatatcgcccccttttttaacagcaatgtcaatggtttggcaatgaccccgaaatggcgc2340acaaaccgccggtaataccctgctagcccgagaaagctacgcaattccttaacattgcca2400ggtgtcttccactgtgcgacagcttgaatcttagatggatctgttgctaccccgtcagct2460gaaatgacatgtcccaaatacgccagctgagactgcgcaaaagaacacttggacactttg2520acctgccatttatcccttgccagcagctccaaaacttgacgaatgtgaacaagatgggca2580ttccaattctcactgtaaatcagaatgtcatcgaaaaagactagtacacaacggcgcagc2640aagggagccaaggtcacattcattgcccgttgaaatgttgctggtgcacctgttagtcca2700aaagccatgacacggaattcatattgcccggaatgggtctggaaggccgtcttgtgcgtg2760tcggatggaagcagccgaatctgatgataaccggcagtaagatcgaggctggtgaaccac2820gaagcattacccaattcatccaataattcttcaatcacgggaaccggaaatattgacttc2880ctggtgatagcattgagatggcgaaagtccacacaaaaacaccatgaattgtccttcttt2940ttaactaacaacacagatgatgaaaaggaacttgtgcttggctgaatgagaccagattga3000agcattactgccacctgtcgctctatttcatccttgatagcgggtgggtaacggtaaggc3060ctgacatgcacggccgttgcaccctgaaccagaggaattgcatgatcacactcccgtgcc3120ggaggtaaacctactggaggggcaaacactgaagcaaactcggagagcagctcaaccaat3180agagggggcagattcatatctgaaaaggaaggaccatcagtgtctatccttgctacctcc3240accacagcacctggcagtaatgctgctgtgaccccatgcagcaaaacagatgactgacca3300tagggaatcaacatccatttgtgcaaccaatggaccttcatggggctgtgttgcgagagc3360caatccattcccacaatgagatgatatgtggacagatccaacacccggaaatctgacaca3420aattcataattttgaactgaccaagaagcccccaacaactggtgagaacactgcatattt3480ccaccatttgcgatcctgactgctacagggcaacccaatgaggacacaccggtcagctta3540ctggccaccgtggaagccaagaaggagtgagaacttcccgagtctatcaagataagaact3600agaatgtcttgaatgaagccttgaaatttcattgtgtttgatgcttcaacaccttgcact3660gctgcgaccgagagcgacaagcactgagttgtatcaacaggaggggcagcttctgtactc3720cttgtttcagattcatcctcagcttgatataaatcccagacttcttgtaacacatgaagt3780tggaccgttggggggcaacgatgatctttcgaccatttttcagcgcagcgttggcacaac3840cctttggctcgacggtacgcacgcagtgccgccatcttatcatcaaaagctcgaggacgt3900gaatgatcccccgtgtggccctcaggtacaccccgtttctccgacgatggtggaagaggt3960agaggaagaggtcccctacccgacgtcttgccagtccatgcccagtcggcacgacgaatc4020tccttcttctcggggcccgacacctcctcctgcaacagggcaagcacgcaggcagcatcc4080aaagaaggtgggcgttgaacgaaaacaacagcacgtatatcagcccgcaacccatctaca4140aatctctggacaaagtacattggatctataagcttcccataagcagtcaaattatccact4200agagaattaaattgctctacatattctgaaaccgatgtggtctgcttaatgtgaaacaag4260cgacggatgaaaatttcgtgctcgtctttgccaaacctctccaacagtaactgacaaaac4320cccaaccacgatgaagctggatactgctcaccaaaagatgatagccaacgagcagcggct4380cccacaaaatgcatggtagccacacgaagccagactgcaggctccaccgagtacatatca4440aaataatcctggctacgccgaatccatagcttggggtttgaaccatcaaaggtagggaaa4500ttgagcttaggtaatcggcctctaactgcacctccccacccattcccctggtcgtcctca4560gcacgtgacaacggcaacgccgggtgacacgatgatgacccatgtaaaacatgctgatga4620aattgcggtgaggacgtaccctttaccgggggatgcagcagggtcgtcact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