一种MdBZR1基因及蛋白在提高苹果耐盐性中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种mdbzr1基因在提高苹果耐盐性中的应用。

背景技术：

土壤盐碱化在世界各地日益严重，在中国尤其严重制约着黄河三角洲区域苹果产业的发展。盐胁迫威胁着苹果植株的正常生长发育及代谢生理活动，生产中常选用抗盐性较强的砧木以缓和盐碱胁迫，但因为其未改变苹果组抗盐性能，其效果并不理想；且由于嫁接手段的局限性，此方法不易于推广。

brassinazoleresistant1(bzr1)转录因子是brs生物合成途径的反馈调节基因。不同物种中bzr1的蛋白质序列均具有bes1_n超家族结构域。bzr1转录因子基因家族较小，与其他家族已知蛋白质没有显着相似性的序列。作为brs信号传导的中心组成部分，bzr1促进植物生长，参与调节光控制的叶开放、细胞分裂和分化等几个生物过程。bzr1是油菜素类固醇(br)信号传导的关键转录因子，并且是许多信号级联的整合点。

bzr1通过蛋白质间的相互作用调节植物生长发育，例如，della，pif，arf6和pkl都直接与bzr1相互作用，形成以bzr1为中心的调节网络调控细胞生长。

棉花的bzr1基因能够显著促进细胞伸长，同源过表达ghbzr1基因，促进了棉花胚珠表面纤维细胞伸长，而ghbzr1表达抑制的棉花植株胚珠表面纤维细胞伸长受到抑制，细胞发育滞后。这些结果表明，bzr1转录因子在植物的生长发育及抵御生物胁迫中起重要作用。研究并探索mdbzr1基因在苹果抗盐性能中的作用，并将其应用于苹果抗盐性的选育中，得到一种更简洁、更高效增加苹果抗盐性的方法，是本领域人员待解决的问题。

技术实现要素：

本发明公开了一种mdbzr1基因在提高苹果耐盐性中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种苹果的mdbzr1基因，序列如序列表seq.id.no.1所示；

所述mdbzr1基因含在苹果根、茎、叶、花、果实以及种子中均能表达；

一种苹果的mdbzr1蛋白质，由mdbzr1基因编码，氨基酸序列如序列表seq.id.no.2所示；

一种mdbzr1基因在提高苹果愈伤组织耐盐性中的应用；

在苹果愈伤组织中，利用强启动子对mdbzr1进行超表达，提高愈伤组织耐盐性；

ga可以提高愈伤组织盐胁迫耐受性；

mdbzr1基因超表达能够提高愈伤组织中的ga含量；

mdbzr1基因超表达能够减少愈伤组织中的mda含量；

mda反应组织膜脂过氧化程度，能反应组织收伤害程度，愈伤组织体内过表达mdbzr1可以减少盐胁迫下愈伤膜脂过氧化程度，从而减少愈伤在盐胁迫下受到的伤害；

一种苹果mdbzr1基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)设计全长序列兼并性引物，引物如下所示：

mdbzr1-f序列为5’-catatgatgacgtcggatggggcgactt-3’，seq.id.no.3；

mdbzr1-r序列为5’-ggatccaatccgagcctttccattcccaagc-3’，seq.id.no.4；

(2)苹果组培叶片rna提取及反转录；

(3)cdna全长序列获得；

一种苹果mdbzr1基因过量表达的方法，包括以下步骤：

(1)mdbzr1基因过量表达载体的构建；

(2)mdbzr1过量表达株系的获得。

综上所述，本发明通过植物基因工程技术，从苹果组培苗中克隆出mdbzr1基因完整编码区段，并验证了该基因的功能，发现采用超量表达mdbzr1基因后愈伤组织抗盐能力明显提高。

附图说明

图1：pcr扩增产物电泳图谱；

图2：qrt-pcr检测转基因愈伤组织的表达，其中wt为空白对照，l1、l2、l3为3个过表达mdbzr1转基因株系；

图3：转入空载体的愈伤(wt)、mdbzr1-oe转基因愈伤组织细胞在nacl处理下生长21天的状态；

图4：转入空载体的愈伤(wt)、mdbzr1-oe转基因愈伤组织细胞在nacl处理下生长21天，愈伤组织鲜重；

图5：转入空载体的愈伤(wt)、mdbzr1-oe转基因愈伤组织细胞在nacl处理下生长21天，愈伤组织mda含量；

图6：转入空载体的愈伤(wt)组织细胞在外施ga3的nacl培养基的生长状态；

表1：转入空载体(wt)、mdbzr1-oe转基因愈伤组织细胞gas含量。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：苹果mdbzr1基因的克隆

一、苹果组培叶片rna提取及反转录

1、植物组织总rna采用rnapreppure多糖多酚植物总rna提取试剂盒(天根)提取，步骤包括：

(1)匀浆：取100mg“gala”组织叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入500μlsl(含25％的β-巯基乙醇)，立即剧烈混匀(涡旋震荡)；

(2)离心2min(12000rpm)；

(3)将上清液转移至过装有收集管的cs滤柱上，离心2min(12000rpm)，将收集管中的上清液转移至新的rnase-free的离心管中，尽量避免吸头吸入收集管中的沉淀及细胞碎片；

(4)上清中缓慢加入无水乙醇(0.4倍体积)，混匀后，将得到的溶液和沉淀一起转入cr3吸附柱中，离心15s(12000rpm)，丢弃收集管内废液，将cr3吸附柱放回收集管中；

(5)向cr3吸附柱中加入rw1去蛋白液350μl，离心15s(12000rpm)，丢弃收集管中的废液，将cr3吸附柱放回收集管中；

(6)配制dnasei工作液：取dnasei储存液10μl放入新的离心管(rnase-free)中，加入rdd溶液70μl，缓缓混匀；

(7)向cr3吸附柱中央加入dnasei工作液80μl的，放置15min(室温)；

(8)向cr3吸附柱中加入去蛋白液rw1350μl，离心15s(12000rpm)，丢弃收集管中的废液，将cr3吸附柱放回至收集管中；

(9)向cr3吸附柱中加入漂洗液rw(含乙醇)500μl，离心15s(12000rpm)，丢弃收集管中的废液，将cr3吸附柱放回收集管中；

(10)重复步骤9；

(11)离心2min(12000rpm)，取新的rnase-free离心管，将cr3吸附柱放入其中，悬空滴加30-50μlddh2o(rnase-free)至吸附膜的中间，放置2min(室温)，离心1min(12000rpm)，离心所得即为提取的rna溶液。

2、反转录cdna第一条链的合成

使用宝日医生物技术有限公司(北京，takara中国)的primescript^tmii1ststrandcdnasynthesiskit反转录试剂盒进行，反应体系如下：

(1)rna变性，加入

(2)轻轻混匀，65℃孵育5min之后迅速冰浴；

(3)在上述microtube管中配制下列反转录反应液，总量为20μl；

(4)将上述体系缓慢混匀按下列条件进行反转录反应：42℃30min，然后在95℃加热5min(酶失活)，后立即冰浴。

二、cdna全长序列获得

使用赛默飞世尔科技(中国)有限公司的phusiondna聚合酶对mdbzr1基因进行pcr扩增，引物序列如下：

mdbzr1-f：catatgatgacgtcggatggggcgactt，seq.id.no.3；

mdbzr1-r：ggatccaatccgagcctttccattcccaagc，seq.id.no.4；

反应体系及步骤如下：

(1)反应液的配制(冰浴)：

(2)pcr反应条件为：98℃预变性30sec；98℃变性10s；60℃退火30s；72℃延伸1min；变性、退火及延伸共进行34个循环；72℃终延伸10min；

(3)1％琼脂糖凝胶用于pcr结果的凝胶电泳检测，电泳结果如图1所示。

(4)琼脂糖凝胶电泳产物回收，采用天根生化科技(北京)有限公司的琼脂糖凝胶dna回收试剂盒进行琼脂糖凝胶电泳产物的回收，操作步骤按说明书进行。

(5)连接反应，将pcr产物连接到peasy-bluntzero载体，反应体系为：

热击转化：轻柔混匀后，于25℃反应20min，4℃保存。使用热激法进行大肠杆菌感受态细胞转化：将-80℃冰箱东村的dh5α感受态细胞置于冰上融化，5μl连接产物与50μl感受态细胞混匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴2min。加入无抗生素液体lb培养基700μl，置于37℃摇床200rpm振荡培养1h。

抗性培养：12000rpm，离心1min，弃掉多余lb培养基，留100μl上清重悬菌体，含有相应抗生素的lb固体培养基用于涂布菌液，倒置在37℃培养箱过夜培养。

菌落pcr：用无菌牙签在超净工作台内挑取单菌落，进行菌落pcr，pcr反应条件为：98℃预变性30sec，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，72℃终延伸10min。

应用天根质粒提取试剂盒提取peasy-bluntzero-mdbzr1的质粒(操作步骤按照天根质粒小提试剂盒说明书进行)提取的质粒，于青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，剩余质粒置于-20℃保存，用于后续功能验证实验。

测序结果表明，mdbzr1基因的开放阅读框有888bp(如seq.id.no.1所示)，编码351个氨基酸(如seq.id.no.2所示)。

实施例2：苹果mdbzr1基因的过量表达

一、mdbzr1基因表达载体的构建

为研究mdbzr1基因的功能，将包含有mdbzr1基因编码区在内的共888bp片段正确插入pri101-an表达载体上。

使用赛默飞世尔科技(中国)有限公司的fastdigest内切酶ndei和bamhi酶切easy-bluntzero-mdbzr1的质粒和pri101-an表达载体质粒(各800ng)，酶切反应体系：

37℃酶切20min，对酶切结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察后切胶回收。

将胶回收产物与表达载体连接，22℃，t4(t4dnaligase购自thermo公司)连接20min，反应体系如下：

转化dh5α，菌落pcr筛选阳性单克隆菌落，pcr反应条件为：98℃预变性30sec；98℃变性10s；60℃退火30s；72℃延伸1min；变性、退火及延伸共进行34个循环；72℃终延伸10min；于青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，将测序正确阳性单克隆菌落扩大培养，提取质粒。将mdbzr1-

oe表达载体及pri101-an空载体(wt)转入到农杆菌gv3101，-80℃保存备用。

二、mdbzr1过量表达苹果愈伤组织的获得

准备待侵染‘王林’苹果愈伤，取愈伤于ms培养基(添加6-ba：0.5mg.l^-1+naa：0.5mg.l^-1)培养15-20d生长至为乳白色或蛋黄色小颗粒。活化含有pri101-mdbzr1质粒的农杆菌菌株，将待侵染的农杆菌菌体沉淀悬浮于ms液体培养基中，使终浓度为od600＝0.5-0.6。将待侵染‘王林’苹果愈伤与上述菌液混合，28℃震荡转化20min，无菌滤纸吸除多余菌液，然后转移至无抗的ms愈伤继代培养基(ms培养基+6-ba：0.5mg.l^-1+naa：0.5mg.l^-1)中，室温无菌暗培养3天左右。侵染3天后，用无菌水洗除愈伤的农杆菌，大约清洗6次。将上述‘王林’愈伤薄铺于筛选培养基(cef：250mg·l^-1；kan：30mg·l^-1)上；培养至新愈伤长出，将新长出的愈伤移到新的筛选培养基(cef；250mg·l^-1；kan；30mg·l^-1)，铺成薄薄的一层。继代筛选一次后，取抗性愈伤，提取dna和rna进行检测。

提取野生型和mdbzr1转基因苹果愈伤组织总rna，应用qrt-pcr(引物如下表，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，部分引物加入酶切位点，测序由青岛擎科梓熙生物技术有限公司完成)检测mdbzr1基因在野生型和三个转基因苹果愈伤组织中的表达量，结果如附图2所示，与对照相比，mdbzr1的转录水平在三个转基因株系l1、l2、l3中显著升高，表明成功获得了过量表达mdbzr1的转基因苹果愈伤组织。

使用bio-radcfx96荧光定量pcr仪，利用宝生物tbgreen^tmfastqpcrmix染料，检测基因的表达水平，引物见于附表。反应体系及实验步骤如下：

在冰上配制pcr反应液：

在cfx96定量pcr仪上进行两步法进行pcr反应，如下反应条件：预变性95℃30s，然后变性95℃5s，退火60℃30s，共40个循环，最后进行溶解曲线的绘制；

基因的表达量的计算：采用2-δδct方法(livakandschmittgen,2001)。

三、转基因愈伤组织对nacl敏感性分析

检测了盐胁迫与mdbzr1的关系，如附图3所示，在对照培养基上(ms基本培养基含0.5mg·l^-1：6-ba、0.5mg·l^-1：2，4-d)，转入空载体的愈伤(wt)长势与个转基因愈伤组织细胞系相似，而在100mmnacl的ms基本培养基(含0.5mg·l^-1：6-ba、0.5mg·l^-1：2，4-d)中处理后，发现转基因愈伤组织长势优于ck(图3)。培养21天后，mdbzr1基因过表达愈伤组织的鲜重明显高于对照组(图4)；mda含量采用明显低于对照组(图5)。将wt愈伤接种于ms基本培养基(含0.5mg·l^-1：6-ba、0.5mg·l^-1：2，4-d外；100mmnacl；100nmga3)，显示外施ga能够提高愈伤耐盐性(图6)。且过表达mdbzr1愈伤中gas含量明显高于wt组，其中，ga15，24，9，3，7，8，14，19含量更高(如表1)，表明基因在盐胁迫过程中起到正调控的作用。

mda测量方法：将50mg的愈伤样品在1.8ml10％三氯乙酸中匀浆，12000×g离心20min。将1ml10％三氯乙酸和0.6％硫代巴比妥酸加到1ml上清液中。将混合物在沸水中加热30分钟，冰浴快速冷却。1600×g离心10min，取上清使用分光光度计分别于450、532和600nm测定。计算公式：mda(μmol/g)＝[6.452(a532-a600)-0.56a450]*vt/(v0*w)。

赤霉素含量测定：

(1)激素提取：将样品于液氮中研磨至粉碎，准确称量约1g新鲜植物样品；向粉末中加入10ml异丙醇/盐酸提取缓冲液，4℃震荡30min；加入20ml二氯甲烷，4℃震荡30min；4℃，13000r·min-1离心5min，取下层有机相；避光，以氮气吹干有机相，以400μl甲醇(0.1％甲酸)溶解；过0.22μm滤膜，进hplc-ms/ms检测。

(2)标准溶液配制：以甲醇(0.1％甲酸)为溶剂配制梯度为0.1ng·ml-1，0.2ng·ml-1，0.5ng·ml-1，2ng·ml-1，5ng·ml-1，20ng·ml-1，50ng·ml-1，200ng·ml-1的ga1/3/4/5/6/7/8/9/13/14/15/19/20/24/29/44/51/53标准溶液。在实际绘制标曲方程时去掉线性不好的点。

(3)液相条件：色谱柱：poroshell120sb-c18反相色谱柱(2.1×150,2.7μm)；柱温：30℃；流动相：a：b＝(甲醇/0.1％甲酸)：(水/0.1％甲酸)；洗脱梯度：0-1min，a＝20％；1-9min，a递增至80％；9-10min，a＝80％；10-10.1min，a递减至20％；10.1-15min，a＝20％；进样体积：2μl。

(4)质谱条件：气帘气：15psi；喷雾电压：4500v；雾化气压力：65psi；辅助气压力：70psi；雾化温度：400℃

综上，从苹果中分离到了mdbzr1基因，通过苹果愈伤组织中转基因功能验证分析发现，mdbzr1在提高植株的抗性方面具有显著效果，提高了转基因植株的抗盐能力，对于苹果新品种的选育具有重要意义。

表1

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>山东农业大学

<120>一种mdbzr1基因及蛋白在提高苹果耐盐性中的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>888

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgacgtcggatggggcgacttcagcggcgacgatggcgcggaggaagccgtcgtggcgg60

gagagggagaacaaccggaggagagagcggaggaggagagccatcgcggcgaagatattc120

gccggcctccgagctcagggaggcttcaatttgcccaagcactgcgacaacaacgaggtc180

cttaaagctctctgcctccaggccggctggaccgtcgaggacgacggcaccacctaccgg240

aagggattaaagccgagtcaaactgatacgccggccgcatcaaccaagatcagcccgtac300

tcttcgctaaatccgagtccaatcccgtcctaccaagttagtccgtcgtcttcgtcctat360

cccagtcccacccgtttcgatcccgtcactaattcatccaatccaattcactatctccgc420

tctgcaatcccaccatctctccctcccctgcgaatttccaacagtgcccctgtaaccccg480

ccgctctcctccccgacctccagacgccccaacccaattcccaactgggacaccattgcc540

aaacagtccatggcctctttcgattacccattttacgccgtctccgctccagcgagcccg600

acccgccaacaccatcctcatcctacagctgccactatccccgaatgcgacgagtccgat660

gcttccaccgtcgattccggacaatgggtttgcttccagagatttgctccttctctgtca720

gcaatgccagcctctccgaccttcagtcttgtgaagcctgctttccctcagcagaatatt780

cccgcggatcaaatcccggacgtaaagccgtggatcggagagaagattcacgaggtggga840

ttggatgacttggagctcacgcttgggaatggaaaggctcggatttaa888

<210>2

<211>295

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metthrseraspglyalathrseralaalathrmetalaargarglys

151015

prosertrparggluarggluasnasnargargarggluargargarg

202530

argalailealaalalysilephealaglyleuargalaglnglygly

354045

pheasnleuprolyshiscysaspasnasngluvalleulysalaleu

505560

cysleuglnalaglytrpthrvalgluaspaspglythrthrtyrarg

65707580

lysglyleulysproserglnthraspthrproalaalaserthrlys

859095

ileserprotyrserserleuasnproserproileprosertyrgln

100105110

valserprosersersersertyrproserprothrargpheasppro

115120125

valthrasnserserasnproilehistyrleuargseralailepro

130135140

proserleuproproleuargileserasnseralaprovalthrpro

145150155160

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165170175

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180185190

alavalseralaproalaserprothrargglnhishisprohispro

195200205

thralaalathrileproglucysaspgluseraspalaserthrval

210215220

aspserglyglntrpvalcyspheglnargphealaproserleuser

225230235240

alametproalaserprothrpheserleuvallysproalaphepro

245250255

glnglnasnileproalaaspglnileproaspvallysprotrpile

260265270

glyglulysilehisgluvalglyleuaspaspleugluleuthrleu

275280285

glyasnglylysalaargile

290295

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

catatgatgacgtcggatggggcgactt28

<210>4

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggatccaatccgagcctttccattcccaagc31