一种球毛壳菌及其在小麦促生增产中的应用的制作方法

本发明涉及一种球毛壳菌及其在小麦促生增产中的应用。

背景技术：

农业生产中对小麦的产量要求较高，利用微生物菌剂拌种促进小麦生长增加产量是目前热门的研究方向。毛壳菌属(chaetomiumsp.)真菌广泛分布于土壤及植物体内。该类微生物能定殖小麦根部，促进植物的营养吸收。目前利用分离到的球毛壳菌在小麦促生增产中未见报道。

技术实现要素：

本发明提供一种球毛壳菌12xp1-2-3，其能够用于小麦促生增产，田间药效试验结果表明使用球毛壳菌12xp1-2-3对小麦种子包衣处理后，孕穗期能够增加叶片的叶绿素含量，还能够增加小麦的产量。

本发明提供的球毛壳菌(chaetomiumglobosum)，其保藏名称为12xp1-2-3，保藏编号为cgmccno.17183，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年1月23日。

上述球毛壳菌能够被用于小麦促生增产中。

本发明还提供一种生防菌剂，其含有上述球毛壳菌，该生防菌剂的制备方法具体包括以下步骤：

对所述球毛壳菌菌株进行扩繁培养，得到孢子悬浮液，即为含所述球毛壳菌株的一级种；

将所述孢子悬浮液接种到灭菌的麦粒上，当球毛壳菌在麦粒上长满菌丝和孢子时，水洗分离，即为含所述球毛壳菌株的二级种液；

将含所述球毛壳菌株的二级种液分散至羧甲基纤维素钠溶液中，即得所述生防菌剂。

优选地，所述羧甲基纤维素钠溶液的质量分数为4％；所述孢子悬浮液与所述羧甲基纤维素钠溶液的体积比为3:1.

优选地，所述灭菌的麦粒是将麦粒用水浸泡12h后，灭菌1h，放置1-2天后，再次灭菌30min。

上述生防菌剂能够被用于小麦促生增产中，且应用时是以包衣浓度为5.0-5.3×10⁴个子囊孢子/每颗种子对小麦种子进行包衣处理。

生物保藏说明

生物材料：球毛壳菌12xp1-2-3；分类命名：球毛壳菌(拉丁文名称：chaetomiumglobosum)，于2019年01月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号为cgmccno.17183。

对比现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提供的球毛壳菌12xp1-2-3，田间药效试验结果表明使用球毛壳菌12xp1-2-3对小麦种子包衣处理后，孕穗期能够增加叶片的叶绿素含量，还能够增加小麦的产量。

附图说明

图1表示小麦拔节期的生长效果；

图2表示小麦灌浆期的生长效果；

其中，a表示不使用球毛壳菌12xp1-2-3种子包衣处理后的小麦，b表示使用球毛壳菌12xp1-2-3种子包衣处理后的小麦。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本发明的保护范围。

实施例1

球毛壳菌株12xp1-2-3的分离

于小麦灌浆期，在河南省西平县采集小麦田中未发病的植株装纸袋中。样品置于4℃的冰箱保存。将样品根部冲洗干净，然后取小麦根部组织2-3cm，用质量分数75％无水乙醇表面消毒10-30s，质量分数1％nacio消毒1.5min，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干水分后，剪成0.5cm左右的小段，用无菌的镊子放置在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda，原料组成为：去皮马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g及蒸馏水1000ml)平板上，在20℃下培养5-7天后，挑去边缘菌丝于新的pda平板上生长，同样条件下5-7天后，挑去菌落均匀的菌丝块置于pda斜面上培养，置于4℃保存。

实施例2

球毛壳菌株12xp1-2-3的dna提取

将球毛壳菌株12xp1-2-3挑取至pda培养基上，20℃培养5-7天后，挑取5块边缘菌丝块均匀地放置到铺有灭菌玻璃纸的pda平板上。3-5天后用灭菌的小铁铲刮取菌丝，并用液氮速冻，存放在-20℃的冰箱里。提取dna时，取出20-25mg菌丝入预冷的1.5ml的ep管中；加入少许液氮用预冷的铁钉在ep管中将菌丝研磨至粉末；加入500μlextractionbuffer(50mmtris-cl(ph8.0)，150mmnacl，100mmedta(8.0))，在漩涡振荡器上振荡悬浮沉淀并混匀；然后加入预热的25μl(质量分数为20％)的十二烷基磺酸钠，颠倒混匀，在37℃水浴锅中放置1-3小时；然后加入75μl的5mnacl，颠倒混匀；加入65μl的ctab/nacl(10％ctab，0.7mnacl)溶液，65℃水浴30分钟；加入等体积的(700μl)tris-酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)混合液，混匀，10000rpm，4℃离心10分钟，将上清(550μl)转移至另一个ep管中；然后加入0.6倍体积的预冷的异丙醇(330μl)，-20℃沉淀10分钟，10000rpm，4℃离心10分钟，弃上清；沉淀用质量分数70％的乙醇洗涤两次，放入工作台风干5-10分钟；干燥后的沉淀溶于适量的无菌ddh2o中，-20℃保存。

实施例3

球毛壳菌株12xp1-2-3的分子鉴定

本试验采用引物its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’)和its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)扩增待测菌株的包含its1、5.8srdna和its2的dna片段。体系参考davaletal.(2010)。扩增反应条件：pcr反应程序为：95℃3min；95℃45s，50℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。pcr产物测序后，在ncbi中进行blast序列比对分析。序列比对结果为生防菌12xp1-2-3为球毛壳。

表1.pcr反应体系

实施例4

球毛壳菌12xp1-2-3种子包衣对孕穗期小麦叶片中叶绿素含量的影响

选取球毛壳菌12xp1-2-3生防菌剂种子包衣处理组和空白对照处理组(即该区域小麦种子在种植时不采用球毛壳菌12xp1-2-3生防菌剂进行包衣处理)的各3个点，每点10株苗，用spad502叶绿素仪分别测定其旗叶和倒二叶的叶绿素含量。

叶绿素增长率＝(球毛壳菌12xp1-2-3种子包衣处理组的旗叶或倒二叶叶绿素含量-空白对照组旗叶或倒二叶的叶绿素含量)/空白对照组旗叶或倒二叶的叶绿素含量。

结果见表2。

表2球毛壳菌12xp1-2-3对孕穗期小麦叶片叶绿素的影响

由表2可知，球毛壳菌12xp1-2-3种子包衣处理小麦旗叶后其叶绿素含量相较于空白对照旗叶叶绿素含量增加1.9％-14.7％，倒二叶叶绿素含量增加0-6.8％。

实施例5

球毛壳菌12xp1-2-3对田间小麦增产作用

1、球毛壳菌种子包衣制作

将挑选的球毛壳菌菌株在新鲜的pda上活化，然后分别挑取菌丝块到100个9cm的pda培养皿，15天后加入无菌水用涂布棒将子囊壳研磨，将子囊孢子悬浮液控制在100ml左右，浓度在1.0-2.0×10⁷个/ml，即为含所述球毛壳菌株的一级种。然后将孢子悬浮液接种20ml接种到长60cm，宽40cm，高7cm的灭菌的不锈钢浅盘中，浅盘中装入灭菌的麦粒2cm。麦粒灭菌前用水浸泡12h，然后装入聚乙烯袋中灭菌1h，放置1-2天后，再次灭菌30min，备用。15天后，当球毛壳菌在麦粒上长满菌丝和孢子时，用水洗下来，即为含所述球毛壳菌株的二级种。如果浓度太低，用3000rpm5min离心，然后去水重新悬浮。75ml的菌液加入25ml的质量分数4％羧甲基纤维素盐的溶液，混合成100ml1％的羧甲基纤维素盐的菌液(1.0×10⁷个/ml)。100ml1×10⁷个/ml1％的羧甲基纤维素盐的菌液加入5kg小麦种子混合均匀。球毛壳菌12xp1-2-3包衣种子冲洗后涂平板测定种子表面的孢子数量，为5.0-5.3×10⁴个子囊孢子/每颗种子。

2、数据调查和记录

田间样品取样方法：成熟期测定小麦产量。增产率＝(球毛壳菌12xp1-2-3拌种产量-空白对照组产量)/空白对照组产量。结果见表3。

表3球毛壳种子包衣对小麦增产效果

由表3可知，球毛壳菌12xp1-2-3种子包衣处理小麦产量相较于空白对照产量增产2.3％-10.9％。

如图1及图2所示，图1表示小麦拔节期的生长效果，图2表示小麦灌浆期的生长效果；其中，a表示不使用球毛壳菌12xp1-2-3种子包衣处理后的小麦，b表示使用球毛壳菌12xp1-2-3种子包衣处理后的小麦。由图1-2可知，使用本发明提供的球毛壳菌12xp1-2-3种子包衣处理后的小麦长势更佳。

需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。