可用于防治根结线虫的淡紫紫孢菌及其用途的制作方法

本申请涉及微生物防治领域，更具体涉及淡紫紫孢菌及其在农业生产中的应用。
背景技术：
：根结线虫(root-knotnematodes(rkn)，拉丁名meloidogyne)的寄主范围广泛，能够侵染114个科的超过3000种植物，包括单子叶、双子叶及草本植物，是全世界农业中的主要害虫，可造成作物减产10％～20％，严重时可达75％以上，每年造成的经济损失估计约为1180亿美元。rkn会在植物的根部形成根结，阻止水分和养分的吸收并且侵染的伤口会促进病原微生物的感染。南方根结线虫(meloidogyneincognita)感染几乎所有栽培植物的根，是最重要的rkn菌种之一。目前防治rkn主要采用化学防治、轮作以及抗性育种。然而，化学防治面临污染、耐药性等问题，而农业生产中有效的抗性品种资源有限。相比之下，生物农药以其高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被人们认为是未来化学农药的理想替代药剂。淡紫紫孢菌在线虫防治领域的研究已有数年，其能寄生根结线虫的卵和卵囊，也能寄生雌虫和幼虫。卵在胚胎发育早期最易受感染，菌丝或分生孢子可直接穿刺进入。菌丝能顺利地在根结线虫卵囊内生长，包围卵粒进而侵染卵，菌丝与卵接触后在线虫表面产生特殊的结构一附着胞，利用机械压力和真菌胞外分泌几丁质酶和蛋白酶将卵壳消解，进而进行侵染直到胚胎完全被菌丝取代。然而，不同来源的淡紫紫孢菌菌株的生理特性、功能特性等都存在极大差异，缺乏真正可高效、广泛施用、且适于工业化生产的高效菌株。如专利cn102851219a中公开了从线虫病重发的香蕉植株中分离得到的一株野生型淡紫拟青霉e16菌株，该菌株仅对香蕉根结线虫具有高致病性，作用对象单一。又如专利cn107058120a中公开了一株经紫外诱变的淡紫紫孢菌p136-1-1菌株，该菌株能高效杀死黄瓜根结线虫，但该菌株的产孢能力不高(5.9高108孢子/皿，20ml/皿)，且经过紫外诱变处理后具有不定向性，难以满足工业化生产的需求。基于此，本发明旨在筛选出一株产孢能力强、作用对象广、对根结线虫致病性高的、适于工业化生产的野生型菌株。发明概述第一方面，本发明提供了一种分离的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)菌株，即mn12228，其保藏编号为cgmccno.12773，于2016年7月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号北京微生物研究所。本发明提供了分离的淡紫紫孢菌菌株，其具有与seqidno.1有至少99.5％、至少99.55％、至少99.6％、至少99.65％、至少99.7％、至少99.75％、至少99.8％、至少99.85％、至少99.9％、至少99.95％或100％同一性的序列，并且其中当用所述淡紫紫孢菌菌株处理作物植物时，所述淡紫紫孢菌菌株赋予所述作物植物正面的农业性状或益处。正面的农业性状或益处是相对于对照植物而言，根结线虫造成的疾病或症状得到预防、治疗、严重程度得到缓解，例如根结减少，出芽率提高，根系生长更加旺盛，土壤线虫明显减少，其中包括根结线虫、孢囊线虫、金色线虫、异皮线虫等植物寄生线虫。这类正面的农业性状或益处可以包括植物生长增加、作物植物产量增加、质量提高。在一些实施方式中，其中分离的淡紫紫孢菌菌株是本文提供的淡紫紫孢菌菌株mn12228的子代。在一些实施方案中，提供淡紫紫孢菌菌株或其分离株的培养物或群体。第二方面，提供了一种组合物，其包含本文第一方面的菌株和农业上可接受的载剂。在一些实施方案中，组合物包含淡紫紫孢菌培养物8-12份、分散剂nno5-9份、sds2-6份、拉开粉3-5份、磷酸二氢钾6-10份、用载体硅藻土补足到100份。在一些实施方案中，组合物包含淡紫紫孢菌mn12228的培养物8份、分散剂nno5份、sds2份、拉开粉3份、磷酸二氢钾6份、用载体硅藻土补足到100份。在一些实施方案中，组合物包含淡紫紫孢菌mn12228的培养物10份、分散剂nno7份、sds4份、拉开粉4份、磷酸二氢钾8份、用载体硅藻土补足到100份。在一些实施方案中，组合物包含淡紫紫孢菌mn12228的培养物12份、分散剂nno9份、sds6份、拉开粉5份、磷酸二氢钾10份、用载体硅藻土补足到100份。第三方面，提供了预防、缓解或治疗作物植物根结线虫(meloidogyne)虫害的方法，其包括：将本文所述的组合物施加于植物，诸如根或叶的植物部位，或植物种子上。在一些实施方案中，所述作物植物为任何需要预防、缓解或治疗根结线虫虫害的作物植物，例如黄瓜、番茄、大姜、辣椒、茄子、叶菜类、香蕉、柑橘。附图说明图1：淡紫紫孢菌mn12228菌剂处理后的黄瓜根系生长图。图2：淡紫紫孢菌mn12228菌剂处理后的大姜芽长长势图。本发明的分离的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)菌株，即mn12228，保藏编号为cgmccno.12773，于2016年7月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号北京微生物研究所。具体实施方式实施例1：淡紫紫孢菌mn12228分离淡紫紫孢菌mn12228自陕西西安小麦田间土壤分离而得，并于2016年7月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号北京微生物研究所，保藏编号为cgmcc12773。具体分离方法如下：称取10g土壤样本，加入到已灭菌的90ml含0.1％吐温的水中，28℃摇瓶培养1hr。取培养液用含0.1％吐温的水逐级稀释成不同梯度，然后涂布于pda固体培养基(马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15～20克、蒸馏水1000毫升)中，于28℃恒温培养箱中倒置培养4天，4天后挑取单一菌落，继续接种于pda固体培养基上，于28℃恒温培养箱中倒置培养5天，然后观察菌落形态，并用光学显微镜观察菌体形态(1000x)。形态鉴定：观察菌落形态，并用光学显微镜观察菌体型态(1000x)。分子鉴定：对菌株mn12228的序列进行测定，结果如下。ccgattggtgacgcggagggacattaccgagttatacaactcccaaacccactgtgaaccttacctcagttgcctcggcgggaccgccccggccgccgcgcaagcggcgccggactccaaggcgcccgccgcagggacccaaaactcttttgcattacgcccaacggcgggaattttttctctgagtgcataagcaaaacaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagcattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcgagcccccccgggggcctcggtgttgggggacggcacaccagccgcccccgaaatgcagtggcgacctcgccgcagcctcccctgcgtagtagcacacacctcgcaccggagcgcggagacggtcacgccgtaaaacgcccaacttcttagagttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaa(seqidno.1)。经its序列同源性分析，通过blast同源比对，结合形态特征及序列特征，可将菌株mn12228鉴定为淡紫紫孢菌。实施例2：淡紫紫孢菌产孢能力、活菌数测定实验室产孢能力测定：将活化的淡紫紫孢菌mn12228接种于pda培养基中，置于25-28℃培养箱中培养7天后，用无菌水将培养基上的孢子洗出，制成孢子悬浮液，用血球计数板计数，测定孢子浓度为9.7×109孢子/ml，高于专利cn107058120a中公开菌株的产孢能力(5.9×108孢子/皿，20ml/皿)。中试车间培养物产孢量测定：将麦麸、硫酸铵和蔗糖按照重量比85：10：5混合成固体制剂，装入固体发酵罐内，再加入20％的纯净水(按总重量计)混匀，高温121℃和高压条件下灭菌20分钟。冷却后，在无菌条件下接种活化的淡紫紫孢菌菌株mn12228，接种量为10％(体积百分比)，再在25-28℃、黑暗条件下进行中试车间放大培养，培养7天后终止发酵。用搅拌装置将淡紫紫孢菌发酵物打散混匀，制得淡紫紫孢菌培养物。用血球计数板测定淡紫紫孢菌培养物中的淡紫紫孢菌含孢量可达1.8×1010cfu/g培养物，不低于市面上同类产品，适于工业化生产。市面现有同类产品含孢量：品名：线虫快克(北京正农农业科技有限公司)，淡紫拟青霉有效活孢子数＞1.0×1010个/g菌剂品名：新龙惠线盾(江西新龙生物科技股份有限公司)，淡紫拟青霉有效活菌数＞2.0×108个/g粉剂实施例3：淡紫紫孢菌mn12228菌剂的制备淡紫紫孢菌菌剂由以下重量份的组分组成：淡紫紫孢菌mn12228培养物8-12份、分散剂nno5-9份、sds2-6份、拉开粉3-5份、磷酸二氢钾6-10份、用载体硅藻土补足到100份。所制备的淡紫紫孢菌菌剂中的含孢量不小于108个/g，优选109个/g。表1：菌剂各组分含量编号mn12228nnosds拉开粉磷酸二氢钾硅藻土第i组8523676第ii组10744867第iii组129651058实施例4：淡紫紫孢菌mn12228对南方根结线虫二龄幼虫的杀虫活性将上述制备的淡紫紫胞菌菌剂用0.1％吐温无菌水稀释100倍后加到24孔无菌细胞培养板上，每孔加入500μl稀释后的淡紫紫孢菌菌剂和100条根结线虫二龄幼虫，分别在24h时计数各处理中线虫的死亡情况。对照组为0.1％吐温无菌水。每个处理重复5次。表2：淡紫紫孢菌菌剂杀虫活性结果发现，淡紫紫孢菌菌剂在24小时内具有86.57％以上的杀线虫活性，最高可达94.4％的杀线虫活性(表2)，且使用1摩尔氢氧化钠刺激死亡线虫也无复苏现象。第ii组和第iii组菌剂杀线虫活性相当，进一步优选第ii组淡紫紫孢菌菌剂进行作物根结线虫防治试验，该组菌剂的含孢量不低于109个/g。实施例5：淡紫紫孢菌菌剂对黄瓜根结线虫病的室内生物防治将黄瓜种子消毒后，用无菌水清洗干净后播种。黄瓜苗在26-27℃温室中培养至第一片真叶完全展开时进行移栽，每盆种植1株黄瓜苗，共移栽90盆，分为两组，分别为处理组和对照组。处理组浇灌经0.1％吐温水稀释100倍后的淡紫紫孢菌菌剂(第ii组)稀释液15ml，对照组用等量0.1％吐温无菌水进行浇灌。浇灌24h后，每株黄瓜苗接种300条根结线虫，接种后进行正常的肥水管理，45天后将全部植株扣盆倒出，进行根结严重度分级，记录根结上的根结数，并计算各处理根结减退率。表3淡紫紫孢菌菌剂对黄瓜根结线虫的防治效果表3和图1结果表明，淡紫紫孢菌产品处理组的根结减退率为64.20％，平均根结数显著低于对照组(p<0.05)。实施例6：淡紫紫孢菌菌剂对圣女果田间小区试验圣女果试验范围(种植时间：2019.09.27-2020.01)6.1试验地点：试验在广东省广州市番禺区石碁镇兴腾试验基地进行，试验地点交通便利，土壤肥沃，光照充足，土壤为红沙壤，试验地前茬作物为黄瓜，且发生的根结线虫病害严重。6.2试验小区规划以及处理：种植面积为180m2，按照4m×4m的规格划分种植小区，共划分为8个种植小区，每个种植小区间保持1m间隔，每个种植小区内等间距种植9×7颗番茄苗，移栽时以定根水浇灌西红柿幼苗。移栽7天后，将8个种植小区随机分成两组，分别为处理组和对照组，处理组每株番茄苗浇灌0.1％吐温水稀释100倍后的淡紫紫孢菌菌剂(第ii组)稀释液300ml，对照组施用等量0.1％吐温无菌水，并于移栽后30天和开花前期各施用一次复合肥。6.3试验结果采收期开始统计各个种植小区番茄果实的产量。每个种植小区抽样20棵番茄苗，用铲子将根系完整铲出，清洗干净，装入样品袋，按照下述标准统计根系的根结指数：0级：无根结；1级：根结占全根系的1％～25％；2级：根结占全根系的26％～50％；3级：根结占全根系的51％～75％；4级：根结占全根系的76％～100％。跟对照组相比，淡紫紫孢菌菌剂处理的番茄苗根系发达，根结明显减少，根结线虫防治效果达84.39％。另外，根结线虫的有效防治有利于提升番茄产量，处理组种植小区的番茄产量明显提升，增产率达39.32％。表4淡紫紫孢菌菌剂对番茄根结线虫防治效果实施例7淡紫紫孢菌菌剂促进大姜姜芽生成大姜根结线虫病又叫大姜癞皮病，患病大姜的质量和产量都受到极大影响，一般情况下会导致大姜减产10％-20％，严重者减产超过50％。本发明通过浸种赖皮病病姜测试发现，淡紫紫孢菌mn12228可有效防止根结线虫对姜种的危害，有利于促进姜芽生成，提高姜种出芽率。7.1.试验方法：7.1.1.试验材料(1)大姜：带赖皮病大姜(2)处理液：第ii组淡紫紫孢菌菌剂经0.1％吐温水稀释50倍液(3)其他：育苗盆(10×10cm)，灭菌的育苗土等。7.1.2试验步骤(1)姜种消毒：将带赖皮病的大姜切成重量相当的姜块、清水洗净后，用75％酒精对姜块表面和切口进行消毒处理，冲洗酒精后晾干留作姜种；(2)浸种：设置处理组和对照组，每组挑选30块姜种进行浸种处理，其中，处理组用处理液浸泡10-15min，对照组用0.1％吐温水浸泡等长时间；(3)播种：每组准备30个育苗盆，分别装入经121℃灭菌60min后的育苗土，随后在每个育苗盆中放入一块浸泡好的姜种并覆上一层育苗土，用保鲜膜封住育苗盆盆口，然后放置在温度20-25℃的催芽室催芽。姜块浸种前先统计重量，播种两周后统计姜块重量涨幅、出芽率、平均芽长等生长指标，判断芽长势。表5淡紫紫孢菌菌剂对大姜出芽效果的影响编号姜块重量涨幅/％出芽率/％平均芽长/cm处理组8.06±0.8495.2±0.952.58±0.37对照组6.83±0.5781.4±1.121.37±0.11由表5可以看出，淡紫紫孢菌菌剂处理的大姜出芽率、芽长和姜块重量均高于对照组。本发明的淡紫紫孢菌菌株为分离自大麦田土壤中的野生型菌株，可应用于黄瓜、番茄、大姜等作物跨作物的筛选与应用，丰富各类作物间微生物的多样性，促进微生物与作物间的互利共生。当前第1页12