一种螺旋藻硒多糖的制备方法与流程

本发明涉及硒多糖制备领域，特别是涉及一种螺旋藻硒多糖的制备方法。
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：硒元素是人体必需微量元素，而无机硒具有毒性，安全剂量小，有机硒化物是一类新型化合物，具有抗病毒，抗肿瘤，抗炎，抗衰老，促进生长、保护视觉器官，解毒，防治心血管疾病及预防肝部疾病等药理活性，硒具有独特的生化性质和药理作用，开发含硒化合物极具意义。硒多糖是一种通过多糖与硒的结合且具备硒和多糖两者活性的有机硒化合物。硒多糖的生物活性普遍高于硒和多糖，且更易于被机体吸收和利用，因此硒多糖在免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等方面具有广泛的应用。植物或微生物中硒多糖的含量较低，目前人们主要通过以下两种方法获得较高含量的硒多糖：人工硒处理获得富硒植物从而形成天然硒多糖和利用多糖硒化获取人工硒多糖。其中人工硒多糖的制备可将自然界中不含硫酸根的部分植物多糖通过磺化反应等，在多糖分子中引入硫酸基团，再用亚硒酸钠中的亚硒酸根取代多糖分子中的部分硫酸根，进而形成硒酸酯多糖。天然的硒多糖量少，价格昂贵，不利于工业化生产，而人工合成硒多糖的技术较为复杂且硒含量低。以上
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内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述
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不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。技术实现要素：(一)解决的技术问题本发明目的在于提出一种富硒的螺旋藻硒多糖的制备工艺，以解决上述现有技术存在的螺旋藻硒多糖的产量低，杂质含量高、需要多次纯化的技术问题。(二)技术方案为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种螺旋藻硒多糖的制备方法，包括以下步骤：s1、前处理：将螺旋藻粉在50℃干燥8-10h，降至室温，30-35℃球磨5-7天；s2、蛋白质分离：将步骤s1处理过的螺旋藻粉与水按照重量比1:1-2溶解，加入混合溶液，充分搅拌后再3000-4000r/min离心20-30min，除去两相界面的蛋白质，收集上层滤液，重复加入混合溶液进行离心洗涤操作5-6次后，最后所得的上层滤液用无水乙醇醇沉至含醇量为80％，在4℃静置24h后，离心收集沉淀物，真空干燥，得到螺旋藻粗多糖；s3、纯化多糖：将步骤s2所得的螺旋藻粗多糖用纯化水洗涤3-4次后，在10000-12000r/min离心10-15min，收集沉淀物，真空干燥，得到纯化多糖；s4、硫酸酯化反应：将吡啶冷却至-10～-5℃，缓慢加入氯磺酸，然后加入步骤s3的纯化多糖，在80-90℃下保温1-1.5h，冷却至室温，加入冰水，再加入乙醇，沉淀析出，过滤，得到第一滤饼，将滤饼在50％酒精溶液中进行打浆，升温，再降温至-5-0℃，过滤，得到第二滤饼，在45-50℃下进行干燥，得到螺旋藻多糖硫酸酯化物；s5、硒酸酯化反应：将步骤s4中所得的螺旋藻多糖硫酸酯化物加入到混酸中，加入硒化试剂、助剂，在n2保护的条件下，在60-70℃下，反应6-7h；进行后处理后得到所述螺旋藻硒多糖。优选的，所述步骤s5中，所述混酸包括浓度为0.6％的硝酸和浓度为0.2％的高氯酸。优选的，所述步骤s5中，所述硒化试剂为亚硒酸钠或亚硒酸钾中的一种。优选的，所述步骤s5中，所述助剂为氯化钡。优选的，所述步骤s5中，所述后处理过程为反应结束后，在n2保护的条件下，冷却物料至20-25℃，加入碳酸钠，调节ph＝6-7，过滤，得到一次滤液，一次滤液中再加入适量的无水硫酸钠，搅拌后静置1-2h过滤，得到二次滤液。优选的，所述步骤s5中，所述二次滤液，装入透析袋中用流水透析过夜，然后取少量透析液加入抗坏血酸检测，至无红色时停止透析，然后减压蒸馏至稠膏状，用无水乙醇沉淀，在冰箱中放置过夜，抽滤后沉淀用无水乙醇洗涤，真空干燥。(三)有益效果与现有技术相比，本发明所述的螺旋藻硒多糖具有以下优点：本申请将螺旋藻粉进行球磨前处理，可最大限度的将螺旋藻粉中的杂质除去，且提高多糖的收率，采用进行催化磺化反应，减少位羟基的取代，减少杂质的生成，将螺旋藻硒多糖的产量提升，硒含量可达52g/kg以上，无钾离子、钠离子、钡离子等残留。附图说明图1为所述螺旋藻硒多糖的化学结构式。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。图1为本发明实施例制备出的螺旋藻硒多糖。实施例1一种螺旋藻硒多糖的制备方法，包括以下步骤：s1、前处理：将1kg螺旋藻粉在50℃干燥8h，降至室温，30℃球磨5天；s2、蛋白质分离：将步骤s1处理过的螺旋藻粉，与1kg水进行混合溶解，加入5l混合溶液(混合溶液为氯仿：正丁醇按照4:1体积比混合均匀而得)，进行充分搅拌后30min，在3000r/min离心20min，除去两相界面的蛋白质，收集上层滤液；再次加入5l混合溶液进行离心洗涤，即加入混合溶液进行充分搅拌30min，在3000r/min离心30min，除去两相界面的蛋白质，收集上层滤液；上层滤液重复加入5l混合溶液进行离心洗涤4次，最后所得的上层滤液，用无水乙醇醇沉至含醇量为80％，4℃静置24h后，离心收集沉淀物，真空干燥，得到螺旋藻粗多糖100-105g；s3：纯化多糖：用300ml纯化水，在2℃下洗涤步骤s2所得的螺旋藻粗多糖，重复上述纯化水洗涤3次，在10000r/min离心10min，收集沉淀物，真空干燥，得到纯化多糖50g；s4：硫酸酯化反应：将100ml吡啶冷却至-10℃，缓慢加入4ml氯磺酸(含量≥85％)，然后加入步骤s3的纯化多糖，在80℃下保温1h，冷却至室温，加入15g冰水，再加入30ml乙醇，沉淀析出，过滤，得到第一滤饼，将滤饼在50ml的50％酒精溶液中进行打浆，升温，再降温至-5℃，过滤，得到第二滤饼，在45℃下进行干燥，得到螺旋藻多糖硫酸酯化物36g；s5：硒酸酯化反应：将步骤s4中所得的螺旋藻多糖硫酸酯化物加入到100g混酸，混酸中包括硝酸浓度为0.6％、高氯酸浓度为0.2％，再加入1g亚硒酸钠、0.2g氯化钡，充分搅拌均匀后，在n2保护的条件下，在60℃下，反应6h；然后进行后处理，后处理过程为反应结束后，在n2保护的条件下，冷却物料至20℃，加入碳酸钠，调节ph＝6，过滤，得到一次滤液，一次滤液中再加入适量的无水硫酸钠，搅拌后静置1h过滤，得到二次滤液；二次滤液，装入透析袋中用流水透析过夜，然后取少量透析液加入抗坏血酸检测，至无红色时停止透析，然后减压蒸馏至稠膏状，用无水乙醇沉淀，在冰箱中放置过夜，抽滤后沉淀用无水乙醇洗涤，真空干燥，得到所述螺旋藻硒多糖20g。实施例2一种螺旋藻硒多糖的制备方法，包括以下步骤：s1、前处理：将1kg螺旋藻粉在50℃干燥10h，降至室温，35℃球磨7天；s2、蛋白质分离：将步骤s1处理过的螺旋藻粉，与2kg的水进行混合溶解，加入5l混合溶液(混合溶液为氯仿：正丁醇按照4:1体积比混合均匀而得)，进行充分搅拌40min后，在4000r/min离心30min，除去两相界面的蛋白质，收集上层滤液；再次加入5l混合溶液进行离心洗涤，即加入混合溶液进行充分搅拌40min，在4000r/min离心30min，除去两相界面的蛋白质，收集上层滤液；上层滤液重复加入5l混合溶液进行离心洗涤3次，最后所得的的上层滤液，用无水乙醇醇沉至含醇量为80％，4℃静置24h后，离心收集沉淀物，真空干燥，得到螺旋藻粗多糖105g；s3：纯化多糖：用300ml纯化水，在4℃下洗涤步骤s2所得的螺旋藻粗多糖，重复上述纯化水洗涤3次，在12000r/min离心15min，收集沉淀物，真空干燥，得到纯化多糖54g；s4：硫酸酯化反应：将100ml吡啶冷却至-5℃，缓慢加入4ml氯磺酸(含量≥85％)，然后加入步骤s3的纯化多糖，在90℃下保温1.5h，冷却至室温，加入15g冰水，再加入30ml乙醇，沉淀析出，过滤，得到第一滤饼，将滤饼在50ml的50％酒精溶液中进行打浆，升温，再降温至-5-0℃，过滤，得到第二滤饼，在50℃下进行干燥，得到螺旋藻多糖硫酸酯化物39g；s5：硒酸酯化反应：将步骤s4中所得的螺旋藻多糖硫酸酯化物加入到100g混酸，混酸中包括硝酸浓度为0.6％、高氯酸浓度为0.2％，再加入1g亚硒酸钠或亚硒酸钾、0.2g氯化钡，充分搅拌均匀后，在n2保护的条件下，在70℃下，反应7h；然后进行后处理，后处理过程为反应结束后，在n2保护的条件下，冷却物料至25℃，加入碳酸钠，调节ph＝7，过滤，得到一次滤液，一次滤液中再加入适量的无水硫酸钠，搅拌后静置2h过滤，得到二次滤液；二次滤液，装入透析袋中用流水透析过夜，然后取少量透析液加入抗坏血酸检测，至无红色时停止透析，然后减压蒸馏至稠膏状，用无水乙醇沉淀，在冰箱中放置过夜，抽滤后沉淀用无水乙醇洗涤，真空干燥，得到所述螺旋藻硒多糖22g。实施例3一种螺旋藻硒多糖的制备方法，包括以下步骤：s1、前处理：将1kg螺旋藻粉在50℃干燥9h，降至室温，30-35℃球磨6天；s2、蛋白质分离：将步骤s1处理过的螺旋藻粉，与1.5kg的水进行混合溶解，加入5l混合溶液(混合溶液为氯仿：正丁醇按照4:1体积比混合均匀而得)，进行充分搅拌40min后，在3500r/min离心25min，除去两相界面的蛋白质，收集上层滤液；再次加入5l混合溶液进行离心洗涤，即加入混合溶液进行充分搅拌35min，在3500r/min离心25min，除去两相界面的蛋白质，收集上层滤液；上层滤液重复加入5l混合溶液进行离心洗涤4次，最后所得的的上层滤液，用无水乙醇醇沉至含醇量为80％，4℃静置24h后，离心收集沉淀物，真空干燥，得到螺旋藻粗多糖102g；s3：纯化多糖：用300ml纯化水，在3℃下洗涤步骤s2所得的螺旋藻粗多糖，重复上述纯化水洗涤3次，在11000r/min离心12min，收集沉淀物，真空干燥，得到纯化多糖52g；s4：硫酸酯化反应：将100ml吡啶冷却至-8℃，缓慢加入4ml氯磺酸(含量≥85％)，然后加入步骤s3的纯化多糖，在85℃下保温1.2h，冷却至室温，加入15g冰水，再加入30ml乙醇，沉淀析出，过滤，得到第一滤饼，将滤饼在50ml的50％酒精溶液中进行打浆，升温，再降温至-2℃，过滤，得到第二滤饼，在47℃下进行干燥，得到螺旋藻多糖硫酸酯化物37g；s5：硒酸酯化反应：将步骤s4中所得的螺旋藻多糖硫酸酯化物加入到100g混酸，混酸中包括硝酸浓度为0.6％、高氯酸浓度为0.2％，再加入1g亚硒酸钠或亚硒酸钾、0.2g氯化钡，充分搅拌均匀后，在n2保护的条件下，在65℃下，反应6.5h；然后进行后处理，后处理过程为反应结束后，在n2保护的条件下，冷却物料至23℃，加入碳酸钠，调节ph＝6.5，过滤，得到一次滤液，一次滤液中再加入适量的无水硫酸钠，搅拌后静置1.5h过滤，得到二次滤液；二次滤液，装入透析袋中用流水透析过夜，然后取少量透析液加入抗坏血酸检测，至无红色时停止透析，然后减压蒸馏至稠膏状，用无水乙醇沉淀，在冰箱中放置过夜，抽滤后沉淀用无水乙醇洗涤，真空干燥，得到所述螺旋藻硒多糖20.5g。对比例1不存在步骤s4，其余条件和实施例2一致，进行制备螺旋藻硒多糖；对比例2步骤s5中不加入高氯酸，其余条件和实施例2一致，进行制备螺旋藻硒多糖；对比例3步骤s5中不加入高氯酸，而稀硝酸浓度为3％，其余条件和实施例2一致，进行制备螺旋藻硒多糖；对比例4步骤s5中，二次滤液不流水透析过夜处理，直接进行然后减压蒸馏至稠膏状，用无水乙醇沉淀，在冰箱中放置过夜，抽滤后沉淀用无水乙醇洗涤，真空干燥。对实施例1-3和对比例1-4制备出的螺旋藻硒多糖，进行相关检测，具体如下：1、使用分光光度法进行硒含量检测取2μg/ml硒标准溶液0.00，1.25，2.50，5.00，10.00，15.00，20.00和25.00ml，分别置于125ml分液漏斗中，加水30ml，用稀盐酸溶液调ph＝2，加1％邻苯二胺盐酸盐试液3.0ml，摇匀，放置2h，然后加甲苯10.00ml，萃取，静置，分取甲苯层，以0ml不含硒溶液为空白对照液，在紫外分光光度计190～800nm范围内做光谱扫描，确定最大吸收波长为338nm。于最大吸收波长处测定吸光度值a，以含硒量(g)为横坐标，吸光度a为纵坐标绘制标准曲线，求出回归方程。取实施例及对比例成品0.01g，研碎后放入100ml锥形瓶中，加入4ml混酸(v(hclo4):v(h2so4):v(hno3)＝1:1:4)浸渍，放置过夜。然后将锥形瓶于恒温水浴锅中，在95℃下静置约1.5h。然后均分为两份，一份转入分液漏斗中，按上述绘制标准曲线的方法进行处理，以338nm为检测波长，测定吸光度，根据回归方程计算样品中硒含量。根据上述办法，实施例及对比例的硒含量结果如下表1所示：表1组别实施例1实施例2实施例3对比例1对比例2对比例3对比例4硒含量(g/kg)5263570.5301570终产品收率(％)2.02.22.13.02.11.02.5从上表1，在硒含量和收率方面，可以看出实施例1-实施例3中，硒含量≥52g/kg，终产品收率在2.0％-2.2％；而对比例1，制备得到的产品中，硒含量仅仅为0.5g/kg，含量大大降低，说明在缺少步骤s4后，纯化多糖在混酸中(浓度为0.6％的硝酸和浓度为0.2％的高氯酸)，加入亚硒酸钾、氯化钡，在n2保护的条件下，在66℃下，反应6.5h，进行直接酯化反应，亚硒酸钾和纯化多糖，反应的选择性较差，造成螺旋藻硒多糖中硒含量较低；而在对比例2中，在缺少高氯酸的条件下，制备出螺旋藻硒多糖中硒含量降低，这应该是实施例2步骤s5在高氯酸和硝酸混合溶液中酸性更强，螺旋藻多糖硫酸酯化物在氯化钡的促进下，更容易生成螺旋藻硒多糖(酯化物)；而对比例3中硝酸的浓度为3％，浓度相对大于实施例2中的硝酸，因此氧化性相对大于实施例2，能够氧化螺旋藻多糖，造成产品被氧化，影响了硒化反应的进行，造成产品收率及硒含量明显降低；在对比例4中，不进行透析的后处理，硒含量和收率相对实施例2，有一定幅度的增加，这有可能是终产品中在步骤s5中含有硒化剩余的硒酸盐，钡盐、钾盐、钠盐等。2、焰色试验铂丝、酒精灯、稀盐酸、蓝色钴玻璃。操作过程①将铂丝蘸稀盐酸在无色火焰上灼烧至无色；②蘸取试样在无色火焰上灼烧观察火焰颜色(透过蓝色钴玻璃观察)组别实施例1实施例2实施例3对比例4直接焰色无色无色无色黄绿色透过蓝色钴玻璃无色无色无色黄绿色备注：ba焰色为黄绿色；na焰色为黄色，ka焰色为黄绿色；从实施例1-3可以看出，直接焰色和透过蓝色钴玻璃观察焰色，均为无色，说明制备出的螺旋藻硒多糖中没有钠、钾、钡残留，不会带来钡离子中毒的风险；而对比例1直接焰色和透过蓝色钴玻璃观察焰色为黄绿色，表明有钡残留，产品中存在钡离子中毒的风险；因此可以说明，在步骤s5的后处理中，采用透析法可有效除去过量的亚硒酸根，无机化合物(钠、钾、钡盐等)被透析除去。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。当前第1页12