本发明涉及到乳酸菌，尤其涉及到用于防治幽门螺杆菌引发的胃炎的乳酸菌及其应用。
背景技术：
：：幽门螺杆菌在大自然中通常具有两种形态。一种是杆状或是螺旋状，其大多处于生长期，另一种是球状，其处于老化或是死亡时期。h.pylori在根据其毒性特征致病性可分为高毒力菌株和低毒理菌株。第一种为h.pylori-caga+vaca+，其毒性强，致病能力强，容易导致各种各样的胃部不适甚至胃癌，第二种类型为h.pylori-caga-vaca-，其毒力较弱或无毒，无特殊症状表现，基本上无致病能力。幽门螺杆菌长期感染会引起慢性胃炎，如果不及时治疗，最终会导致胃肠道溃疡和胃癌的发生，需引起人们的重视[9]。幽门螺杆菌能在胃里长期定植并致病，与其自身生理特性有很大关系。因为幽门螺杆菌本身具有游动性、耐酸性、粘附性、产生毒力因子等特点。h.pylori具有游动性是因为其鞭毛结构发生作用。鞭毛的形成、脂多糖(lps)的合成以及蛋白质糖基化反应与端生鞭毛上的flaa1和wbpb两个基因有密切联系。有一些因特殊原因而基因变异的突变体h.pylori因为本身无鞭毛，而不能定植与动植物体内胃粘膜表面。人胃肠道一直处于高酸环境中，h.pylori穿过粘液层并长期定植于胃粘膜层，必须具有高耐酸性才能得以在胃中存活。大量实验报道证明h.pylori能产生一种尿素酶的物质，尿素酶能水解胃中的尿素并发生反应产生co2和氨，使菌体周围的ph值升高，在h.pylori的周围形成一个中性的微环境，从而达到中和胃酸的作用，保护h.pylori免遭胃酸的侵扰或死亡[10]。h.pylori能够在胃中长期定植，不会因为胃的蠕动而被排出体外，是因为h.pylori具有粘附性。而维持其粘附性的原因是h.pylori的表面附着有很多蛋白，蛋白可以产生多种粘附分子。如：中性粒细胞活化蛋白、神经氨酰乳糖结合原纤维血凝素(h.pyloriaa)、alpa、alpb、baba、脂多糖链接的lewis抗原。但h.pylori的最直接致病原因是由于其毒力因子发挥重要作用。毒力因子主要包括空泡毒素(vaca)和空泡毒素相关蛋白(caga蛋白)。空泡毒素能够导致胃粘膜损伤，原因由于其可以与特异性受体结合，导致细胞空泡甚至膜穿孔。空泡毒素还可以导致细胞凋亡是因为其可以影响细胞表面信号转换，阻止了表面上皮细胞的修复功能。空泡毒素相关蛋白没有表达出相关可以破坏细胞膜甚至凋亡毒素的能力，但与空泡毒素的表达有一定相关关系，有利于h.pylori长期定植于胃粘膜上，破坏胃上皮细胞，与胃炎、十二指肠溃疡及胃上皮化生有关机体被幽门螺杆菌感染(helicobacterpylori)后，可导致多种胃部疾病。并且h.pylori在成人中感染率高达40％～60％，严重的威胁着人们的身体健康与生活质量。因此寻找一种无副作用的预防或者是治疗幽门螺杆菌感染的方案迫在眉睫。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供一用于防治幽门螺杆菌引发的胃炎的乳酸菌及其应用，其中所述乳酸菌能够被用于预防或者是治疗幽门螺杆菌引发的胃炎。本发明的另一目的在于提供一用于防治幽门螺杆菌引发的胃炎的乳酸菌及其应用，其中所述乳酸菌能够被制作为食品。根据本发明的一方面，本发明提供了一用于防治幽门螺杆菌引发的胃炎的乳酸菌，其是植物乳杆菌zj316，寄存编号为cctccno：m208077。根据本发明的一实施例，所述乳酸菌能够降低炎症细胞的浸润情况。根据本发明的一实施例，所述乳酸菌在幽门螺杆菌引发的胃炎治疗中能够增加有益菌群的丰度。根据本发明的一实施例，所述乳酸菌在幽门螺杆菌引发的胃炎预防中能够增加有益菌群的丰度。根据本发明的一实施例，所述乳酸菌在幽门螺杆菌引发的胃炎预防中能够降低致病菌群的丰度。根据本发明的一实施例，所述乳酸菌在幽门螺杆菌引发的胃炎治疗中能够降低治病菌群的丰度。根据本发明的一实施例，所述乳酸菌在幽门螺杆菌引发的胃炎预防中能够提高肝脏中的谷胱甘肽的含量。根据本发明的一实施例，所述乳酸菌在幽门螺杆菌引发的胃炎治疗中能够提高肝脏中的谷胱甘肽的含量。根据本发明的一实施例，所述乳酸菌在幽门螺杆菌引发的胃炎预防中能够上调胃粘膜中促炎性细胞因子il-6和ifn-γ表达量。根据本发明的一实施例，所述乳酸菌在幽门螺杆菌引发的胃炎治疗中能够上调胃粘膜中促炎性细胞因子il-6和ifn-γ表达量。根据本发明的一实施例，所述乳酸菌是指包含菌体表面物质或菌体分泌物质其中的一或全部组合的培养液。根据本发明的另一方面，本发明提供了一乳酸菌的应用，其应用一植物乳杆菌zj316防治幽门螺杆菌引发的胃炎，cctccno：m208077。根据本发明的一实施例，所述乳酸菌应用于增加有益菌群的丰度。根据本发明的一实施例，所述乳酸菌应用上调胃粘膜中促炎性细胞因子il-6和ifn-γ表达量。根据本发明的一实施例，所述乳酸菌应用于提高肝脏中的谷胱甘肽的含量。根据本发明的一实施例，所述乳酸菌是指包含菌体表面物质或菌体分泌物质其中的一或全部组合的培养液。根据本发明的另一方面，本发明提供了一种食物产品，其包含乳酸菌及一可食性材料，所述乳酸菌是植物乳杆菌zj316，cctccno：m208077。根据本发明的一实施例，所述可食性材料选自于组合水、流体乳品、浓缩牛奶、酸奶、酸乳、冷冻优格、乳杆菌发酵饮料、奶粉、冰淇淋、奶酪、干酪、豆浆、发酵豆浆、蔬果汁、果汁、运动饮料、甜点、果冻、糖果、婴儿食品、健康食品、动物饲料、中草药组合物及膳食补充品中的一种或者几种。根据本发明的一实施例，所述乳酸菌是指包含菌体表面物质或菌体分泌物质其中的一或全部组合的培养液。根据本发明的一实施例，所述乳酸菌是活菌或者是死菌。附图说明图1是预防组处理时间点。图2是预防组不同组别小鼠体重动态变化。图3是预防组小鼠胃粘膜he染色结果。图4是小鼠胃粘膜炎症因子变化情况，*表示与yh相比p<0.05显著。图5是otu累计曲线图。图6是outrank曲线。图7是小鼠胃微生物菌群在“门”水平上的分布情况。图8是小鼠胃微生物菌群在“属”水平上的分布情况。图9a、9b分别为β多样性热图注：图9a是基于非加权距离，图9b是基于加权距离。图10a和图10b分别为预防组lefse分析注：图10(a)为聚类树图，图10(b)为统计不同分组中有显著作用的微生物类群通过lad分析后得到的lad分值，不同颜色代表不同分组。图11是预防组幽门螺杆菌属风度情况。图12是治疗组处理时间点。图13是治疗组不同组别小鼠体重动态变化。图14是治疗组小鼠胃粘膜he染色结果。图15是小鼠胃粘膜炎症因子变化情况，*表示与yh相比p<0.05显著。图16是otu累计曲线图。图17是outrank曲线。图18是小鼠胃微生物菌群在“门”水平上的分布情况。图19是小鼠胃微生物菌群在“属”水平上的分布情况。图20a、20b分别为β多样性热图注：图20a是基于非加权距离，图20b是基于加权距离。图21a和图21b分别为预防组lefse分析注：图21(a)为聚类树图。图21(b)为统计不同分组中有显著作用的微生物类群通过lad分析后得到的lad分值，不同颜色代表不同分组。图22是治疗组幽门螺杆菌属风度情况。具体实施方式以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。根据本发明的一方面，本发明提供了一乳酸菌，其中所述乳酸菌可进一步添加一可食性材料，以制备为一种食品产品，其中该可食性材料包含，但不限于：水(water)、流体乳品(fluidmilkproducts)、牛奶(milk)、浓缩牛奶(concentratedmilk)；发酵乳品(fermentedmilk)，诸如酸奶(yogurt)、酸乳(sourmilk)、冷冻优格(frozenyogurt)、乳杆菌发酵饮料(lacticacidbacteria-fermentedbeverages)；奶粉(milkpowder)；冰淇淋(icecream)；奶酪(creamcheeses)；干酪(drycheeses)；豆奶(soybeanmilk)；发酵豆奶(fermentedsoybeanmilk)；蔬果汁(vegetable-fruitjuices)；果汁(juices)；运动饮料(sportsdrinks)；甜点(confectionery)；果冻(jellies)；糖果(candies)；婴儿食品(infantformulas)；健康食品(healthfoods)；动物饲料(animalfeeds)；中草药材(chineseherbals)；膳食补充品(dietarysupplements)等。本发明所使用的可食性材料可为膳食补充品，可以下列方式给予服用者：与合适的可饮用液体混合，例如水、酸奶酪、牛奶或果汁；或可与固体或液体食品进行混合。本说明书中，膳食补充品的形式可为锭剂、丸剂、胶囊、药锭糖(lozenge)、颗粒、粉剂、悬浮剂、小药囊、软锭剂、糖果、糖浆及相应的投予形式，通常为单位剂量的形式，并以制备膳食补充品的常规方法制造。本发明所提供的乳酸菌可以为死菌或活菌的培养液。以下实施仅为例示，剂量可依据变异而改变，而不限于使用的化合物的活性、治疗疾病或生理状态、给药方式、个体需求、疾病严重性、及医师判断。根据本发明的另一方面，本发明基于植物乳杆菌zj316通过预防作用对幽门螺杆菌感染c57bl/6j小鼠模型的影响展开了研究，通过检测免疫反应和胃微生态各个指标来评价植物乳杆菌zj316对小鼠胃炎症状的改善作用，得出主要结论如下：1.植物乳杆菌zj316通过预防作用对幽门螺杆菌感染小鼠的体重、正常的饮食饮水、活动情况均无影响。2.植物乳杆菌zj316通过预防作用降低了炎症细胞的浸润情况，显著下调小鼠胃粘膜中促炎性细胞因子(il-6和ifn-γ)表达量，并上调抑炎性细胞因子(il-10)表达量。3.植物乳杆菌zj316能通过预防作用使胃炎小鼠胃粘膜中lactobacillus等有益菌群的多样性和丰度增加，同时降低helicobacter、clostridium等致病菌菌群的丰度，有利于维持小鼠的胃微生态菌群平衡稳定的状态。4.幽门螺杆菌感染小鼠后可以引起肝脏中谷胱甘肽含量的下降，植物乳杆菌zj316能通过预防作用提高肝脏中的谷胱甘肽的含量，降低宿主由幽门螺杆菌感染引起的氧化损伤。根据本发明的另一方面，本发明基于植物乳杆菌zj316通过治疗作用对幽门螺杆菌感染c57bl/6j小鼠模型的影响展开了研究，通过检测免疫反应和胃微生态各个指标来评价植物乳杆菌zj316对小鼠胃炎症状的改善作用，得出主要结论如下：1.植物乳杆菌zj316通过治疗作用对幽门螺杆菌感染小鼠的体重、正常的饮食饮水、活动情况均无影响。2.植物乳杆菌zj316通过治疗作用降低了炎症细胞的浸润情况，并显著下调小鼠胃粘膜中促炎性细胞因子(il-6和ifn-γ)表达量。3.植物乳杆菌zj316能通过治疗作用使胃炎小鼠胃粘膜中lactobacillus、roseburia等有益菌群的多样性和丰度增加，同时降低prevotella、helicobacter等致病菌菌群的丰度，有利于维持小鼠的胃微生态菌群平衡稳定的状态。4.幽门螺杆菌感染小鼠后可以引起肝脏中谷胱甘肽含量的下降，植物乳杆菌zj316能通过治疗作用提高肝脏中的谷胱甘肽的含量，降低宿主由幽门螺杆菌感染引起的氧化损伤。所述植物乳杆菌zj316(lactobacillusplantarumzj316)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号cctccno：m208077，保藏日期2008年5月23日，其分离自婴儿粪便中。具体的研究方法和技术效果如下所示：一、植物乳杆菌zj316预防小鼠感染幽门螺杆菌的研究实验材料与方法实验菌株植物乳杆菌(lactobacillusplantarumzj316)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosuslgg)为本实验室保存。幽门螺杆菌(helicobacterpylorizjc03)为浙江大学医学院邵逸夫医院就诊的胃炎和消化性溃疡患者的胃黏膜组织中分离得到的。实验动物选用6周龄雌性spf(specificpathogenfree，无特定病原体)级c57bl/6j小鼠，48只均购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，购买后置于上海市公共卫生临床中心实验动物部动物房饲养。动物房温度为24±2℃、昼夜交替各12小时的环境下，每一周需更换垫料、饲料和饮用水。其中饮用水和垫料需进行高温高压灭菌。饲料购于上海仕林生物科技有限公司。主要试剂与耗材表1实验试剂与耗材tab.1listofmainreagentsandconsumables实验仪器与设备表2主要仪器与设备tab.2listofmainequipments培养基配制mrs液体培养基的配制：称取52.4g培养基，加热溶解于1000ml超纯水中，121℃高压灭菌15分钟，备用。mrs固体培养基的配制：称取52.4g培养基，并加入1.5％的琼脂，加热溶解于1000ml超纯水中,121℃高压灭菌15分钟,备用。哥伦比亚血琼脂基础(cab)培养基：称取9g培养基，加热溶解于1000ml超纯水中，121℃高压灭菌15分钟，备用。脑心浸出液(bhi)肉汤培养基：称取25g培养基，加热溶解于500ml超0纯水中，121℃高压灭菌15分钟,备用。实验方法与内容菌种活化与培养(1)乳酸菌的活化与培养将在-80℃甘油管冻存的乳酸菌放置室温解冻，用接种环挑取甘油管中的菌液，在灭过菌的mrs固体平板上划线接种，用封口膜封住平板，放入37℃培养箱中24h进行培养复苏，重复以上步骤，两次传代活化后，挑取乳酸菌单菌落至mrs液体培养基中，37℃恒温静置培养16-18h，菌液以8000r/min离心10分钟，收集上清液备用。用生理盐水洗涤两次菌泥后，再用生理盐水重悬，使菌悬液活菌数达约1×109cfu/ml。备用。(2)幽门螺杆菌的活化与培养将在-80℃甘油管冻存幽门螺杆菌放置室温解冻，在加入抗生素以及7％无菌绵羊血的cab血琼脂平板上划线接种，放入含有微需养袋的厌氧盒(85％n2、10％co2、5％o2)中，37℃培养48h-72h进行复苏，经活化两代后，将菌体用bhi液体培养基冲下制成1×108cfu/ml菌悬液，备用。乳酸菌预防作用于幽门螺杆菌小鼠胃炎模型的建立48只c57bl/6j小鼠，适应性培养1周后，分为6组，每组8只，小鼠均在正常饮食条件下，进行实验处理，具体处理如下：(1)yh组(n＝8)：灌胃生理盐水400μl/只/天21天，21天后灌胃bhi400μl/只三次，隔天一次。(2)ygh组(n＝8)：灌胃植物乳杆菌zj316400μl/只/天21天，21天后灌胃bhi400μl/只三次，隔天一次。(3)yth组(n＝8)：灌胃鼠李糖乳杆菌lgg400μl/只/天21天，21天后灌胃bhi400μl/只三次，隔天一次。(4)yg组(n＝8)：灌胃生理盐水400μl/只/天21天，21天后h.pylori菌悬液400μl/只三次，隔天一次。(6)yt组(n＝8)：灌胃植物乳杆菌zj316400μl/只/天21天，21天后h.pylori菌悬液400μl/只三次，隔天一次。(7)yc组(n＝8)：灌胃鼠李糖乳杆菌lgg400μl/只/天21天，21天后h.pylori菌悬液400μl/只三次，隔天一次。在动物实验期间每周称重一次并观察小鼠活动生长状态。造模结束，进行无处理正常饮食饲养35天，脊椎脱臼法处死，并在生物安全柜中解剖小鼠。无菌操作切除胃底，用无菌生理盐水清洗剩余胃粘膜组织，并将其分成三部分，放在冻存管中，液氮处理，-80℃冷藏，用于之后实验指标的测定。同时取出肝脏制备组织均浆液用于谷胱甘肽指标的测定。其中，幽门螺杆菌造模组(yg组)的胃黏膜需立即放入尿素酶指示剂中，确认是否成功建立幽门螺杆菌感染小鼠模型。预防组处理时间可参考附图1所示。胃粘膜组织切片、h&e染色及组织损伤评价(1)胃粘膜石蜡切片的制作石蜡切片的制作过程主要包括取样、固定、去除固定液，脱水、透明、浸蜡、修整和切片。取样和固定：取胃粘膜50mg左右于通用型组织固定液(中性)中固定18-24h。去除固定液：然后将固定好的组织用流水冲洗24h以除去固定液。脱水：选择不同浓度梯度的乙醇作为脱水剂对胃粘膜组织进行脱水。70％乙醇(30min)、80％乙醇(30min)、90％乙醇(30min)，95％乙醇(20min)和100％乙醇(20min)透明：脱水后的结肠组织于酒精和二甲苯等比混合液中放置15min，后再浸入二甲苯i和二甲苯ii各15min来完成透明工作；浸蜡、修整和切片：将透明后的结肠组织用eg1160石蜡包埋机(徕卡)进行石蜡包埋。将包埋好结肠组织待石蜡凝固，根据组织小块的位置对石蜡块进行修整；修整好的石蜡块采用rm2235轮转式切片机(徕卡)进行切片(5μm)。(2)胃粘膜切片h&e染色胃粘膜切片h&e染色步骤主要包括展片和捞片、烤片、水化、脱水、苏木精染色、分化、漂洗、伊红复染、脱水、透明、封片，具体操作如下：展片和捞片：将切好的胃粘膜切片置于45℃恒温水浴中进行展片，将展好的切片用载玻片小心地捞出；烤片：将切片置于37℃烘箱中过夜烘烤；水化：二甲苯i15min，二甲苯ii5min，二甲苯：无水乙醇(1:1)2min脱水：100％乙醇i5min，100％乙醇ii5min，80％乙醇5min，蒸馏水5min苏木精液染色：苏木精染色液中5min，水洗30min分化与漂洗：1％盐酸乙醇30s，水洗30s，蒸馏水过洗5s伊红复染：0.5％伊红液染色1-3min脱水：蒸馏水稍洗30s，80％乙醇稍洗30s，95％乙醇i1min，95％乙醇ii1min，无水乙醇i3min，无水乙醇ii3min透明：二甲苯i3min，二甲苯ii3min封片：用中性树胶封片。封片结束后用nikoneclipseci光学显微镜观察并拍照。成像系统为：nikondigitalsightds-fi2，摄片倍数：400×、200×。各组分别随机选出4只对其胃粘膜组织切片进行组织损伤评价。胃粘膜组织中炎症因子的测定(1)胃粘膜组织中总rna抽提1)取匀浆管，加入1ml的trizolreagent，置冰上预冷。2)取100mg组织，加入到匀浆管中。3)匀浆仪充分研磨直至无可见组织块。4)12000rpm离心10min取上清。5)加入250μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。6)4℃下12000rpm离心10min。7)将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。8)-20℃放置15min。9)4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为rna。10)吸除液体，加入75％乙醇1.5ml洗涤沉淀。11)4℃下12000rpm离心5min。12)将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。13)加入15μl无rna酶的水溶解rna。14)55℃孵育5min。15)使用nanodrop2000检测rna浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl待测rna溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。16)将浓度过高的rna进行适当比例的稀释，使其终浓度为100-500ng/μl.(2)胃粘膜组织中rna反转录为cdna1)取pcr管，加入含10μlrna的溶液。2)加入1μloligo(dt)18。3)用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。4)于pcr仪上65℃保温5min，迅速置冰上冷却。5)依次加入4μl5×reactionbuffer，2μl10mmdntpmix，1μlribolockrnaase抑制剂(20u/μl))和1μlrevertaim-mulv逆转录酶(200u/μl)，用枪抽吸混匀。6)于pcr仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。(3)实时荧光定量pcr根据要求配制实时荧光定量pcr(rt-qpcr)体系，用荧光定量pcr仪steponeplus进行rt-qpcr，并通过溶解曲线和扩增曲线评估实时荧光定量pcr数据质量。如表3反应体系，以gapdh作为内参基因，对各个基因水平进行标准化。rt-qpcr扩增体系为：预变性95℃，10min，95℃15s，60℃30s循环40次，熔解曲线60℃到95℃，每15s升温0.3℃。rt-qpcr引物序列见表4。采用2-δδct法对数据进行分析。表3rt-qpcr反应体系tab.3rt-qpcrreactionsystem表4rt-qpcr引物序列tab.4primersequencesforquantitativereal-timepolymerasechainreaction16srrna基因高通量测序检测小鼠胃微生态组成及其变化情况将3.2.6.2中液氮处理过的，冻存管中胃粘膜组织，交由华大基因提取dna并进行测序。肝脏组织中谷胱甘肽检测具体步骤按微量还原型谷胱甘肽(gsh)测试盒说明书(南京建成生物工程研究所)进行测定，通过公式计算出gsh的含量.数据处理及分析方法利用spss23.0统计软件和originpro9.0作图软件进行数据分析和作图。组间显著性差异分析比较采用单因素方差分析法(avova)，*表示为p<0.05，具有统计学意义。结果分析与讨论小鼠体重的动态变化及生长活动情况造模结束后，幽门螺杆菌造模组(yg组)的胃黏膜立即放入尿素酶指示剂中，瞬间变色，说明已成功建立幽门螺杆菌感染小鼠模型。在为期68天探究植物乳杆菌zj316对幽门螺杆菌感染小鼠的预防作用的实验中，各组体重变化情况如图2所示。适应性培养一周后，对小鼠的体重进行称重，此时小鼠体重均达到17.71±1.03g。经过68天的培养造模，体重最终均达到22.54±0.93g。第4周，个别小鼠的体重略有下降，可能是连续灌胃对小鼠的生长有一定影响，也属于正常范围内的体重波动。在为期68天的实验过程中，各组小鼠在造模期间，小鼠的饮食饮水情况无显著差异，由此可见，h.pylori感染小鼠进行造模对其的体重、正常的饮食饮水、活动情况均无影响。大量研究证明，h.pylori感染是一个缓慢的发病过程并对动物机体的体重和饮食情况无太大影响。和本研究的实验结果一致。胃粘膜h&e病理染色观察及组织损伤评价组织病理染色观察与组织损伤评价是当下诊断胃炎严重程度的有效手段，被广泛用于临床检查。不同预防处理组小鼠胃粘膜染色结果如图3所示。yh组、ygh组和yth组均没有灌胃幽门螺杆菌，染色结果可以看出组织粘膜层结构清晰，上皮完整，粘膜层腺体排列紧密，形态正常，未见明显炎症反应。yg组只灌胃幽门螺杆菌，染色结果显示虽然组织结构完整，粘膜层腺体排列紧密，但少量腺上皮细胞肿胀，胞质呈空泡状(黑色箭头)，局部粘膜层及粘膜下层可见较多炎性细胞浸润，有粒细胞、淋巴细胞等(红色箭头)。yt组通过提前灌胃植物乳杆菌zj316来预防幽门螺杆菌的感染，染色结果显示组织结构完整，粘膜层腺体排列紧密，粘膜下层少量淋巴细胞浸润(红色箭头)，未见其它明显异常。而yc组通过提前灌胃鼠李糖乳杆菌lgg来预防幽门螺杆菌的感染，染色结果显示组织粘膜层结构清晰，粘膜层腺体排列紧密，形态正常，粘膜下层可见少量炎性细胞浸润，有淋巴细胞、肥大细胞等(黑色箭头)。由以上结果可以看出，植物乳杆菌zj316和鼠李糖乳杆菌lgg均可以起到对幽门螺杆菌感染引起的炎症反应的预防作用，减小炎症细胞的浸润，但植物乳杆菌zj316的预防效果更为明显。小鼠胃粘膜炎症因子的变化情况幽门螺杆菌定植于胃黏膜，其产生的代谢产物持续刺激可引起局部特异性免疫反应。大量体内实验证实胃黏膜被幽门螺杆菌感染后主要发生以th1型为主的免疫反应，诱导产生致炎因子白细胞介素il-6、干扰素ifn-γ以及th2细胞应答产生抗炎因子il-10。不同预防组小鼠胃粘膜炎症因子的变化情况如图4所示。和yh组相比较，在68天实验结束后，yg组被幽门螺杆菌感染后无任何防治措施的情况下ifn-γ、il-6均出现的明显的升高，il-10出现明显的下降，表明灌胃幽门螺杆菌能激起机体的炎症反应，导致致炎因子增加，抑炎因子的减少。但通过灌胃植物乳杆菌zj316和鼠李糖乳杆菌lgg对幽门螺杆菌进行预防的yt组和yc组，与yg组相比较，ifn-γ、il-6均出现的明显的下降，il-10出现明显的上升，表明灌胃植物乳杆菌zj316和鼠李糖乳杆菌lgg对幽门螺杆菌感染引起的炎症反应有一定的预防作用。只灌胃乳酸菌的ygh组和yth组各炎症因子指标和yh组基本在一个水平上，无显著性变化，表明灌胃乳酸菌对小鼠胃粘膜免疫无影响。以上和小鼠胃粘膜h&e病理染色观察结果类似，证明植物乳酸菌zj316灌胃可以预防由幽门螺杆菌感染所引起的炎症反应。16srrna基因高通量测序检测小鼠胃微生态变化情况分析16srrna基因高通量测序结果采用illuminamiseq测序平台对6组小鼠48个胃样品中微生物群落进行16srrna(v4高变区)进行测序，序列拼接使用软件flash(fastlengthadjustmentofshortreads，v1.2.11)，利用重叠关系将双末端测序得到的成对reads组装成一条序列，得到高变区的tags。获得到的数据在进行拼接得到最终的数据如表5所示。可以看出，48个胃样品测序数据获得的有效tags序列总数为2472780条，其中yc组样品有50829±1342条，yg组样品有51265±673条，ygh组样品有52186±130条，yh组样品有52078±74条，yt组样品有50690±1339条，yth组样品有52047±49条，测序结果获得的tags拼接率均达到97％以上，说明测序结果比较理想。otu(operationaltaxonomicunits)是在系统发生学或群体遗传学研究中，将序列按照彼此的相似性归为很多小组，每个小组为一个otu。通常利用软件usearch(v7.0.1090)将相似度在97％的以上的tags聚类为一个otu。表5高通量测序序列基本信息tab.5informationofilluminasequencing(1)物种累积曲线图物种累积曲线图主要用于反映测序数据量是否达到要求,横坐标代表样品数目，纵坐标代表otu数目(检测到的物种数)，物种累计曲线反应的就是抽样个数对物种多样性的影响；当抽样个数较少时，发现的物种并不全面，并不能表征整个群落结构，随着抽样个数的上升，发现的物种数越来越多，也更能表征这个群落结构。在实际分析中，如果曲线末端部分还呈现急剧上升的趋势，表明抽样量不足，测序深度不够，需增加样本量，还能继续发现新的物种；当曲线末端上升趋势趋于平缓时，则表明采样量足够，即测序深度满足实验要求。图3.5可以看出曲线末端上升趋势趋于平缓时，则表明采样量足够，即测序深度满足实验要求。(2)丰富等级曲线oturank曲线不同与物种累计曲线是展现样品中物种多样性的一种形式，可以同时解释样品多样性的两个方面，即样品所含物种的丰富程度和均匀程度。计算每个otu在每个样品中的相对丰度，然后按丰度从大到小进行排列，以otu的等级作为横坐标，以otu的相对丰度作为纵坐标进行作图。横坐标按样品otu丰度排序(由高至低)，纵坐标为otu丰度。样品中物种的丰富程度由曲线的横轴长度来反映，曲线越宽，说明样品中物种组成越丰富。样品中物种的均匀度由曲线纵轴的形状来反映，曲线越平坦，说明样品中物种组成的均匀度越高。由图6可知，随着样本out丰度的增加，曲线在水平方向上跨度变大，垂直方向上趋于平滑，说明物种丰富且分布越均匀。植物乳杆菌zj316通过预防作用对小鼠胃粘膜菌群结构组成的影响(1)植物乳杆菌zj316在“门”水平上对小鼠胃粘膜菌群结构组成的影响根据otu的物种注释的结果，在细菌“门”水平基础上对6个组别的小鼠胃粘膜样品中的菌群分别进行分析，绘制柱状图如图7所示。各分组小鼠胃粘膜中的优势菌群分别为厚壁菌门(firmicutes)、拟杆菌门(bacteroidetes)、和变形菌门(proteobacteria)，其中厚壁菌门和拟杆菌门是占比最高的菌群，平均占到了每个样品总out的70％左右。厚壁菌门中的细菌细胞壁含肽聚糖量较高，多为球状或杆状，其中主要包括芽孢杆菌纲、梭菌纲、丹毒丝菌纲等。厚壁菌门生命力顽强可以抵抗脱水等极端环境。其中芽孢杆菌纲(bacilli)中的乳酸菌目(lactobacillales)有促进胃肠道消化、维持胃肠道的健康等益生功能。拟杆菌门中的拟杆菌纲(bacteroidia)细菌可以帮助宿主分解多糖提高其多糖营养利用率、加快胃肠黏膜的血管形成、促进免疫系统发育以提高其免疫力，同时可以维持胃肠道内微生态平衡。变形菌门(proteobacteria)是细菌中最大的一门，包括大肠杆菌、沙门氏菌、幽门螺旋杆菌等病原菌，是主要胃肠道疾病的始作俑者。由图7可以看出，yg组因为受到了幽门螺杆菌的感染并没有采取任何防治措施，其中变形菌门(proteobacteria)比例较其他组明显增加。ygh组和yth组仅分别灌胃植物乳杆菌316和鼠李糖乳杆菌lgg，这两组中的厚壁菌门(firmicutes)和拟杆菌门(bacteroidetes)总和在所有组中占比最高，说明摄入乳酸菌有利于增加胃肠中的益生菌的数量，维持机体健康。植物乳杆菌zj316预防后处理组(yt组)中变形菌门(proteobacteria)的数量较yg组有明显的下降，厚壁菌门(firmicutes)和拟杆菌门(bacteroidetes)的数量也有所上升，说明在“门”水平上对小鼠胃粘膜菌群结构变化可以看出植物乳杆菌zj316通过预防作用可以起到一定的抑制致病菌繁殖的效果。(2)植物乳杆菌zj316在“属”水平上对小鼠胃粘膜菌群结构组成的影响在“属”水平对6个组别的小鼠胃粘膜样品中相对丰度前15的菌群绘制柱状图如图8所示，并进行分析6组样品在属水平上的菌群，主要包含lactobacillus、helicobacter、staphylococcus和veillonella等多个属，其中lactobacillus含量最高，从侧面也可以反映出lactobacillus是胃肠道中的主要菌群，负责维持宿主胃肠道微生态平衡。由图8得知，经植物乳杆菌zj316和鼠李糖乳杆菌lgg预防后处理组(yt组、yc组)明显比幽门螺杆菌造模组(yg)，致病菌的含量有所下降，其中helicobacter下降最为明显，且yt组效果相比于yc组更加明显。说明在“属”水平上对小鼠胃粘膜菌群结构变化可以看出植物乳杆菌zj316通过预防作用可以起到一定的抑制幽门螺杆菌的效果。预防组小鼠胃粘膜中菌群的β多样性分析β多样性(betadiversity)分析是用来比较一对样品在物种多样性方面存在的差异大小。unifrac是通过利用系统进化的信息来比较样品间的物种群落差异，分为加权unifrac(weightedunifrac)与非加权unifirac(unweightedunifrac)2种，其中weightedunifrac考虑了序列的丰度，unweightedunifrac不考虑序列丰度。图9a和图9b分别为beta多样性矩阵heatmap。beta多样性热图的指数越大，样本间差异越大。进化树距离越近，样本相似性越大。如图9a和图9b可以看出同一组别的平行样品除个别样品均比较好的聚在一起，说明样品测序的平行性比较好。从图中可以看出加权unifrac(weightedunifrac)与非加权unifirac(unweightedunifrac)进行比较，同一组别的样品聚类效果较差，在把物种丰度考虑进去时，小鼠个体之间的胃微生物菌群还是具有比较大的差异性，但还是可以看出不同组别的样品差异性明显更大。空白对照组(yh组)和幽门螺杆菌造模组(yg组)热度指数差距较大，热度颜色具有明显的差异性，说明这两组小鼠胃粘膜微生物菌群在整体上存在很大差异。同时植物乳杆菌316预防处理组(yt组)和幽门螺杆菌造模组(yg组)也是存在一定热度指数差距，所以，这也从侧面说明对小鼠灌胃植物乳杆菌zj316进行预防处理一定程度上可以抑制幽门螺杆菌生长对胃微生物菌群的改变。各预防处理组小鼠胃粘膜中物种显著性差异分析为了达到可以具体分析各组间在丰度上有显著物种差异(biomarke)的目的，选用了lefse进行分析。lefse分析即ldaeffectsize分析，是一种线性判别分析方法，用于发现高维生物标识和揭示基因组特征的软件，用于区别两个或两个以上生物条件(或者是类群)。一个颜色圈点代表一个biomarker，黄色节点表示的是在不同分组中没有起到重要作用的微生物类群。从内到外，各圈依次是门、纲、目、科、属水平的物种。为比较分析幽门螺杆菌感染造模组和植物乳杆菌处理预防组相关菌群的显著差异，用lefse分别对yg、yc、yt、yth、ygh、yh组六组的菌群相对丰度进行比较分析，以找出显著性变化的菌群。如图10a和图10b所示，其中幽门螺杆菌造模组(yg)的胃微生物菌群中发生了显著性增加的菌群为“门”水平上的bacteroidetes，“纲”水平上的epsilonproteobacteria、bacteroidia，“目”水平上的campylobacterales、bacteroidales，“科”水平上的helicobacteraceae、prevotellaceae、porphyromomadaceae、odoribacteraceae、eubacteriaceae、clostridiaceae、rhizobiaceae，“属”水平上的helicobacter、parabacteroides、clostridium、odoribacter、roseburia、candidatus、arthromitus、anaerofustis、agrobacterium等。其中helicobacter能引起慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃癌等多种消化道疾病，属于致病菌的一种；clostridium能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生外毒素、导致组织严重气肿，影响血液供应，从而导致造成组织大面积坏死；parabacteroides、odoribacter是用于维持动物肠道健康的一种常见菌，有利于超重和肥胖孕妇血压的调节。roseburia是常寄生于人的皮肤、口腔、胃肠粘膜等处，当机体免疫机能低下或正常寄居部位的微生态环境失调，容易引起念珠菌病，是一种条件致病菌。植物乳杆菌zj316预防处理组(yt)胃微生物菌群中发生了显著性增加的菌群为“科”水平上的dehalobacteriaceae、geodermatophilaceae以及“属”水平上的proteus、geodermatophilus、dehalobacterium。proteus是人和动物的寄生菌和病原菌，存在于人和动物的肠道内，但一般情况下不致病。geodermatophilus、dehalobacterium也均无致病性。鼠李糖乳杆菌lgg预防处理组(yc)胃微生物菌群中发生了显著性增加的菌群为“门”水平上的verrucomicrobia，“纲”水平上的verrucomicrobiae，“目”水平上的verrucomicrobiales，为“科”水平上的streptococcaceae，“属”水平上的streptococcus、jeotgalicoccus、akkermansia。streptococcus大多数不致病但可能引起化脓性炎症和毒素性疾病等。jeotgalicoccus属于厚壁菌门，无致病性。akkermansia是微疣菌门的唯一成员。在人体内的含量丰富，分布于在动物的胃肠道表面，可以高达1-5％。肠道内的akkermansia越多，可以减少肥胖、炎症和2型糖尿病等病症的发生，其膜上的一种耐高温的细菌蛋白还可以促进肠道的屏障功能。结果表明，植物乳杆菌zj316通过预防作用，提高了小鼠胃粘膜中lactobacillus等益生菌的丰度而降低了helicobacter、clostridium等致病菌的丰度。由图11可知，yg组中，幽门螺杆菌属(helicobacter)的平均相对丰度为0.190，而在yt组，幽门螺杆菌的丰度降到了0.090，yc组幽门螺杆菌丰度降到了0.016，表明经乳酸菌预防处理过的小鼠在受到幽门螺杆菌感染后，通过上述胃微生态菌群显著差异和幽门螺杆菌属风度的改变可以看出，乳酸菌具有一定的预防作用，能起到保护胃微生态环境、减少胃中致病菌含量、降低胃中幽门螺杆菌的定植率的作用。其中植物乳杆菌zj316相对于鼠李糖乳杆菌lgg效果更佳。肝脏组织中谷胱甘肽的含量分析大量研究报道表明，幽门螺杆菌中的空泡毒素(vaca)会对胃上皮细胞造成谷胱甘肽(gsh)代谢损伤。谷肌甘肽是生物体内抗氧化防御系统中最重要的小分子活性寡肽，具有维持免疫系统的功能。胃肠道组织中的氧化应激以及氧化还原反应与幽门螺杆菌的感染有很大关系。小鼠肝脏组织中谷胱甘肽的含量如表6所示，幽门螺杆菌感染造模组(yg组)肝脏中的gsh含量较低，含量为1.43±0.23μmol/gprot。植物乳杆菌zj316预防处理组(yt组)和鼠李糖乳杆菌lgg预防处理组(yc组)相比于yg组含量有所升高，分别为1.65±0.07μmol/gprot、1.54±0.16μmol/gprot。yt组相比于yc组含量升高的较多。本实验结果推测植物乳杆菌zj316可能是通过抗氧化作用保护机体免受幽门螺杆菌感染引起的氧化性损伤。表3.6小鼠肝脏组织中谷胱甘肽的含量tab.3.6thelevelsofgshinliverofmice二、植物乳杆菌zj316对幽门螺杆菌感染小鼠的治疗作用实验材料与方法实验菌株植物乳杆菌(lactobacillusplantarumzj316)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosuslgg)为本实验室保存。幽门螺杆菌(helicobacterpylorizjc03)为浙江大学医学院邵逸夫医院就诊的胃炎和消化性溃疡患者的胃黏膜组织中分离得到的。实验动物40只小鼠为6周龄雌性spf(specificpathogenfree，无特定病原体)级c57bl/6j小鼠，40只均购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，购买后置于上海市公共卫生临床中心实验动物部动物房饲养。动物房温度为24±2℃、昼夜交替各12小时的环境下，每一周需更换垫料、饲料和饮用水。其中饮用水和垫料需进行高温高压灭菌。饲料购于上海仕林生物科技有限公司。主要试剂与耗材表7实验试剂与耗材tab.7listofmainreagentsandconsumables实验仪器与设备实验所用仪器与设备参考上述的描述。培养基及相关溶液配制培养基的配制mrs液体培养基的配制：称取52.4g培养基，加热溶解于1000ml超纯水中，121℃高压灭菌15分钟，备用。mrs固体培养基的配制：称取52.4g培养基，并加入1.5％的琼脂，加热溶解于1000ml超纯水中,121℃高压灭菌15分钟,备用。哥伦比亚血琼脂基础(cab)培养基：称取9g培养基，加热溶解于1000ml超纯水中，121℃高压灭菌15分钟，备用。脑心浸出液(bhi)肉汤培养基：称取25g培养基，加热溶解于500ml超纯水中，121℃高压灭菌15分钟,备用。其它溶液配制联合抗生素的配制：按抗生素的使用说明书，换算成小鼠剂量。取12.5g阿莫西林、82.5mg奥美拉唑、2.1g克拉霉素溶于1l无菌水中，充分混匀，放入4°冰箱中备用。实验方法与内容菌种活化与培养(1)乳酸菌的活化与培养将在-80℃甘油管冻存的乳酸菌放置室温解冻，用接种环挑取甘油管中的菌液，在灭过菌的mrs固体平板上划线接种，用封口膜封住平板，放入37℃培养箱中24h进行培养复苏，重复以上步骤，两次传代活化后，挑取乳酸菌单菌落至mrs液体培养基中，37℃恒温静置培养16-18h，菌液以8000r/min离心10分钟，收集上清液备用。用生理盐水洗涤两次菌泥后，再用生理盐水重悬，使菌悬液活菌数达约1×109cfu/ml。备用。(2)幽门螺杆菌的活化与培养将在-80℃甘油管冻存幽门螺杆菌放置室温解冻，在加入抗生素以及7％无菌绵羊血的cab血琼脂平板上划线接种，放入含有微需养袋的厌氧盒(85％n2、10％co2、5％o2)中，37℃培养48h-72h进行复苏，经活化两代后，将菌体用bhi液体培养基冲下制成1×108cfu/ml菌悬液，备用。乳酸菌治疗作用于幽门螺杆菌小鼠胃炎模型的建立40只c57bl/6j小鼠，适应性培养1周后，分为5组，每组8只，均在正常饮食条件下，进行实验操作，具体处理如下：(1)zh组(n＝8)：灌胃bhi培养基400μl/只/天，隔天一次，三周后每天灌胃生理盐水400μl/只/天持续四周。(2)zt组(n＝8)：灌胃h.pylori菌悬液400μl/只，隔天一次灌胃三周，三周后每天灌胃生理盐水400μl/只/天持续四周。(3)zc组(n＝8)：灌胃h.pylori菌悬液400μl/只，隔天一次灌胃三周，三周后每天灌胃植物乳杆菌zj316400μl/只/天持续四周。(4)zg组(n＝8)：灌胃h.pylori菌悬液400μl/只，隔天一次灌胃三周，三周后每天灌胃鼠李糖乳杆菌lgg400μl/只/天四周。(5)zi组(n＝8)：灌胃h.pylori菌悬液400μl/只，隔天一次灌胃三周，三周后灌胃联合抗生素10天，10天后继续灌胃生理盐水400μl/只/天持续18天。在动物实验期间每周称重一次并观察小鼠活动生长状态。造模结束，脊椎脱臼法处死，并在生物安全柜中解剖小鼠。无菌操作切除胃底，用无菌生理盐水清洗剩余胃粘膜组织，并将其分成三部分，放在冻存管中，液氮处理，-80℃冷藏，用于之后实验指标的测定。同时取出肝脏制备组织均浆液用于谷胱甘肽和丙二醛指标的测定。其中，幽门螺杆菌造模组(zt组)的胃黏膜需立即放入尿素酶指示剂中，确认是否成功建立幽门螺杆菌感染小鼠模型。治疗组处理时间点可参考附图12所示。胃粘膜组织切片、h&e染色及组织损伤评价具体实验方法参考上述的描述。胃粘膜组织中炎症因子的测定具体实验方法参考上述的描述。16srrna基因高通量测序检测小鼠胃微生态组成及其变化情况将上述建立的幽门螺杆菌小鼠胃炎模型中液氮处理过的，冻存管中胃粘膜组织，交由华大基因提取dna并进行测序。肝脏组织中谷胱甘肽的检测具体实验方法参考上述的描述。数据处理及分析方法利用spss23.0统计软件和originpro9.0作图软件进行数据分析和作图。组间显著性差异分析比较采用单因素方差分析法(avova)，*表示为p<0.05，具有统计学意义。结果分析与讨论小鼠体重的动态变化及生长活动情况造模结束后，幽门螺杆菌造模组(zt组)的胃黏膜立即放入尿素酶指示剂中，瞬间变色，说明已成功建立幽门螺杆菌感染小鼠模型。在为期56天探究植物乳杆菌zj316对幽门螺杆菌感染小鼠的治疗作用的实验中，各组体重变化情况如图13所示。适应性培养一周后，对小鼠的体重进行称重，此时小鼠体重均达到17.72±0.88g。经过56天的培养造模，体重最终均达到22.63±1.27g。其中，第4周体重略有下降，可能是连续灌胃对小鼠的生长有一定影响，也属于正常范围内的体重波动。在为期56天的实验过程中，各组小鼠在造模期间，小鼠的饮食饮水情况无显著差异，由此可见，h.pylori感染小鼠进行造模对其的体重、正常的饮食饮水、活动情况均无影响。研究发现，h.pylori感染是一个缓慢的发病过程并对动物机体的体重和饮食情况无太大影响。和本研究的实验结果一致。胃粘膜h&e病理染色观察及组织损伤评价组织病理染色观察与组织损伤评价是当下诊断胃炎严重程度的有效手段，被广泛用于临床检查。不同治疗处理组小鼠胃粘膜染色结果如图14所示。zh组没有灌胃任何菌株作为空白对照，染色结果可以看出组织粘膜层结构清晰，上皮完整，粘膜层腺体排列紧密，形态正常，未见明显炎症反应。zt组只灌胃幽门螺杆菌，染色结果可以看出组织粘胃膜层结构清晰，粘膜层腺体排列紧密，粘膜下层及浆膜层可见较多炎性细胞浸润，有淋巴细胞、粒细胞等(黑色箭头)，并可见浆膜层出血(红色箭头)。zc组为灌胃植物乳杆菌316对幽门螺杆菌感染的小鼠进行治疗，染色结果可以看出组织结构完整，粘膜层腺体排列紧密，形态正常，粘膜下层少量炎性细胞浸润，有肥大细胞、粒细胞、淋巴细胞等(黑色箭头)，未见其它明显异常。zg组为灌胃鼠李糖乳杆菌lgg对幽门螺杆菌感染的小鼠进行治疗，染色结果可以看出组织结构完整，粘膜层腺体排列紧密，形态正常，粘膜下层可见少量炎性细胞浸润，有肥大细胞、淋巴细胞等(红色箭头)。zi为用混合抗生素治疗幽门螺杆菌感染的小鼠，染色结果和上述空白对照组(zh组)相同。由以上结果可以看出，抗生素治疗效果最为明显，基本可以根除炎症，植物乳杆菌zj316和鼠李糖乳杆菌lgg均可以起到对幽门螺杆菌感染引起的炎症反应的治疗作用，减小炎症细胞的浸润。小鼠胃粘膜炎症因子的变化情况不同治疗组小鼠胃粘膜炎症因子的变化情况如图15所示。和zh相比，造模结束后，zt组被幽门螺杆菌感染后无任何防治措施的情况下ifn-γ、il-6均出现的明显的升高，il-10出现明显的下降，表明灌胃幽门螺杆菌能激起机体的炎症反应，导致致炎因子增加，抑炎因子的减少。通过分别灌胃植物乳杆菌zj316和鼠李糖乳杆菌lgg对幽门螺杆菌感染的小鼠进行治疗的zc组和zg组，与zt组相比较，ifn-γ、il-6均出现的明显的下降，il-10无显著性变化，表明灌胃植物乳杆菌zj316和鼠李糖乳杆菌lgg对幽门螺杆菌感染引起的炎症反应有一定的治疗作用，抑制促炎因子的产生。但乳酸菌治疗相比较抗生素治疗还是具有一定的差距，如图15所示zi组明显比zc组和zg组致炎因子(ifn-γ、il-6)少，说明抗生素用于治疗幽门螺杆菌感染引起的小鼠炎症反应能力强于乳酸菌。以上和小鼠胃粘膜h&e病理染色观察结果类似，进一步证明了植物乳酸菌zj316灌胃对小鼠幽门螺杆菌感染引起的炎症反应具有明显的治疗作用。16srrna基因高通量测序检测小鼠胃微生态变化情况分析16srrna基因高通量测序结果illuminamiseq测序平台对5组小鼠40个胃样品中微生物群落进行16srdna(v3、v4高变区)进行测序，获得到的数据在进行拼接得到最终的数据如表8所示。可以看出，40个胃样品测序数据获得的有效tags序列总数为2091105条，其中zc组样品有52219±70条，zg组样品有52276±93条，zh组样品有52078±74条，zi组样品有52408±165条，zt组样品52405±212条。测序结果获得的tags拼接率均达到97％以上，说明测序结果比较理想。图16可以看出曲线末端上升趋势趋于平缓，则表明采样量足够，即测序深度满足实验要求。由图17可知，随着样本out丰度的增加，曲线在水平方向上跨度变大，垂直方向上趋于平滑，说明物种丰富且分布越均匀。表8高通量测序序列基本信息tab.8informationofilluminasequencing植物乳杆菌zj316通过治疗作用对小鼠胃粘膜菌群结构组成的影响(1)植物乳杆菌zj316在“门”水平上对小鼠胃粘膜菌群结构组成的影响根据otu的物种注释的结果，在细菌“门”水平基础上对5个组别的小鼠胃粘膜样品中的菌群分别进行分析，绘制柱状图如图18所示。各分组小鼠胃粘膜中的优势菌群分别为厚壁菌门(firmicutes)、拟杆菌门(bacteroidetes)、和变形菌门(proteobacteria)，其中厚壁菌门和拟杆菌门是占比最高的菌群，平均占到了每个样品总out的60％左右。变形菌门(proteobacteria)是细菌中最大的一门，包括大肠杆菌、沙门氏菌、幽门螺旋杆菌等病原菌，是主要胃肠道疾病的始作俑者。由图18可以看出，zt组因为受到了幽门螺杆菌的感染并没有采取任何防治措施，其中变形菌门(proteobacteria)比例较其他组明显占比最大。植物乳杆菌zj316治疗处理组(zc组)与zt相比较变形菌门(proteobacteria)比例明显下降，厚壁菌门(firmicutes)和拟杆菌门(bacteroidetes)的比例也有所上升。说明在“门”水平上对小鼠胃粘膜菌群结构变化可以看出植物乳杆菌zj316通过治疗作用可以起到一定的抑制致病菌繁殖的效果。(2)植物乳杆菌zj316在“属”水平上对小鼠胃粘膜菌群结构组成的影响在“属”水平对5个组别的小鼠胃粘膜样品中相对丰度前18的菌群绘制柱状图如图19所示并进行分析5组样品在属水平上的菌群主要包含lactobacillus、helicobacter、staphylococcus和veillonella等多个属，其中lactobacillus含量最高，从侧面也可以反映出lactobacillus是胃肠道中的主要菌群，负责维持宿主胃肠道微生态平衡。由图19得知，zt组因为受到了幽门螺杆菌的感染并没有采取任何防治措施，故其中helicobacter所占比例较其他组最大。植物乳杆菌zj316治疗处理组(zc组)和抗生素治疗组(zi组)与zt相比较helicobacter比例明显下降，虽然抗生素治疗组(zi组)的下降更为明显，但植物乳杆菌zj316治疗处理组(zc组)也具有明显的抑制helicobacter的效果。说明在“属”水平上对小鼠胃粘膜菌群结构变化可以看出植物乳杆菌zj316通过治疗作用可以起到一定的抑制幽门螺杆菌生长繁殖的效果。治疗组小鼠胃粘膜中菌群的β多样性分析从beta多样性热图20a和附图20b可以看出，空白对照组(zh组)和幽门螺杆菌造模组(zt组)热度指数差距较大，热度颜色具有明显的差异性，说明这两组小鼠胃粘膜微生物菌群在整体上存在很大差异。同时植物乳杆菌316治疗处理组(zc组)和幽门螺杆菌造模组(zt组)也是存在一定热度指数差距，所以，这也从侧面说明对小鼠灌胃植物乳杆菌zj316进行治疗处理一定程度上可以改善幽门螺杆菌对胃微生物菌群的改变。各治疗处理组小鼠胃粘膜中物种显著性差异分析为比较分析幽门螺杆菌感染造模组和植物乳杆菌治疗处理组相关菌群的显著差异，用lefse分别对zi、zt、zg、zc、zh组五组的菌群相对丰度进行比较分析，以找出显著性变化的菌群。如图4.10所示，其中幽门螺杆菌造模组(zt)的胃微生物菌群中发生了显著性增加的菌群为“门”水平上的proteobacteria，deferribacteres、tenericutes、“纲”水平上的epsilonproteobacteria、“目”水平上的campylobacterales、deferribacterales、anaeroplasmatales、mollicutes、sphingobacteriales、“科”水平上的helicobacteraceae、ruminococcaceae、prevotellaceae、anaeroplasmataceae、clostridiaceae、deferribacteraceae、dehalobacteriaceae、sphingobacteriaceae、odoribacteraceae、“属”水平上的helicobacter、oscillospira、prevotella、ruminococcus、mucispirillum、odoribacter、anaeroplasma、dehalobacterium、brevundimonas、butyrivibrio、sphingobacterium、alistipes。其中增加最显著的“门”为proteobacteria，proteobacteria是细菌中最大的一门，包括大肠杆菌、沙门氏菌、幽门螺旋杆菌等病原菌，是主要胃肠道疾病的始作俑者。增加最显著的“属”为helicobacter能引起慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃癌等多种消化道疾病，属于致病菌的一种。prevotella会干扰免疫系统,导致自体免疫系统攻击关节,诱发类风湿性关节炎，也属于致病菌。ruminococcus主要发酵代谢产物为乙酸和甲酸，以瘤胃球菌属为主的肠型中细菌主要靠吸收单糖和降解粘蛋白来获取能量。植物乳杆菌zj316治疗处理组(zc)胃微生物菌群中发生了显著性增加的菌群为“门”水平上的firmicutes以及“纲”水平上的bacilli、“目”水平上的lactobacillales、“属”水平上的clostridium、roseburia。其中增加最明显为的“目”水平上的lactobacillales，灌胃植物乳杆菌zj316降低了胃微生态菌群中的致病菌的数量，增加乳酸菌的数量。同时firmicutes中菌群的含量也有大幅增加，firmicutes中大多为维持胃肠道健康的有益菌。例如芽孢杆菌纲(bacilli)中的乳酸菌目(lactobacillales)有促进胃肠道消化、维持胃肠道的健康等益生功能。roseburia可以减轻体内炎症和动脉粥样硬化。由以上可知，植物乳杆菌zj316通过治疗作用，提高了小鼠胃粘膜中lactobacillus、roseburia等益生菌的丰度而降低了prevotella、helicobacter等致病菌的丰度。鼠李糖乳杆菌lgg治疗处理组(zg)胃微生物菌群中发生了显著性增加的菌群为“属”水平上的veillonella、staphylococcus以上两种菌也具有一定的致病性。但未检测到helicobacter明显增加，说明鼠李糖乳杆菌lgg也是具有一定的治疗效果的。由图20a和图20b可知，在zt组中，幽门螺杆菌属(helicobacter)的平均相对丰度为0.236，而在zc组丰度降到了0.080，zg组丰度降到了0.017，zi组丰度降到了0.003，小鼠在受到幽门螺杆菌感染后用乳酸菌进行治疗，并用抗生素作为对照，通过上述胃微生态菌群显著差异和幽门螺杆菌属风度的改变可以看出，抗生素的治疗效果最好，但乳酸菌也具有一定的治疗作用，能起到保护胃微生态环境、减少胃中致病菌含量、降低胃中幽门螺杆菌的定植率的作用。其中植物乳杆菌zj316相对于鼠李糖乳杆菌lgg治疗效果更佳。肝脏组织中谷胱甘肽的含量分析小鼠肝脏组织中谷胱甘肽的含量如表4.3所示，幽门螺杆菌感染造模组(zt组)肝脏中的gsh含量较低，含量为0.87±0.36μmol/gprot。植物乳杆菌zj316治疗处理组(zc组)和鼠李糖乳杆菌lgg治疗处理组(zg组)相比于zt组含量有所升高，分别为1.79±0.15μmol/gprot、1.90±0.12μmol/gprot。经过混合抗生素治疗处理组(zi组)gsh含量明显增高为2.66±0.03μmol/gprot。可见抗生素的治疗能力最强，但同时说明乳酸菌也具有抗氧化清除自由基能力，提高gsh含量。表9小鼠肝脏组织中谷胱甘肽的含量tab.9thelevelsofgshinliverofmice本领域的技术人员应理解，上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。当前第1页12当前第1页12