耐碳青霉烯克雷伯菌显色培养基的制作方法

本发明属于疾病微生物培养与鉴定领域。

背景技术：

克雷伯菌，属肠杆菌科，为革兰氏染色阴性的粗短杆菌。单个或呈短链，不运动，有明显荚膜。克雷伯菌对外界抵抗力强，对多数抗生素易产生耐药性。

在过去10年中，耐碳青霉烯类药物被认为是治疗耐药革兰阴性菌的最后一道防线。随着碳青霉烯类耐药菌株，尤其是肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌检出率的快速上升，已成为当今临床抗感染治疗的难题。据chinet最新细菌耐药性监测结果，8274株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌中前三位的分离率依次是肺炎克雷伯菌(68.6％)、大肠埃希菌(10.8％)和阴沟肠杆菌(6.9％)。其中肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南的耐药率分别从2005年的3.0％和2.9％上升到了2018年的25.0％和26.3％，上升幅度超过8倍。

因此，继续做好细菌耐药监测工作，早期识别耐碳青霉烯克雷伯菌属细菌，尤其是耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌，加强医院感染防控措施，减少耐药菌株的院内传播具有重要意义。

目前，临床检验科微生物实验室多采用自动化仪器法对克雷伯菌属细菌进行鉴定和药敏试验，一般报告时间＞72h。选择性显色培养法是快速筛选目标细菌的理想方法，一般耗时仅需18h～24h。而目前市面上现存的显色培养法并无专门针对耐碳青霉烯克雷伯菌属细菌进行筛选的，最接近的显色培养基是尿道菌群定位显色培养基(法国chromagar)。可疑菌落呈金属蓝色或灰蓝色，包括克雷伯菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属及沙雷氏菌属细菌，不能通过菌落颜色有效筛选耐碳青霉烯克雷伯菌属细菌。

因此，为应对快速增长的耐碳青霉烯克雷伯菌，尤其是耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌，急需一种快速筛选的显色培养基。

技术实现要素：

本发明要解决的问题是：提供一种耐碳青霉烯克雷伯菌显色培养基。

本发明的技术方案如下：

一种耐碳青霉烯克雷伯菌显色培养基，包括氯化钠4～6重量份、硫酸镁0.1～0.3重量份、磷酸二氢铵0.5～1.5重量份、磷酸氢二钾0.5～1.5重量份、柠檬酸钠4～6重量份、琼脂13～17重量份、溴麝香草酚蓝0.06～1重量份、肌醇9～11重量份、美罗培南0.001～0.003重量份、水900～1100重量份。

如前述的培养基，包括氯化钠5重量份、硫酸镁0.2重量份、磷酸二氢铵1重量份、磷酸氢二钾1重量份、柠檬酸钠5重量份、琼脂15重量份、溴麝香草酚蓝0.08重量份、肌醇10重量份、美罗培南0.002重量份、水1000重量份。

前述培养基在非疾病诊断目的的耐碳青霉烯克雷伯菌检测中的用途。

一种耐碳青霉烯克雷伯菌的检测试剂盒，所述试剂盒包括如下配比的培养基：

氯化钠4～6重量份、硫酸镁0.1～0.3重量份、磷酸二氢铵0.5～1.5重量份、磷酸氢二钾0.5～1.5重量份、柠檬酸钠4～6重量份、琼脂13～17重量份、溴麝香草酚蓝0.06～1重量份、肌醇9～11重量份、美罗培南0.001～0.003重量份、水900～1100重量份。

如前述的检测试剂盒，所述试剂盒包括如下配比的培养基：

氯化钠5重量份、硫酸镁0.2重量份、磷酸二氢铵1重量份、磷酸氢二钾1重量份、柠檬酸钠5重量份、琼脂15重量份、溴麝香草酚蓝0.08重量份、肌醇10重量份、美罗培南0.002重量份、水1000重量份。

一种耐碳青霉烯克雷伯菌的检测方法，它是将非人体或动物体来源的样本置于前述培养基中培养18～24h，观察到蛋黄色、圆形、凸起、湿润的菌落即可判断为耐碳青霉烯克雷伯菌。

一种耐碳青霉烯克雷伯菌显色培养基的制备方法，包括如下步骤：

1)将氯化钠4～6重量份、硫酸镁0.1～0.3重量份、磷酸二氢铵0.5～1.5重量份、磷酸氢二钾0.5～1.5重量份、柠檬酸钠4～6重量份、琼脂13～17重量份、溴麝香草酚蓝0.06～1重量份溶于700～900重量份的水中，121℃高压灭菌，冷却至50℃～55℃，保温待用；

2)将肌醇9～11重量份肌醇溶解于100～300重量份的水中，滤膜过滤除菌，加入步骤1)所得混合物；

3)将0.001～0.003重量份美罗培南加入到步骤(2)得到的混合物中；

4)将步骤3)所得混合物与培养皿中冷却凝固。

如前述的制备方法，所述步骤1)为：将氯化钠5重量份、硫酸镁0.2重量份、磷酸二氢铵1重量份、磷酸氢二钾1重量份、柠檬酸钠5重量份、琼脂15重量份、溴麝香草酚蓝0.08重量份、肌醇10重量份、美罗培南0.002重量份溶于900重量份的水中，121℃高压灭菌，冷却至50℃～55℃，保温待用。

如前述的制备方法，步骤2)为：

将肌醇10重量份肌醇溶解于100重量份的水中，滤膜过滤除菌，加入步骤1)所得混合物。

如前述的制备方法，步骤3)为：

将0.002重量份美罗培南加入到步骤(2)得到的混合物中。

本发明的培养基可快速、准确地对耐碳青霉烯克雷伯菌进行检测，在医院中数千样本的检测中假阳性率接近0，有利于耐碳青霉烯克雷伯菌的早期识别。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：耐碳青霉烯克雷伯菌在本发明培养基上的外观。

具体实施方式

实施例1耐碳青霉烯克雷伯菌显色培养基的制备和检测应用

一、耐碳青霉烯克雷伯菌显色培养基制备流程

1.称取西蒙式枸橼酸盐琼脂粉27.28g(含氯化钠5g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢铵1g、磷酸氢二钾1g、柠檬酸钠5g、琼脂15g、溴麝香草酚蓝0.08g，ph为6.8±0.1)，搅拌溶解于900ml纯水中，121℃高压(指压强高于标准大气压)灭菌15min后放置50℃～55℃环境保温待用。

2.称取10g肌醇，加热溶解于100ml纯水中，用0.22um滤膜过滤除菌后加入上述1样品中，轻轻摇匀。

3.称取10mg美罗培南，加入1ml灭菌纯水中充分混匀后，吸取200ul加入上述2样品中至美罗培南药物终浓度为2ug/ml，轻轻摇匀。

4.取一次性无菌培养皿，将上述3样品注入皿内，自然流满平皿底部至培养基厚度为3mm～4mm，待琼脂凝固后放入2℃～8℃冰箱保存。

二、检测流程

1.将样本接种至耐碳青霉烯克雷伯菌显色培养基上，36±1℃过夜培养18h--24h，观察菌落形态。

2.判断：在培养基内生长的蛋黄色、圆形、凸起、湿润的菌落即可判断为耐碳青霉烯克雷伯菌，见图1。

以下用实验例进一步说明本发明的有益效果。

实验例1特异性验证

发明人使用实施例1的培养基对在11家三级甲等医院icu病房采集的5844例环境样本进行筛查培养；对icu患者的气管插管、胃管插管、肠道内及口腔内样本1442例进行筛查培养；以及207名健康医务人员肠道内样本/口腔内样本进行筛查培养。通过采用二代测序的方法对阳性筛查结果进行菌种的精准鉴定，并采用肉汤稀释法对阳性菌株的药敏结果进行验证。

结果：5844例环境样本筛查阳性结果121株，其中120株(99.17％)为耐碳青霉烯克雷伯菌，1株(0.83％)为耐碳青霉烯粘质沙雷氏菌，假阳性很低。120株耐碳青霉烯克雷伯菌中有116株(96.67％)为肺炎克雷伯菌，2株(1.67％)为klebsiellapasteurii，2株(1.67％)为klebsiellamichiganensis。1442例icu患者样本中筛查阳性结果为113例，且经验证全部为耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌，假阳性为0。207名健康医务人员肠道内/口腔内样本未筛查出阳性结果。

本发明的显色培养基能快速、准确地检测耐碳青霉烯的克雷伯菌，可以方便微生物实验室、医院感染管理部、以及各类研究机构快速筛查耐碳青霉烯克雷伯菌，在第一时间报告临床科室并指导其用药，以及进行相应的医院感染防控措施，避免耐药菌株院内传播风险。