本发明涉及微生物培养
技术领域：
，具体涉及一种利用白酒糟生产屎肠球菌的技术方法。
背景技术：
：屎肠球菌是我国农业部允许使用的16种可直接饲喂的饲料微生物品种之一。屎肠球菌作为乳酸菌家族成员之一，在提高幼年畜禽体增重率、提高动物免疫力、调节肠道微生态平衡，提高营养吸收、减少腹泻率、降低死亡率等方面均有很好的效果，加之其对部分抗生素也具备很好的耐受性。因此，在目前的微生态制剂产业特别是饲料添加剂企业中，是深受众多厂家亲睐的一类乳酸菌产品。市场上常见的屎肠球菌是以液态发酵所得，产品活菌数虽高但由于此类产品售价较高、易失活、保存条件苛刻，从而极大制约其产品在市场推广应用。我国的白酒酿造行业每年产生的丢糟产量在3500万吨以上，这些鲜白酒糟酸度大，水分含量60％以上，并且含有10％左右的粗脂肪、17％左右的粗蛋白、25％左右的粗纤维、b族维生素以及磷、钾等无机元素。此外，白酒糟中还存在由微生物菌体产生的氨基酸、核糖核酸及嘌呤等微量有效成分，这些都是谷物所不能比拟的。若未及时加以处理，酒糟容易腐败变质，这不仅造成资源大量浪费，还会严重污染周围环境。技术实现要素：基于上述技术问题，本发明提供一种利用白酒糟生产屎肠球菌的技术方法。以经过预处理的白酒糟作为屎肠球菌的固态培养基，提供一种屎肠球菌固态发酵培养工艺，从而克服现有技术中多以液态发酵制备屎肠球菌所存在的技术问题。为实现上述技术目的，本发明提供一种利用白酒糟生产屎肠球菌的技术方法，包括以下步骤：(1)取屎肠球菌冻干菌粉置于改良mrs培养基中，划线培养，挑取3-5个典型屎肠球菌单菌落连续纯化传代复壮3次，选取最优屎肠球菌单菌落，作为一级种子液菌种；(2)无菌操作挑取筛选的屎肠球菌单菌落接种于一级种子培养液中，摇床培养得一级种子液；然后进一步接种到二级种子培养液中培养获得二级种子液；(3)将制备好的二级种子液接种到含有经预处理的白酒糟的固态发酵培养基中，发酵培养；(4)发酵结束后，将发酵产物烘干粉碎得屎肠球菌固态发酵产品。优选的，以质量份数计，步骤(1)中，mrs培养基包含以下成分：葡萄糖1-2份，蛋白胨0.5-1.5份，牛肉膏0.5-1.5份，酵母浸粉0.2-1份，氯化钠0.2-0.8份，琼脂粉1-3份，碳酸钙0.1-3份，柠檬酸二铵0.1-1份，吐温0.08-0.1份，硫酸镁0.02-0.1份，硫酸锰0.01-0.05份，纯化水85-96份；培养条件为35-37℃。优选的，以质量份数计，步骤(2)中的一级培养基包含以下组分：蔗糖1-2份，葡萄糖1-2份，蛋白胨0.5-1.5份，碳酸钙1-5份，酵母浸粉0.2-1份，氯化钠0.2-0.8份，牛肉膏0.5-1.5份，硫酸镁0-0.8份，硫酸锰0.1-0.8份，磷酸氢二钾0.8-3.5份，纯化水86-95份；二级培养基包含以下组分：蔗糖2-3份，葡萄糖0-1.5份，蛋白胨0.5-1.5份，碳酸钙1-5份，酵母浸粉0.2-1份，氯化钠0.2-0.8份，牛肉膏0.5-1.5份，硫酸镁0-0.8份，硫酸锰0.1-0.8份，磷酸氢二钾0.8-3.5份，纯化水86-95份；一级种子液接种至二级培养基的接种量为5-10％；培养条件为30-40℃，制备一级种子液的培养时间为8-12h，制备二级种子液的培养时间为12-24h。优选的，以质量份数计，步骤(3)中含有经预处理的白酒糟的固态发酵培养基中含有以下成分：经过预处理的白酒糟30-60份，酵母浸粉0.1-2份，硫酸镁0-1份，硫酸锰0-1份，水30-40份，ph值6-7.5，高温灭菌；接种量5-10％。优选的，所述预处理的白酒糟的制备方法包括以下步骤：①将鲜白酒糟分筛出稻壳后置于水中，调节ph值为6-8，浸泡处理后干燥、粉碎过筛得白酒糟粉；②所得白酒糟粉和玉米淀粉加水调和均匀后进行膨化处理，粉碎过筛得膨化白酒糟/玉米淀粉混合物。优选的，步骤①中，浸泡时间12-48h，浸泡温度为60-80℃，粉碎过40目筛。优选的，步骤②中，白酒糟和玉米粉的混合比例为(6-8)∶2，加水量为白酒糟粉和玉米淀粉混合物总量的30-50％。优选的，步骤②中，膨化温度为100-150℃，膨化处理后粉碎过60目筛。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)选取经过纯化和复壮后的优势屎肠球菌具有更强的适应能力以及繁殖能力，可以保证其在含白酒糟的固态培养基仍然具有高的繁殖活力；(2)将白酒糟置于碱性溶液中在一定温度下浸泡有助于提高白酒糟中纤维素和半纤维素的降解率，同时，在后续与玉米粉混合膨化时，能够促进二者发生膨化反应，为屎肠球菌提供更加丰富的营养物质成分，使酒糟在作为屎肠球菌培养基时，更容易被吸收，为后续作为固态培养基提供基础；(3)白酒糟中富含粗蛋白质，能够为菌体提供充足氮源，但是由于其中的碳源已经基本被利用完全，因此碳源不足，玉米粉含糖较高，为菌体提供充足的碳源，二者协同作用促进屎肠球菌在发酵池保持较高的生长活性。同时将经过预处理的白酒糟和玉米粉共同混合均匀后进行膨化处理，膨化过程中，一方面，玉米粉中的淀粉凝胶化，淀粉分子间氢键断裂形成糊化淀粉，部分淀粉降解成还原糖，显著提高玉米淀粉的消化利用率，另一方面，膨化使液态水汽化蒸发，谷物组织遭到强大的爆破伸张作用，使谷物变为无数细致多孔的海绵体，谷物体积增大几倍到几十倍挤压，膨化使玉米粉体积增大，比表面积增加，从而增大了屎肠球菌的接种面积；(4)由于经过预处理的白酒糟是和玉米粉以混合物形式存在的，预处理的白酒糟中富含氨基化合物，玉米粉含糖较高，在膨化过程中，可以促使氨基化合物中游离氨基酸与羰基化合物的游离羧基缩合形成亚胺衍生物，发生美拉德反应，美拉德反应产物能够对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等表现出很强的抑制效果，由此可以避免在固态培养过程中杂质菌对屎肠球菌的抑制作用。同时还赋予了屎肠球菌发酵产物特殊的风味物质，使其作为添加剂用于禽畜饲料时不影响饲料口感，提高饲料适口性；(5)经过预处理的白酒糟是和玉米粉以混合物的形式进行膨化反应能够使二者更加充分的混匀和结合反应，当屎肠球菌附着在膨化混合物当中时更能保证各方面营养物质的供应，从而使固态培养基不需要添加其他原料的前提下就可以满足屎肠球菌各方面的营养物质需求；(6)发酵结束后，将发酵产物烘干粉碎得屎肠球菌固态发酵成品，所得固态发酵产品中，每克干物质的菌种数量达到180亿以上，并且此时的微生物仍然是附着在具有孔隙结构的固态培养基上的，因此，在储存过程中仍然能够为屎肠球菌提供必要的营养物质供应，并且能够保证屎肠球菌在储存过程中的存活率，从而延长菌种制品的保存期限，低温存放12个月后活菌率仍然在80％以上。具体实施方式现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。实施例1(1)无菌操作，取少量屎肠球菌冻干粉(购买于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm：2017191)置于葡萄糖2份，蛋白胨1.5份，牛肉膏0.5份，酵母浸粉0.2份，氯化钠0.2份，琼脂粉1份，碳酸钙3份，柠檬酸二铵0.5份，吐温0.08份，硫酸镁0.1份，硫酸锰0.05份，纯化水96份的培养基中划线，37℃培养24h，挑取5个典型的屎肠球菌单菌落分别划线mrs培养基中，连续纯化传代复壮3次，挑取复壮后屎肠球菌进行生理生化鉴定，结果显示其为屎肠球菌，选取最优屎肠球菌单菌落，作为种子菌株，作为一级种子液菌种；(2)无菌操作挑取筛选的屎肠球菌单菌落接种于蔗糖2份，葡萄糖2份，蛋白胨1.5份，碳酸钙5份，酵母浸粉1份，氯化钠0.8份，牛肉膏1.5份，硫酸镁0.8份，硫酸锰0.8份，磷酸氢二钾3.5份，纯化水95份培养基中，在35℃温度下转速为180r/min的摇床培养12h得一级种子液；(3)以10％的接种率将制备的一级种子液接种到葡萄糖2份，蛋白胨1.5份，碳酸钙5份，酵母浸粉1份，氯化钠0.8份，牛肉膏1.5份，硫酸镁0.8份，硫酸锰0.8份，磷酸氢二钾3.5份，纯化水95份的培养基中在35℃温度，无菌环境下转速为240r/min的摇床培养24h得二级种子液。(4)固态培养基制备：将鲜白酒糟分筛出稻壳后置于水中，调节ph值为8，80℃浸泡处理24h后干燥、粉碎过40目筛得白酒糟粉；所得白酒糟粉和玉米淀粉以8∶2比例混合后加水40％调和均匀，进行120℃膨化处理，粉碎过60目筛得膨化白酒糟/玉米淀粉混合物；取膨化白酒糟/玉米淀粉混合物60份，酵母浸粉2份，硫酸镁1份，硫酸锰1份，水40份，调节ph值为7，高温灭菌得固态培养基。(5)以10％的接种量将二级种子液接种至配制的固态培养基中，35℃无菌环境下发酵培养72h；发酵结束后将发酵产物30℃烘干，粉碎至50目得屎肠球菌固态发酵产品。实施例2同实施例1，区别在于，步骤(4)中将鲜白酒糟分筛出稻壳后置于水中，调节ph值为8，80℃浸泡处理24h后-40℃冷冻干燥、粉碎过40目筛得白酒糟粉和玉米淀粉以8∶2比例混合后，不经膨化直接作为固体培养基原料使用。实施例3同实施例1，区别在于，步骤(4)将鲜白酒糟分筛出稻壳后不经碱性水溶液浸泡，直接干燥、粉碎过40目筛得白酒糟粉后和玉米淀粉混合膨化处理。实施例4同实施例1，区别在于，不经过步骤(1)的菌种纯化和复壮过程，直接扩大培养得二级种子液。实施例5同实施例1，区别在于，省略步骤(4)，步骤(5)所用固态培养基为豆粕10份、米糠2份，麸皮10份，碳酸钙1份，酵母浸粉0.1份，纯化水78份。对实施例1-5制备的屎肠球菌固态发酵产品、-4℃低温保存6个月、-20℃低温保存12个月的产品分别进行有效活菌数测定，检测结果见表1；表10个月-4℃低温保存6个月-20℃低温保存12个月实施例1182亿/g165亿/g155亿/g实施例2150亿/g100亿/g85亿/g实施例3135亿/g102亿/g94亿/g实施例4126亿/g105亿/g112亿/g实施例5105亿/g45亿/g37亿/g由表1可以得出，经过纯化复壮处理的屎肠球菌更能适应本发明所制备的含有白酒糟的固体培养基，且，经过膨化处理后的混合物更能够为屎肠球菌的生长提供必要的营养物质保证，使活菌数和储存后活性显著提高。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12