本发明涉及一种用于保护生物制品的组合物，尤其涉及一种用于肺炎疫苗生产的培养基，以及培养方法。
背景技术：
肺炎链球菌是一种革兰阳性菌，可引起肺炎、脑膜炎和菌血症等多种疾病。据世界卫生组织(worldhealthorganization，who)统计，全球每年死于肺炎链球菌感染的5岁以下儿童占其死亡总数的11％。目前，已知肺炎链球菌共有93种血清型，不同地区血清型分布存在差异，但其中10余种血清型的感染率占肺炎链球菌性疾病的2/3以上。肺炎球菌疫苗已经成为防治肺炎球菌最好的方法，在世界范围内广泛用于5岁以下儿童和65岁以上老人预防接种。目前，肺炎链球菌疫苗研发生产过程中，提高肺炎链球菌发酵中荚膜产量仍是各个肺炎链球菌疫苗研发机构和生产厂家突破的难点。
lyta是n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸酰胺酶，几乎存在于所有血清型的肺炎链球菌中。当lyta酶被激活后，通过裂解n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸，导致细胞壁肽聚糖骨架断裂，使细胞壁坍塌，最终导致细胞溶解死亡。当细菌细胞壁停止合成或营养缺乏或胆碱诱导，膜磷壁酸(lta)与lyta酶之间的平衡关系遭到破坏，lyta被激活，水解聚糖链和细胞壁含胆碱的肽链间的酰胺键，将细胞壁(cw)水解为糖链和肽链，从而破坏细菌细胞壁，导致细胞自溶。为此，开发一种发酵方法，能维持发酵过程营养充分，保持细胞壁能持续合成，用乙醇胺代替胆碱，使lyta始终处于未被激活状态，从而达到高密度的目的，对肺炎链球菌疫苗生产具有重大意义。
技术实现要素：
本发明的一个目的在于提供一种肺炎链球菌高密度发酵培养基，利于提高荚膜多糖的产量。
本发明的另一个目的在于提供一种肺炎链球菌高密度发酵方法，延长肺炎链球菌的对数生长期，提高菌体密度，促进荚膜多糖的产量。
一种肺炎链球菌发酵培养基，含有已醇胺，以实现高密度发酵。
另一种肺炎链球菌发酵培养基，包括thb肉汤培养基，以及已醇胺。
thb肉汤培养基为一种通用培养基，可商业购买获得，其组成成分包括：牛心浸粉10g/l、动物组织胃蛋白酶水解物20g/l、葡萄糖2g/l、氯化钠2g/l、磷酸氢二钠0.4g/l和碳酸氢钠2g/l，ph7.8±0.2。
另一种肺炎链球菌发酵培养基，还加入酵母，用量为50g/l～150g/l。
另一种肺炎链球菌发酵培养基，还加入葡萄糖，用量为100g/l～600g/l。
另一种肺炎链球菌发酵培养基，还加入氯化钙，用量为2g/l～10g/l。
另一种肺炎链球菌发酵培养基，还加入谷氨酰胺，用量为10g/l～50g/l。
另一种肺炎链球菌发酵培养基，还加入天冬酰胺，用量为10g/l～50g/l。
另一种肺炎链球菌高密度发酵培养基，已醇胺用量为0.05ml/l～0.5ml/l。
另一种肺炎链球菌发酵培养基，已醇胺用量为0.1ml/l～0.3ml/l，如：但不限于0.1ml/l、0.2ml/l和0.3ml/l。
另一种肺炎链球菌高密度发酵培养基，thb肉汤培养基，以及已醇胺、50g/l～150g/l酵母、100g/l～600g/l葡萄糖、2g/l～10g/l氯化钙、10g/l～50g/l谷氨酰胺和10g/l～50g/l天冬酰胺。
另一种肺炎链球菌高密度发酵培养基，thb肉汤培养基，以及0.05ml/l～0.5ml/l已醇胺、50g/l～150g/l酵母、100g/l～600g/l葡萄糖、2g/l～10g/l氯化钙、10g/l～50g/l谷氨酰胺和10g/l～50g/l天冬酰胺。
另一种肺炎链球菌高密度发酵培养基，thb肉汤培养基，以及0.1ml/l～0.3ml/l已醇胺、50g/l～150g/l酵母、100g/l～600g/l葡萄糖、2g/l～10g/l氯化钙、10g/l～50g/l谷氨酰胺和10g/l～50g/l天冬酰胺。
本发明提供的各种肺炎链球菌发酵培养基，均为补料培养基，在肺炎链球菌发酵期间，随着营养物质的消耗，而在补料环节，后添加入发酵容器中，以实现高密度发酵。
一种肺炎链球菌发酵方法，肺炎链球菌菌种接种到thb肉汤培养基上发酵2小时～6小时后，开始加入补料培养基，补料速度根据发酵培养基中葡萄糖浓度变化而变化，控制发酵液中葡萄糖浓度变化范围在1g/l～16g/l间，连续补料8小时～12小时后结束发酵。
采用本发明的培养基对肺炎链球菌发酵体系进行连续补料，能使肺炎链球菌发酵的对数生长期可延长至10h以上，菌浓(od600)达到12以上，荚膜多糖产量达到600mg/l以上，远高于文献报道的产量(一般为100g/l～200g/l)，对肺炎链球菌疫苗生产具有重大意义。
具体实施方式
以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本实施例采用的肺炎链球菌1型(cmcc31404)原始来源为中国医学细菌菌种保藏管理中心，直接来源为中国食品药品检定研究院。
本实施例采用的肺炎链球菌4型(cmcc31448)原始来源为中国医学细菌菌种保藏管理中心，直接来源为中国食品药品检定研究院。
实施例1
分别考察3种培养方式对肺炎链球菌1型发酵产量的影响，3种培养方式分别为①thb培养；②thb+乙醇胺；③thb+补料培养基(含乙醇胺)+补料策略，具体如下：
(1)thb培养基配制
在电子台秤上称量2548gthb培养基粉剂，然后用70l注射水溶解。其中取出100ml放入250ml锥形瓶中作为1级种子培养基，另取3.5l培养基放入5l补料瓶中作为二级种子培养基，剩下的培养基用蠕动泵泵入100l发酵罐中，所有培养基在116℃灭菌30min。
(2)补料培养基配制(5l)
在电子台秤上称量酵母粉500g，葡萄糖2500g，氯化钙25g，用3l注射用水溶解后116℃灭菌30min。另外，称量谷氨酰胺150g，天冬酰胺150g，乙醇胺1ml，用2l注射用水溶解后，用0.22um过滤器过滤。
(3)thb培养基+乙醇胺的配制
在电子台秤上称量2548gthb培养基粉剂，然后用70l注射水溶解。其中取出100ml放入250ml锥形瓶中作为1级种子培养基，另取3.5l培养基放入5l补料瓶中作为二级种子培养基，剩下的培养基中加入乙醇胺1ml，用蠕动泵泵入100l发酵罐中，所有培养基在116℃灭菌30min。
(4)发酵
挑取哥伦比亚血平板上长出的单菌落，接种到一级种子培养基中，放入而二氧化碳培养箱中培养8小时，然后转接入二级种子培养基中培养6小时：
①thb培养将二级种子接入仅含thb培养基培养，每隔1小时取样，直到菌浓下降；
②thb+乙醇胺将二级种子接入thb培养基+乙醇胺的培养基中培养，每隔1小时取样，直到菌浓下降；
③thb+补料培养基(含乙醇胺)+补料策略将二级种子接入thb培养基中，培养3小时后，将补料起始速度设置为10ml/min，然后每小时测葡萄糖1次，通过控制补料速度控制葡萄糖浓度变化范围在1-16g/l间，每小时取样测菌浓，直到菌浓下降。实验结果如下表1所示。
表1
从表3可知：在thb培养基的培养方式中发酵6小时菌浓最高达到3.6，而后开始下降；在thb培养基+乙醇胺的培养方式中发酵8小时菌浓达到4.8，而后开始下降；在thb培养基+补料培养基(含乙醇胺)+补料策略的培养方式中发酵10小时菌浓达到14.5，而后开始下降。从三种培养方式的结果表明，采用本发明的发酵方式可得到高密度的肺炎链球菌发酵液。
实施例2
(1)thb培养基配制
在电子台秤上称量2548gthb培养基粉剂，然后用70l注射水溶解。其中取出100ml放入250ml锥形瓶中作为1级种子培养基，另取3.5l培养基放入5l补料瓶中作为二级种子培养基，剩下的培养基用蠕动泵泵入100l发酵罐中，所有培养基在116℃灭菌30min。
(2)补料培养基配制(5l)
在电子台秤上称量酵母粉500g，葡萄糖2500g，氯化钙25g，用3l注射用水溶解后116℃灭菌30min。另外，称量谷氨酰胺150g，天冬酰胺150g，乙醇胺1ml，用2l注射用水溶解后，用0.22μm过滤器过滤。
(3)发酵
挑取哥伦比亚血平板上长出的单菌落，接种到一级种子培养基中，放入而二氧化碳培养箱中培养8小时，然后转接入二级种子培养基中培养6小时，接着转入发酵培养基中培养，培养3小时后，将补料起始速度设置为10ml/min，然后每小时测葡萄糖1次，通过控制补料速度控制葡萄糖浓度变化范围在1g/l～16g/l间。结果详见如下表2。
表2
本实施例中，肺炎链球菌1型发酵10小时后，菌体仍处于持续增长状态，发酵液菌体浓度(od600)达到14.5，荚膜含量达到650mg/l。
当不采用补料控制策略，则肺炎链球菌1型发酵6小时后菌体就会裂解，最大菌浓(od600)仅有3.6，荚膜多糖浓度仅为200mg/l。
当采用该补料控制策略，但补料培养基中不添加已醇胺，则肺炎链球菌1型发酵8小时后菌体就会裂解，最大菌浓(od600)为6.0，荚膜多糖浓度为300mg/l。
可见，在补料发酵中，加入乙醇胺对延长肺炎链球菌1型对数生产期时间，提高荚膜多糖的含量具有重要作用。
实施例3
(1)thb培养基配制
在电子台秤上称量2548gthb培养基粉剂，然后用70l注射水溶解。其中取出100ml放入250ml锥形瓶中作为1级种子培养基，另取3.5l培养基放入5l补料瓶中作为二级种子培养基，剩下的培养基用蠕动泵泵入100l发酵罐中，所有培养基在116℃灭菌30min。
(2)补料培养基配制(5l)
在电子台秤上称量酵母粉250g，葡萄糖2500g，氯化钙25g，用3l注射用水溶解后116℃灭菌30min。另外，称量谷氨酰胺150g，天冬酰胺150g，乙醇胺1ml，用2l注射用水溶解后，用0.22um过滤器过滤。
(3)发酵
挑取哥伦比亚血平板上长出的单菌落，接种到一级种子培养基中，放入而二氧化碳培养箱中培养8小时，然后转接入二级种子培养基中培养6小时，接着转入发酵培养基中培养，培养3小时后，将补料起始速度设置为10ml/min，然后每小时测葡萄糖1次，通过控制补料速度控制葡萄糖浓度变化范围在1-16g/l间，结果详见如下表3。
表3
本实施例中，肺炎链球菌4型发酵10小时后，菌体仍处于持续增长状态，发酵液菌体浓度(od600)达到16，荚膜含量达到704.2mg/l。
当不采用补料控制策略，肺炎链球菌4型发酵6小时后菌体就会裂解，最大菌浓(od600)仅有2.8，荚膜多糖浓度仅有150mg/l。
当采用该补料控制策略，但补料培养基中不添加已醇胺，肺炎链球菌4型发酵7小时后菌体就会裂解，最大菌浓(od600)为5.7，荚膜多糖浓度为250mg/l。
可见，在补料发酵中，加入乙醇胺对延长肺炎链球菌4型对数生产期时间，提高荚膜多糖的含量具有重要作用。