维生素E衍生物及其制备方法和在Fe3+特异性检测中的应用与流程

本发明涉及化学合成和荧光检测领域，具体涉及一种维生素e衍生物及其制备方法和在fe³⁺特异性检测中的应用。

背景技术：

维生素e作为人类生活中的重要营养素，具有抗氧化，消除体内自由基，预防癌症和提高人体免疫力等重要功能，在药物载体、营养品、脂质体等方面具有广阔的应用前景，因此广泛应用于药品、添加剂和临床研究中。具有聚集诱导发光效应的分子具有高检测灵敏度和高品质发光成像，在生化传感材料、离子检测、智能识别材料等领域得到广泛的发展和应用。但目前为止，没有关于维生素e衍生物应用于聚集诱导发光材料的报道。为了丰富维生素e衍生物，开发其更广泛的应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种维生素e衍生物及其制备方法，并将其用于fe³⁺特异性检测，并且通过细胞实验证明其具有体内特异性检测fe³⁺的潜力。

为达到以上发明目的，本发明第一方面的具体技术方案是：一种维生素e衍生物(vesa)，具有如下结构通式：

本发明第二方面的具体技术方案是：上述维生素e衍生物的制备方法，包括：

(1)将维生素e琥珀酸酯与新戊酰氯ii(c5h9clo)反应得到混合酸酐的步骤；

(2)不经分离，混合酸酐中直接加入含荧光基团的伯胺，继续反应30～60min后升温至25℃，反应8～12h得到所述维生素e衍生物的步骤；

较佳的，步骤(1)中，以三乙胺(tea)为缚酸剂，二氯甲烷(ch2cl2)为溶剂，维生素e琥珀酸酯、新戊酰氯、三乙胺物质的量比为1：1～2：1～3。

较佳的，步骤(1)中，反应温度为-5℃～5℃，反应时间为0.5h～1h。

较佳的，步骤(2)中，含荧光基团的伯胺r-nh2包括1-氨基芘、1-(4-氨基苯)-1,2,2-三苯乙烯。

较佳的，步骤(2)中，以三乙胺(tea)为缚酸剂，二氯甲烷(ch2cl2)为溶剂，维生素e琥珀酸酯、含荧光基团的伯胺、三乙胺物质的量比为1：1.2～1.5：1～3。

本发明还提供了上述维生素e衍生物的应用，可用于fe³⁺的选择性荧光检测中。

本发明还提供了上述维生素e衍生物的应用，可用于细胞内的fe³⁺的选择性荧光检测中。

细胞是指常用活细胞，包括但不限于b16-f10、cos7、293t、l292、hela等细胞。

本发明的优点在于：

(1)本发明制备了一种新型vesa，具有典型的聚集诱导发光效应。首次将维生素e衍生物应用于聚集诱导发光传感器，丰富维生素e衍生物的应用。

(2)本发明得到的vesa对fe³⁺具有高灵敏度、选择性和抗干扰能力，实现了一个探针检测，检出限为5.6×10^-9m。

(3)本发明得到的vesa具有优异的生物相容性，可以在细胞体内作为灵敏的荧光标记剂，可检测细胞环境中的fe³⁺，具有良好的体内外fe³⁺检测应用前景。

附图说明

图1a是本发明实施例1中vesa-1的1hnmr(500mhz,cdcl3)谱图；图1b是vesa-1的¹³cnmr(126mhz,cdcl3)谱图。

图2a是本发明实施例2中vesa-2的1hnmr(500mhz,cdcl3)谱图；图2b是vesa-2的¹³cnmr(126mhz,cdcl3)谱图。

图3是本发明应用例1中vesa-1相对荧光发射强度(i/i0)与混合物fw的关系图。

图4是本发明应用例2中vesa-2相对荧光发射强度(i/i0)与混合物fw的关系图。

图5是本发明应用例3中添加不同金属离子的vesa-1溶液荧光发射图谱。

图6是本发明应用例4中添加不同金属离子的vesa-2溶液荧光发射图谱。

图7是本发明应用例5中，在存在/不存在fe³⁺的vesa-1溶液中，分别添加不同金属离子的荧光响应。

图8a是本发明应用例6中含有不同浓度fe³⁺的vesa-1溶液荧光发射光谱；图8b是vesa-1的荧光强度与fe³⁺浓度的关系图。

图9是本发明应用例7中不同浓度的vesa-1培养b16-f10细胞后对细胞活性影响。

图10是本发明应用例8中vesa-1，vesa-1+fe³⁺对hela细胞的荧光成像。

具体实施方式

下面的具体实施方式实例是对本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效的进一步阐述。

本发明记载了一种新型维生素e衍生物，并首次应用到聚集诱导发光材料领域。其对fe³⁺具有高灵敏度和高选择性，在细胞水平中对fe³⁺具有优异检测能力，显示出体内外特异性检测fe³⁺的巨大应用潜力。本发明所述的维生素e衍生物的总合成路线如下：

本发明合成出可用于fe³⁺选择性荧光检测的维生素e衍生物，在下文中也可以用vesa代替，二者具有同等含义。

将维生素e衍生物应用于体内外特异性检测fe³⁺，具体包括如下步骤：

(1)聚集诱导发光实验：研究维生素e衍生物在含水量0～99％的thf-h2o混合溶液中的聚集诱导发光效应；

(2)fe³⁺荧光淬灭实验：添加fe³⁺和na⁺,k⁺,mg²⁺,ag⁺,ca²⁺,ba²⁺,cr³⁺,zn²⁺,cu²⁺,pb²⁺,tb³⁺等金属离子至维生素e衍生物溶液中，检测fe³⁺和其他金属离子对维生素e衍生物荧光淬灭效果，检测fe³⁺的选择性荧光响应，具体过程是：金属离子单独添加以及fe³⁺和其他金属离子共同添加时对维生素e衍生物荧光淬灭效果；

(3)细胞水平应用：将fe³⁺引入到新型维生素e衍生物预处理的活细胞中，检测细胞活性和荧光响应，具体过程是：采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法研究了维生素e衍生物对活细胞的影响作用。

实施例1

以维生素e琥珀酸酯与1-氨基芘反应为例制备所述的维生素e衍生物，包括如下步骤：

将10.6g维生素e琥珀酸酯，3.0ml三乙胺溶于200ml二氯甲烷中，0℃下进行反应，滴加3.1ml新戊酰氯，新戊酰氯的滴加速度为15滴/min，滴完继续反应40min得到混合溶液a；

配制5.4g1-氨基芘、3.0ml三乙胺溶于50ml二氯甲烷，得到混合溶液b，将其滴加到混合溶液a中，混合溶液b的滴加速度为50滴/min，滴完后反应40min，升温至25℃反应10h，反应完毕后去除溶剂，用200ml甲醇超声处理10min，将固液混合物过滤，用100ml甲醇洗涤，干燥后得到新型vesa产品。记为vesa-1，核磁共振谱图如图1所示。

实施例2

以维生素e琥珀酸酯与1-(4-氨基苯)-1,2,2-三苯乙烯反应为例制备所述的维生素e衍生物，包括如下步骤：

将10.6g维生素e琥珀酸酯，4.2ml三乙胺溶于200ml二氯甲烷中，0℃下进行反应，滴加3.1ml新戊酰氯，新戊酰氯的滴加速度为15滴/min，滴完继续反应40min得到混合溶液a；

配制8.7g1-(4-氨基苯)-1,2,2-三苯乙烯、4.2ml三乙胺溶于50ml二氯甲烷，得到混合溶液b，将其滴加到混合溶液a中，混合溶液b的滴加速度为50滴/min，滴完后反应40min，升温至25℃反应12h，反应完毕后去除溶剂，用200ml甲醇超声处理10min，将固液混合物过滤，用100ml甲醇洗涤，干燥后得到新型vesa产品。记为vesa-2，核磁共振谱图如图2所示。

应用例1

vesa-1的聚集诱导发光效应。

在vesa-1的良性溶剂thf和不良溶剂h2o的混合物中，测试了具有不同水含量(fw)的thf-h2o混合物中vesa-1的荧光强度，并将其与vesa-1在纯thf中荧光强度作比较，结果如图3所示。

图3是vesa-1在484nm处的相对荧光发射强度(i/i0)与混合物的fw的关系图，其中i为vesa-1在thf-h2o混合物中发射强度，i0为在thf中的发射强度。浓度：vesa-1(10^-5m)，λex：365nm。由图3可以看出，vesa-1在水含量为70％～95％时具有显著的聚集诱导发光效应，fw达到95％时，观察到最高荧光强度。

应用例2

vesa-2的聚集诱导发光效应。

在vesa-2的良性溶剂thf和不良溶剂h2o的混合物中，测试了具有不同水含量(fw)的thf-h2o混合物中vesa-2的荧光强度，并将其与vesa-2在纯thf中荧光强度作比较，结果如图4所示。

图4是vesa-2在484nm处的相对荧光发射强度(i/i0)与混合物的fw的关系图，其中i为vesa-2在thf-h2o混合物中发射强度，i0为在thf中的发射强度。浓度：vesa-2(10^-5m)，λex：365nm。由图4可以看出，vesa-2在水含量为80％以上时具有显著的聚集诱导发光效应，fw达到90％时，观察到最高荧光强度。

应用例3

vesa-1检测fe³⁺：vesa对fe³⁺的选择性。

在vesa-1的thf-h2o(1.0×10^-5m，fw＝90％)混合物中，在波长365nm激发下，添加不同金属离子，研究添加后的vesa-1荧光光谱，得到荧光发射光谱如图5所示，

其中，所有金属离子单独添加。λex:365nm。从图5中可以看出，只有在添加了fe³⁺的组中有明显的荧光淬灭效果，带有其他离子的组中几乎没有荧光衰减，说明vesa-1对fe³⁺的检测具有良好的选择性。

应用例4

vesa-2检测fe³⁺：vesa对fe³⁺的选择性。

在vesa-2的thf-h2o(1.0×10^-5m，fw＝90％)混合物中，在波长365nm激发下，添加不同金属离子，研究添加后的vesa-1荧光光谱，得到荧光发射光谱如图6所示，

其中，所有金属离子单独添加。λex:365nm。从图6中可以看出，添加了tb³⁺和fe³⁺的组中有一定的荧光淬灭效果，但效果并不明显，说明vesa-2对fe³⁺的检测有一定效果，但不如vesa-1。

应用例5

vesa-1检测fe³⁺：vesa检测fe³⁺的抗干扰能力。

在相同条件下，在vesa-1的thf-h2o(1.0×10^-5m，fw＝90％)混合物中，通过单独添加金属离子以及其他金属离子共同添加，研究vesa-1荧光响应，结果如图7所示。

图7是存在/不存在fe³⁺的vesa-1溶液中，分别添加不同金属离子的荧光响应。其中，黑条：添加一种金属离子的vesa-1：2,fe³⁺；3,na⁺；4,k⁺；5,mg²⁺；6,ag⁺；7,ca²⁺；8,ba²⁺；9,cr³⁺；10,zn²⁺；11,cu²⁺；12,pb²⁺；13,tb³⁺,红条：添加fe³⁺和其他金属离子的vesa-1。从图7可以看出，当na⁺,k⁺,mg²⁺,ag⁺,ca²⁺,ba²⁺,cr³⁺,zn²⁺,cu²⁺,pb²⁺,tb³⁺存在时，vesa-1对fe³⁺的识别几乎没有变化，vesa-1对fe³⁺的检测具有高选择性和高抗干扰能力。

应用例6

vesa-1检测fe³⁺：vesa-1荧光强度与fe³⁺的浓度关系。

在相同条件下，在vesa-1的thf-h2o(1.0×10^-5m，fw＝90％)混合物中，检测添加0～5×10^-5m的fe³⁺对vesa-1荧光强度的影响，结果如图8所示。

图8a是在不同浓度fe³⁺存在下，化合物vesa-1在thf-h2o中的荧光强度，λex：365nm；图8b是化合物vesa-1的荧光强度与fe³⁺浓度的关系图。从图8a、8b可以看出，在0～5×10^-5m浓度范围内，随着fe³⁺添加量的增多，vesa-1在484nm处的荧光显著降低，而发射位移几乎不变。当fe³⁺的添加量达到5×10^-5m时，vesa-1的发射强度变化趋于恒定。最终，观察到75％的猝灭荧光，并在此范围内具有良好的线性关系(r²＝0.989)。可见，vesa-1对fe³⁺具有优异的检测效果和灵敏度。此外，检出限为5.6×10^-9m。

应用例7

vesa-1对活细胞影响的检测

将b16-f10细胞放入96孔板中，在5％的co2中于37℃培养24小时。然后加入不同浓度(0,0.01,0.1,1,10,50μm)的vesa-1溶液，继续培养24h。之后将50mlmtt(1mg/ml)添加到每个孔中，然后再培养4小时，然后洗去培养基。将得到的混合物加入100mldmso中并摇动10分钟。最后，在550nm下测量每个孔的吸光度。通过以下公式获得细胞活力：

细胞活力(％)＝ods/odu

在存在vesa-1的情况下测得吸光度为ods，在没有vesa-1时测得为odu。

vesa-1对细胞活性影响如图9所示，1：对比组；2：0.01μm；3：0.1μm；4：1μm；5：10μm；6：50μm。图9显示了用不同浓度的vesa-1培养24小时的b16-f10细胞的细胞活力，随着vesa-1浓度从0.01μm增加到50μm，细胞活力略有下降。但是，当浓度达到50μm时，仍有95％细胞存活，证明vesa-1对生物的毒性低。

应用例8

vesa-1对b16-f10细胞内fe³⁺的灵敏度检测

将fe³⁺(15μm)引入到vesa-1(15μm)预处理的细胞中，通过标准程序处理细胞后，用共聚焦激光扫描显微镜捕获倒置显微镜图像，结果如图10所示。

图10为vesa-1(a,b,c)，vesa-1+fe³⁺(d,e,f)对hela细胞的荧光成像。在vesa-1培养后b16-f10细胞显示强荧光图像(a-c)，而在存在fe³⁺的情况下记录到微弱的发射(d-f)，这表明vesa-1对fe³⁺的检测具有很高的灵敏度，可以在细胞环境中检测到fe³⁺。

综上，本发明成功制备出一种新型维生素e衍生物，并前所未有地将其应用到聚集诱导发光材料领域中。其具备典型的聚集诱导发光效应，且对检测fe³⁺具有高灵敏度、高选择性和高抗干扰能力。此外，本发明制备的vesa可以在细胞环境中检测到fe³⁺，在化学、环境、生物系统中具有广阔的应用前景。

上述公开的实施方案仅用于举例说明本发明的构思及效果，并不以此限制本发明的保护范围。在说明书和权利要求书中提及的原料、方案、应用和表示数量、百分比或比例的调整均属于本发明。在本发明主题范围内或在等同于本发明的范围内的改变，都应包含在本发明中。