本发明涉及药物化学技术领域，具体公开了一种从海洋红树林角果木叶中制备达玛烷型三萜的方法。
背景技术：
角果木叶为红树科植物角果木的叶子，角果木的拉丁学名为ceriopstagal(perr.)c.b.rob.，别名：剪子树、海枷子、海淀子(广东、海南)，产广东的徐闻、海南的东北至南部海滩、台湾的高雄港等地。
发明人在前期的研究中从角果木叶中分离得到了两个达玛烷型三萜cereotagalolc和cereotagalold，该两个化合物显示出一定的抗肿瘤活性，具有一定的应用价值(详见xinwu,hongboliao,xiaohuizhu,hongyulu,xiaobinzeng,liaocui,xiaohualv,yanqunliandchaohuazhang.twonewdammaranetriterpenesfromtheleavesofceriopstagal,rec.nat.prod.10:5(2016)628-632.)。虽然上述文献公开了分离cereotagalolc和cereotagalold的方法，但上述文献中cereotagalolc和cereotagalold是经过大孔树脂柱层析、硅胶柱层析、ods柱层析以及制备型高效液相色谱仪等多种色谱分离技术结合才分离得到，制备步骤多、制备难度大；且cereotagalolc和cereotagalold经多种色谱柱分离后分布在不同的馏分中，需要分开进行制备，不能一次性在同一馏分中制备得到，进一步增加了制备步骤和制备难度。因此，开发一种制备步骤少，且相对容易的制备cereotagalolc和cereotagalold的方法具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种从海洋红树林角果木叶中制备达玛烷型三萜的方法。该方法能在同一馏分中同时制备达玛烷型三萜cereotagalolc和cereotagalold；简化了现有制备方法的制备步骤。
本发明所要解决的上述技术问题，通过如下技术方案予以实现：
一种从海洋红树林角果木叶中制备达玛烷型三萜的方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)将角果木叶用乙醇提取，得乙醇提取物；
(2)将乙醇提取物上硅胶柱，用氯仿：甲醇组成的洗脱溶剂进行洗脱得馏分1；
(3)将馏分1再次上硅胶柱，用石油醚：乙酸乙酯组成的洗脱溶剂进行洗脱得馏分2；
(4)将馏分2用制备型hplc进行分离，得达玛烷型三萜。
本发明所述的海洋红树林角果木叶是指生长在海洋红树林中的角果木的叶子。
本发明先后通过用氯仿：甲醇组成的洗脱溶剂系统以及石油醚：乙酸乙酯组成的洗脱溶剂系统进行两次硅胶柱层析，经该两次硅胶柱层析使得馏分2中富集了大量的cereotagalolc和cereotagalold；进一步再通过制备型hplc进行分离可以实现在同一馏分中同时制备达玛烷型三萜cereotagalolc和cereotagalold。该方法仅仅只需三次分离纯化步骤即可实现同时制备达玛烷型三萜cereotagalolc和cereotagalold；该方法简化了三萜cereotagalolc和cereotagalold的制备步骤，大幅提高了制备效率。
优选地，步骤(1)中的用乙醇提取是指用体积分数为70～95％的乙醇进行浸提，浸提时间为48～72h，将提取液浓缩干燥得乙醇提取物。
最优选地，步骤(1)中的用乙醇提取是指用体积分数为95％的乙醇进行浸提，浸提时间为60h，将提取液浓缩干燥得乙醇提取物。
优选地，步骤(2)中所述的用氯仿：甲醇组成的洗脱溶剂进行洗脱得馏分1的具体条件为：先用体积比为95：5的氯仿：甲醇进行洗脱除杂；然后再用85：15的氯仿：甲醇进行洗脱，收集85：15的氯仿：甲醇洗脱部位浓缩干燥得馏分1。
进一步优选地，步骤(2)中所述的用氯仿：甲醇组成的洗脱溶剂进行洗脱得馏分1的具体条件为：先用5～8倍柱体积的体积比为95：5的氯仿：甲醇进行洗脱除杂；然后再用6～10倍柱体积的体积比为85：15的氯仿：甲醇进行洗脱，收集85：15的氯仿：甲醇洗脱部位浓缩干燥得馏分1。
优选地，步骤(2)中硅胶柱中硅胶的重量用量为乙醇提取物的20～30倍；硅胶的目数为200～300目。
优选地，步骤(3)中用石油醚：乙酸乙酯组成的洗脱溶剂进行洗脱得馏分2的具体条件为：先用体积比为96：4的石油醚：乙酸乙酯进行洗脱除杂，再用体积比为92：8的石油醚：乙酸乙酯进行洗脱；收集92：8的石油醚：乙酸乙酯洗脱部位浓缩干燥得馏分2。
进一步优选地，步骤(3)中用石油醚：乙酸乙酯组成的洗脱溶剂进行洗脱得馏分2的具体条件为：先用6～10倍柱体积的体积比为96：4的石油醚：乙酸乙酯进行洗脱除杂，再用8～12倍柱体积的体积比为92：8的石油醚：乙酸乙酯进行洗脱；收集92：8的石油醚：乙酸乙酯洗脱部位浓缩干燥得馏分2。
优选地，步骤(3)中硅胶柱中硅胶的重量用量为乙醇提取物的40～60倍；硅胶的目数为300～400目。
上述两次硅胶柱层析的洗脱溶剂的组成以及洗脱溶剂比例的选择对于能否将cereotagalolc和cereotagalold富集在馏分2中起着至关重要的作用。两次硅胶柱层析中洗脱溶剂的组成不当或洗脱溶剂比例的选择不当，都会导致馏分2中无法同时富集到cereotagalolc和cereotagalold；甚至都无法富集到二者中的任一一种。本发明经大量的实验研究，得出了在上述两次硅胶柱层析条件下可以得到富含cereotagalolc和cereotagalold的馏分2。为后续的制备型hplc能够同时制备达玛烷型三萜cereotagalolc和cereotagalold提供了决定性的条件。
优选地，用制备型hplc进行分离的具体条件为：采用制备型c18色谱柱，紫外检测器，检测波长为230～254nm；以乙腈为流动相a，水为流动相b进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱为：0～5min，流动相a的体积变化为0～12％；5～15min，流动相a的体积变化为12～26％；15～35min，流动相a的体积为26％保持不变；分别收集24.1min和30.8min的色谱峰对应的洗脱部位，浓缩干燥即得达玛烷型三萜cereotagalolc和cereotagalold。
虽然两次硅胶柱层析后富集得到了含有cereotagalolc和cereotagalold馏分2。但如何从馏分2中将cereotagalolc和cereotagalold分离出来，同样是一个技术难题。而采用制备型hplc进行分离，其流动相的选择以及流动相的洗脱条件对于是否能够分离得到cereotagalolc和cereotagalold起着决定性作用。流动相的洗脱条件的选择不当同样无法从馏分2中分离得到cereotagalolc和cereotagalold。本发明经大量的实验研究，得出了在上述制备型hplc进行分离的具体条件可以成功分离cereotagalolc和cereotagalold。
有益效果：本发明提供了一种全新的从海洋红树林角果木叶中制备达玛烷型三萜的方法。
该方法仅仅只需三次分离纯化步骤即可实现同时制备达玛烷型三萜cereotagalolc和cereotagalold；通过两次本发明所述的硅胶柱层析条件进行硅胶柱层析，可以将cereotagalolc和cereotagalold富集在同一部位，进一步通过一次hplc分离即可以同时制备得到达玛烷型三萜cereotagalolc和cereotagalold。相对于现有技术，该方法简化了三萜cereotagalolc和cereotagalold的制备步骤，大幅提高了制备效率。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但本发明所述的保护范围并不局限于实施例的范围。
从海洋红树林角果木叶中制备达玛烷型三萜的方法：
(1)将风干的海洋红树林角果木叶用5倍量的体积分数为95％的乙醇进行浸提，浸提时间为60h，将提取液静置48h后浓缩干燥得乙醇提取物；
(2)将乙醇提取物上硅胶柱(硅胶柱中硅胶的重量用量为乙醇提取物的25倍；硅胶的目数为200～300目)，先用6倍柱体积的体积比为95：5的氯仿：甲醇进行洗脱除杂；然后再用8倍柱体积的体积比为85：15的氯仿：甲醇进行洗脱，收集85：15的氯仿：甲醇洗脱部位浓缩干燥得馏分1；
(3)将馏分1再次上硅胶柱(硅胶柱中硅胶的重量用量为馏分1的50倍；硅胶的目数为300～400目)，先用8倍柱体积的体积比为96：4的石油醚：乙酸乙酯进行洗脱除杂，再用10倍柱体积的体积比为92：8的石油醚：乙酸乙酯进行洗脱；收集92：8的石油醚：乙酸乙酯洗脱部位浓缩干燥得馏分2；
(4)将馏分2用制备型hplc进行分离，得达玛烷型三萜；用制备型hplc进行分离的具体条件为：采用制备型c18色谱柱，紫外检测器，检测波长为245nm；以乙腈为流动相a，水为流动相b进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱为：0～5min，流动相a的体积变化为0～12％(流动相b的体积变化为100～88％)；5～15min，流动相a的体积变化为12～26％(流动相b的体积变化为88～74％)；15～35min，流动相a的体积为26％保持不变(流动相b的体积为74％保持不变)；分别收集24.1min和30.8min的色谱峰对应的洗脱部位，浓缩干燥即得达玛烷型三萜cereotagalolc和cereotagalold。
将24.1min色谱峰对应的洗脱部位浓缩干燥后得到的化合物用质谱和核磁进行结构表征，结果表明该化合物分子式经高分辨质谱确定为：m/z483.3856。1hnmr谱显示：δh1.69(1h,m),0.98(1h,m),1.61(1h,m),3.63(1h,t,8.5),1.34(1h,m),1.49(1h,m),1.32(1h,m),1.51(1h,m),1.25(1h,m),0.88(1h,m),1.52(1h,m),1.25(1h,m),1.52(1h,m),1.44(1h,m),1.62(1h,m),1.44(1h,m),1.05(1h,m),1.84(1h,m),1.24(1h,m),1.73(1h,m),0.96(3h,s),0.88(3h,s),1.14(3h,s),1.47(2h,t,8.5),2.05(2h,m),5.11(1h,m),1.62(3h,d,1.0),1.68(3h,d,1.0),3.71(1h,d,10.4),3.42(1h,d,10.4),0.87(3h,s),0.88(3h,s)。13cnmr谱显示：δc38.7,26.9,76.6,41.9,50.6,18.3,34.9,40.3,50.4,36.9,21.5,24.7,42.2,50.3,31.1,27.5,49.8,15.5,16.4,75.3,25.4,40.4,22.5,124.7,131.6,25.7,17.7,71.9,11.3,16.5。
将30.8min色谱峰对应的洗脱部位浓缩干燥后得到的化合物用质谱和核磁进行结构表征，结果表明该化合物分子式经高分辨质谱确定为：m/z481.3692，1hnmr谱显示：1.76(1h,m),1.06(1h,m),1.62(1h,m),3.76(1h,dd,11.7,4.6),1.29(1h,m),1.49(1h,m),1.32(1h,m),1.57(1h,m),1.23(1h,m),1.43(1h,m),1.53(1h,m),1.27(1h,m),1.52(1h,m),1.44(1h,m),1.63(1h,m),1.44(1h,m),1.06(1h,m),1.84(1h,m),1.23(1h,m),1.74(1h,m),0.96(3h,s),0.89(3h,s),1.14(3h,s),1.47(2h,t,8.5),2.05(2h,m),5.12(1h,m),1.62(3h,t,1.0),1.69(3h,t,1.0),9.38(1h,s),1.05(3h,s),0.89(3h,s)。13cnmr谱显示：δc38.6,26.4,71.8,55.5,48.9,21.0,34.6,40.8,50.6,36.1,21.6,24.8,42.2,50.3,31.1,27.4,49.8,15.5,16.4,75.4,25.5,40.4,22.5,124.6,131.7,25.7,17.7,207.0,8.6,16.4。
上述质谱和核磁结构表征数据显示，24.1min色谱峰对应的洗脱部位浓缩干燥后得到的化合物为cereotagalolc；30.8min色谱峰对应的洗脱部位浓缩干燥后得到的化合物为cereotagalold。本发明通过上述方法成功实现同时制备达玛烷型三萜cereotagalolc和cereotagalold；且制备步骤简单，大幅提高了cereotagalolc和cereotagalold的制备效率。