一种超灵敏检测前列腺特异性抗原PSA的方法与流程

一种超灵敏检测前列腺特异性抗原psa的方法
技术领域
[0001]
本发明属于生物传感器的开发方法，涉及一种超灵敏检测前列腺特异性抗原psa 的方法。


背景技术：

[0002]
前列腺特异性抗原(psa)是一种特异性的前列腺癌标志物，目前已成为临床诊 断前列腺癌的重要生物标志物
[1]
，因此，对psa的快速定量的检测具有重要临床价值 [2]
。目前，psa的检测方法有多种，包括荧光标记法
[3]
、电化学免疫传感器法
[4]
、表面 等离子体共振法
[5]
、电化学发光法等
[6]
。为了提高灵敏度，还结合滚环放大等放大方法 设计检测方案
[7]
。聚合酶链反应(pcr)作为核酸扩增和检测的金标准，具有成本低、 灵敏度高、选择性好的优点，但是还没有被用于psa的检测。
[0003]
考虑到蛋白质在疾病中的重要作用，pcr被应用到对蛋白质的高灵敏度检测，从 而发展了免疫pcr(immuno-pcr,ipcr)
[8]
。适配体是一种单链dna或rna，具 有较好的亲和力，可以与多种不同的目标分子特异性结合。与抗体相比，适配体具有 合成简单、成本低、免疫原性低等优点
[9]
。因此，基于适配体的免疫pcr检测被开发 为ipcr,
[10,11]
的替代方法。ipcr中，一个适配体作为亲和配体，通过pcr直接扩增 产生信号，而不需要费力地在抗体和dna序列之间偶联。该方法已应用于凝血酶、 血小板源生长因子等蛋白的检测
[12-16]
。为了避免分离或洗涤步骤，通过将适配体与目 标物的结合过程转化为新的扩增dna序列进行检测，发展了均相pcr检测方法
[11,17]
。 这种基于适配体的pcr检测方法已被广泛应用于检测各种疾病相关蛋白
[17-22]
，如抗 原、pdgf-bb和凝血酶等。然而，目前将有同时检测蛋白质和均相pcr结合的研究 较少。
[0004]
金纳米颗粒(aunps)作为一种替代信号报告物在生物传感器中得到了广泛的研 究，其具有高的光稳定性，易于与dna等生物分子合成和功能化，具有较强的光吸 收和散射特性
[23]
。这些理想的性质导致了基于aunps的比色法的发展，这种比色法适 用于包括金属离子、小分子和生物分子在内的一系列分析物
[24]
，这种方法可以方便地 进行视觉检测，但灵敏度较低
[25]
。最近，动态光散射(dynamic light sacttering,dls) 作为一种检测技术被引入到基于aunps的分析中，直接用于监测分析物引起的aunps 的尺寸变化。dls是一种常用的光学技术，用于表征悬浮液中颗粒(或大分子)的尺 寸分布
[26]
。aunps可以达到很高的光散射能力，使他检测限低至10-16
m，而且他们的 光散射强度与颗粒大小成正比
[27-32]
。同时，aunps的光散射信号远高于大多数生物样 品的干扰物质，直径为80nm的aunps的光散射信号甚至比有机染料强105倍。
[0005]
参考文献：
[0006]
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技术实现要素：

[0040]
要解决的技术问题
[0041]
为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种超灵敏检测前列腺特异性抗原 psa的方法，降低现有技术易出现假阳性的风险，提高现有技术的灵敏度。
[0042]
技术方案
[0043]
一种超灵敏检测前列腺特异性抗原psa的方法，其特征在于步骤如下：
[0044]
步骤1、制备脱氧核糖核酸dna修饰aunps：将巯基修饰的dna的oligo 6和 oligo 7分别溶解于60.0μl的ph为5.0的醋酸盐缓冲溶液，再加入12.0μl的20.0mm 的三(2-羧乙基)膦(tcep)，以还原修饰在dna上的巯基为二硫键，然后将上述溶 液全部转移至10.0ml aunps溶液中，室温孵育16.0h；然后在接下来的44.0h内， 向金纳米粒子溶液中加入5.0m的氯化钠nacl溶液，并使最终溶液中nacl的浓度为 100.0mm；修饰完成，除去未修饰到金纳米粒子表面的dna；最后将制备的修饰了 dna的金纳米粒子稀释到所需浓度；
[0045]
步骤2、分子内杂交反应：2.0μl 0.4nm的dna的oligo 1和oligo 2在90.0℃ 加热变性10.0分钟并迅速冷却到室温，然后向20.0mm tris-cl，ph值7.9、50.0mm 醋酸钾kac、10.0mm醋酸镁mg(ac)2和1.0mm二硫苏糖醇dtt的缓冲溶液加入 2.0μl不同浓度的前列腺特异性抗原：从1.0pg ml-1
到1.0μg ml-1
，以及室温的dna 的oligo 1和oligo 2混合液，在37.0℃温度下加热30.0分钟；然后再加入0.5u聚合 酶和1.0μl 2.5mm脱氧核糖核苷三磷酸dntps使溶液总量是10.0μl，并继续在37℃ 反应30.0分钟，然后90.0℃加热5分钟，使克列诺片段聚合酶klenow fragment失去 活性，反应后的溶液作为psa的聚合酶链反应pcr的扩
含有靶蛋白适配体的单链dna(ssdna)亲和探针可以作为我们系统中pcr的双链 dna(dsdna)模板，从而实现对蛋白质的灵敏度和普遍性检测。依据适配体也能够 结合互补的dna序列形成一个双链结构，我们设计了一种基于适配体与aunps检测 的方法，该方法通过将dna/dna双链结构转换为dna/目标复合物的结果来实现。 图1所示的原理图显示了基于aunps的的检测原理，通过双链dna与复合物的结构 变化到双链dna的结构来实现。oligo 1和oligo 2为dna/dna双链结构，psa识 别并结合oligo 1形成dna/target complex，与psa混合后释放oligo 2，反应终止。 当psa不存在时，oligo 1和oligo 2在exo-聚合酶的作用下以彼此为模板延伸，得到 两条更长的dna链，这两条长dna链在pcr循环中，通过正向引物和反向引物(oligo 3和oligo 4)识别新模板进行pcr扩增，并在每个周期的延伸过程中对oligo 5进行 切割。其中，oligo 5包含两个部分，一部分与新扩增模板dna互补，另一部分与aunps 上修饰的dna(oligo 6和oligo 7)互补，因此在pcr扩增前aunps处于聚集状态， 随着pcr循环周期的延长，aunps的聚集程度会逐渐减弱。因此，实现了将psa浓 度转化为aunps的直径变化，并利用dls对直径变化进行测定实现定量检测psa。
[0066]
基于pcr的psa检测需要将psa的信息转化为核酸的检测。采用动态光散射 (dls)和透射电镜(tem)研究了该方法的可行性。如图2所示，加入0.1μg ml-1
psa 前后，水合直径变化显著。在没有psa的情况下，pcr产物的水合直径为419.7nm， 加入0.1mg ml-1
psa后，其水合直径减小到46.3nm。结果表明，psa的存在可以引 起aunps聚集分散的变化。tem图像进一步证实这一结果，加入0.1μg ml-1
psa前， aunps处于聚集状态，加入0.1μg ml-1
psa后，aunps处于分散状态。这些结果表 明，该方法可以通过测量aunps的尺寸变化来检测psa。同时这些结果也表明，dls 比吸收光谱更敏感，是一种更灵敏的检测pcr产物的技术。
[0067]
对分析物的线性响应是分析的关键，因此该方法对不同浓度的psa存在时金纳米 粒溶液的直径进行了dls检测。随着psa浓度的增加，aunps的平均直径逐渐减小。 图2为aunps平均直径与ps浓度的线性关系，结果显示在10.0pg ml-1
到1.0μg ml-1
范围内，aunps平均直径随psa浓度的对数线性减小。线性回归方程d＝318.3
-ꢀ
46.66log
10
c(c:pg ml-1
)和检出限7.0pg ml-1
(3δ/斜率)。这些结果表明，该生物传感 器能够实现psa的高灵敏度检测。
[0068]
为了研究该检测方法在复杂生物体质中的检测能力，我们进行了加入回收实验。 如表1-2所示，在每个含有5％人血清的缓冲液中加入不同浓度的psa，其回收率为 94.6％-97.7％，相对标准偏差(rsd)为2.8％-5.3％。这些结果表明，dls可以准确 地检测到这些样品中的psa，表明其在生物系统中检测psa蛋白的潜在应用价值。
[0069]
表1-2人血清的psa加入回收法
[0070]