一种花生青枯病抗性分级的鉴定方法及其应用与流程

本发明属于农业植保领域，涉及一种植物抗病性鉴定方法，具体的说是一种花生青枯病抗性分级的鉴定方法及其应用。

背景技术：

栽培花生（arachishypogaeal.）是世界重要的经济作物和工业原料，在油料作物研究中受到较多关注，但一直以来，花生的抗病性、抗逆性是制约制约花生产业可持续发展的关键问题。

花生青枯病（bacterialwilt）是世界公认迄今为止危害最大的花生细菌性病害，亦是限制我国及很多东南亚国家花生生产的重要因素。该病原菌常常引起花生大规模减产，甚至绝产，对花生生产造成严重的经济损失，严重威胁我国花生产业的可持续发展。改进栽培措施和施用化学杀菌剂不能从根本上解决问题，培育抗青枯病花生品种是病害防治最有效、节能、环保的方法。近年来，有研究也对花生青枯病进行抗性鉴定，但目前这些抗性等级鉴定过程繁琐，且无固定的标准，因此一种更科学、更简便的花生青枯病抗性分级的鉴定方法显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明提供了一种花生青枯病抗性分级的鉴定方法及其应用，该鉴定方法科学有效、操作简单，能够很好的解决现有技术中分级鉴定繁琐并且无固定标准的问题。

本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种花生青枯病抗性分级的鉴定方法，具体步骤如下：

（1）将花生种子采用常规方式播种在土壤中，采用日常管理，在播种后第55天选取花生植株第二对侧枝顶端上长有叶片的枝条，枝条取下后立即放入取样盒中低温保存；

（2）将青枯病菌在tzc平板上28℃培养48h，挑取单菌落到1mllb液体培养基中28℃220rpm振荡培养48h，然后再接入到100mllb液体培养基中28℃220rpm振荡培养48h，获得菌液；取培养好的菌液到血球计数板上，并在显微镜下观察后，将菌液浓度稀释至10⁹cfu/ml；稀释后的菌液于1500rpm离心10min，倒掉培养液，用与培养液等体积的无菌水重悬菌体以此对菌体进行清洗，重复上述操作三次，再将菌体溶于等体积的无菌水中，并保证接种时的菌液浓度为10⁹cfu/ml。

（3）将花生枝条随机放入装有100ml青枯病菌液的三角瓶中进行青枯病菌接种，保证枝条底部浸入青枯病菌液中，置于28℃，在每天保持12h光照的环境下培养，培养5天后，统计花生枝条表型变化，并对花生品种进行花生青枯病抗性分级。

进一步的，所述花生青枯病抗性分级的分级标准如下：

高抗（hr）：不发病，插枝前、后枝条无明显变化；

中抗（mr）：病情较轻，叶缘轻微卷曲或者叶柄略下垂；

中感（ms）：病情明显，枝条下部叶片枯萎、叶柄下垂，上部叶片略卷曲或下垂、叶柄下垂；

高感（hs）：病情严重，枝条全部叶片皆严重卷曲、干枯，甚至变黄腐烂，叶片、叶柄严重下垂。

进一步的，所述步骤（2）中青枯病菌的分类学名为ralstoniasolanacearum，提取自青枯病患病花生植株，具体步骤为：将青枯病患病花生植株的根部洗净，用小刀将根部横切开，浸入无菌水中6h，收集浸出液后涂于tzc平板在28℃下培养48h，然后使用青枯病菌株鉴定特异性引物759/760对其进行扩增并测序鉴定。

进一步的，所述青枯病菌株鉴定特异性引物759/760的序列为：

759：5'-gtcgccgtcaactcactttc-3'；

760：5'-gtcgccgtcagcaatgcggaatcg-3'。

进一步的，所述tzc平板的配方为：细菌蛋白胨10g，葡萄糖5g，酪蛋白氨基酸1g，酵母提取物1g，琼脂15g，tzc50mg，用无菌水补至1000ml，ph7.2。

进一步的，所述步骤（3）中接种时青枯病菌液的浓度为10⁹cfu/ml。

进一步的，所述步骤（3）中的光照强度为16,000lx。

本发明还提供了所述的花生青枯病抗性分级的鉴定方法在鉴定花生青枯病抗性等级中的应用。

进一步的，在鉴定花生青枯病抗性等级时，以抗性品种“日花1号”和感病品种“花育40号”为对照。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明中以从花生患青枯病的植株上分离、纯化得到的花生青枯病病原菌ralstoniasolanacearum为接入菌，在室内侵染花生枝条，并在接种后的第5天根据枝条的表型根据青枯病抗性分级标准鉴定枝条的抗性等级。本发明的鉴定方法能够同时对多个花生品种或者群体中的个体进行花生青枯病抗病等级鉴定，因此其具有高通量、结果准确、可重复、操作简便的优点；且鉴定结果能够全面反映花生品种对青枯病的抗性水平，结果更科学；另外，本发明根据青枯病抗病的表型情况确定了用于花生青枯病等级鉴定的分级标准，为青枯病抗性种质资源筛选以及高产、抗青枯病品种选育提供便捷、高效的技术支持。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明中患青枯病花生植株；

图2是本发明所用青枯病菌在tzc平板上划线培养情况；

图3是本发明对青枯病菌dna提取后使用青枯病菌种鉴定特异性引物759/760pcr结果；

图4是本发明对pcr产物测序结果；

图5是本发明对青枯病抗病品种“日花1号”和青枯病感病品种“花育40号”进行室内实验接种青枯病菌液后第三天的表型结果；

图6是本发明对9个高产花生品种青枯病抗性等级鉴定结果；

图7是本发明对青枯病抗病品种“日花1号”（♂）和青枯病感病品种“花育967”（♀）杂交f3代ril群体中的个体室内鉴定结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案，本发明包括但不限于以下实施方式。根据现有技术对本发明所进行的不脱离本发明实质内容的改变，仍属于本发明的保护范围。

实施例1：青枯病病原菌的分离

将青枯病患病花生植株（图1）的根部洗净，用小刀将根部横切开，浸入无菌水中6h，收集浸出液；将浸出液摇匀，并抽取200μl涂于tzc平板（1l平板培养基配方：细菌蛋白胨10g，葡萄糖5g，酪蛋白氨基酸1g，酵母提取物1g，琼脂15g，tzc50mg，其余用无菌水补齐，ph7.2），在28℃条件下划线培养48h，菌落形态如图2所示。从平板上挑取红色单菌落到200μllb液体培养基中，28℃条件下220rpm振荡培养48h；1500rpm离心10min收集菌体，提取菌体dna。用青枯病菌株的鉴定特异性引物759/760对菌体dna进行扩增，其中引物序列为759：5'-gtcgccgtcaactcactttc-3'；760：5'-gtcgccgtcagcaatgcggaatcg-3'，扩增结果如图3所示。将得到的pcr产物割胶纯化后进行测序，测序结果（图4）显示菌种特征序列与ralstoniasolanacearum相似度为100%。经测序，证明从患病花生植株中分离得到的确实是青枯病菌株，将菌液予以保存。

实施例2：高产花生品种的青枯病抗性分级

选取9个高产花生参试品种：花育665、花育669、花育960、花育967、花育968、花育969、花育6620、花育9620、花育9625进行青枯病抗性分级的鉴定试验。选取青枯病抗病花生品种“日花1号”和青枯病感病花生品种“花育40号”作为对照。将所有花生品种的植株种植在位于青岛莱西的实验基地中。

1、花生枝条的获取：

将所有花生品种的种子采用常规方式同时播种在土壤中，并采用日常管理，在播种后第55天对每个品种的个体进行随机取样，并从选取的花生植株的第二对侧枝顶端切取长有叶片的枝条，枝条取下后立即放入取样盒中低温保存。

2、青枯病菌的准备：

（1）将保存的青枯病菌液在tzc平板上28℃划线培养48h，挑取单菌落到1mllb液体培养基中28℃220rpm振荡培养48h，然后按照1:100的比例继续扩大培养，即接入到100mllb液体培养基中28℃220rpm振荡培养48h；取培养好的菌液到血球计数板上，在显微镜下观察，将菌液浓度稀释至10⁹cfu/ml。

（2）将稀释后的菌液于1500rpm离心10min，倒掉培养液，用等量无菌水重悬菌体对菌体进行清洗，重复上述操作三次，以用来洗净菌体外的培养液，再将菌体溶于等体积的无菌水中，保证接种时的菌液浓度为10⁹cfu/ml。

3、青枯病菌的接种和表型鉴定：

在三角瓶中装入100ml浓度为10⁹cfu/ml的青枯病菌液，并随机在每个三角瓶中放入一个枝条，枝条底部要浸入菌液中，以便于枝条蘸取到青枯病菌菌液；将所有三角瓶随机摆放入人工气候室中，于28℃每天保持12h光照（16,000lx）的条件下进行培养；培养3天后，开始每天观察不同品种的感病情况。根据花生青枯病抗性分级标准对花生品种进行分级，标准如下：

高抗（hr）：不发病，插枝前、后枝条无明显变化；

中抗（mr）：病情较轻，叶缘轻微卷曲或者叶柄略下垂；

中感（ms）：病情明显，枝条下部叶片枯萎、叶柄下垂，上部叶片略卷曲或下垂、叶柄下垂；

高感（hs）：病情严重，枝条全部叶片皆严重卷曲、干枯，甚至变黄腐烂，叶片、叶柄严重下垂。

对照品种的表型结果如图5所示，接种青枯病菌液第3天抗病品种“日花1号”无明显症状，感病品种“花育40号”出现症状；第5天抗病品种“日花1号”仍无明显症状，感病品种“花育40号”症状明显。

在第5天，统计其余9种花生品种的枝条抗病表型情况，如图6所示，本发明从9个花生品种中共筛选出高抗品种1个：花育969；中抗品种1个：花育9625；中感品种2个：花育968、花育960；高感品种5个：花育665、花育669、花育6620、花育9620、花育967。

在本发明中，鉴定工作是在室内可控环境下进行，无需考虑土壤均质以及环境变化对鉴定结果的影响；并且每个花生植株可以同时取2～3个枝条作为重复实验进行鉴定，也可以直接对抗病群体中每一个个体进行抗性鉴定，上述均不影响植株的其它农艺性状选择，另外，在鉴定抗性等级的同时还能够获得下一代种子。

实施例3

选用抗病品种“日花1号”作为父本（♂）和高感品种“花育967”作为母本（♀）杂交f3代，对重组自交系（ril）群体中的个体进行青枯病抗性等级鉴定。将杂交f3代种子全部种植于位于青岛莱西的实验基地中。

播种后55天取样，从每个植株的第二对侧枝顶端切取两个枝条，然后按照实施例2所述的方法进行青枯病病菌的活化和接种，在接种后第5天统计杂交f3代植株的抗病表型，此时，对照品种“日花1号”表现出无任何症状，感病品种“花育40号”和“花育967”症状明显。鉴定结果如图7所示，根据花生青枯病抗性分级标准，鉴定出ril群体中存在高抗、中抗、中感、高感品种各6个。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。