甘蓝型油菜BnaA08.PDS3基因在甘蓝型油菜花瓣颜色性状育种中的应用的制作方法

本发明涉及遗传育种和分子生物学技术领域，具体甘蓝型油菜bnaa08.pds3基因在甘蓝型油菜花瓣颜色性状育种中的应用。

背景技术：

油菜是我国乃至世界上重要的油料作物。据统计，我国油菜常年平均种植面积在1亿亩左右，总产值约1000万吨，面积和产量均居世界首位。每年菜籽油产量占我国植物油消费的19.7％左右(范成明等,2018)。生产上，我国的油菜栽培种主要分为三类：白菜型油菜，甘蓝型油菜和芥菜型油菜，其中甘蓝型油菜在我国种植面积最广。

花器官是植物进化过程中最具适应性的组织之一，其中花色是最典型的表型之一。花色性状广义上是指花的各组成部分中花瓣状结构器官的颜色，包括花瓣，花冠，花萼等，狭义上的花色即指花瓣颜色(张承志,1989)。对人类的现代生活而言，作为观赏植物最重要的指标就是各种各样绚烂多彩的花色，因此观赏植物的花卉需求量和品种样式也在逐年增加，花卉的贸易额也有显著性的增长。据统计20世纪中期到21世纪初，花卉贸易总额提高100倍(chandlerandsanchez,2012)。对植物本身而言，花色是诱惑昆虫的重要视觉信号，而且不同的昆虫对花色的偏好性不同，对于植物的生长繁育有重要的意义(clegganddurbin,2000；pgkevanandbaker,1983)。

油菜花色性状稳定性高，受环境影响小，肉眼易观察，作为一个形态学标记在育种过程中剔除杂种，挑选杂交亲本，提高种子纯度和鉴定异交率方面有重要的作用。有研究报道，油菜花色与其他品质性状如芥酸等紧密连锁，因此可以作为潜在的标记性状加速油菜籽品质性状的育种(刘雪平等,2004)。另外，各色各异油菜作为观光型油菜在我国景观农业中有巨大的潜力。在我国根据油菜花期地理位置上呈现西南-东北分布，时间从1月份到8月份由南向北依次展开，陕西，湖北，江西，青海各大油菜花海吸引游客，为我国旅游业和景观农业做出了巨大贡献。

图位克隆(map-basedcloning)作为正向遗传学研究中的重要方法在植物中广泛应用。相对于其他分子标记，snp标记具有多态性丰富，数量多，分布广，稳定性高的优点。随着各物种基因组序列的公布以及全基因组重测序的发展，snp标记成为了首选的分子标记应用于图谱构建，关联分析等方面。集团分离分析法(bulkedsegregantanalysis，bsa)是基于性状选择为基础，定位与性状相关功能基因的方法。利用传统的分子标记(aflp，rapd，ssr等)结合bsa的方法对目标性状的功能基因进行初步定位的研究越来越多。传统的育种方法耗时耗力，费用也较高，随着全基因组重测序技术的发展及成本的降低，传统的bsa结合全基因组重测序演变出的bsa-seq广泛应用于水稻，棉花，番茄等作物，成功定位或克隆涉及抗病，花色，叶色，花期和产量性状相关基因。

借助分子标记和相关基因在分子水平对甘蓝型油菜花瓣颜色性状进行研究，将有助于揭示类花瓣相关色素代谢的分子机理奠定基础。应用上，可作为花期筛选植株的一个形态学标记指导遗传育种，以及应用于现代景观农业育种。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供检测甘蓝型油菜bnaa08.pds3基因的试剂在甘蓝型油菜花瓣颜色性状育种中的应用，所述的bnaa08.pds3基因在中双9号中的序列为seqidno.1所示。

本发明的另一个目的在于提供检测甘蓝型油菜的a08染色体的第13734089位碱基(c/t)的试剂在甘蓝型油菜花瓣颜色性状育种中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

与甘蓝型油菜黄白花性状相关基因和snp标记的获得：

(1)利用纯合黄白花突变体ywf与中双9号(zs9)进行正反交，分别获得含有544株和278株的f2代群体。另外扩大zs9×ywf的f2群体获得3360株单株。采取直播定苗的方法，行间距33cm，植株间距15cm。在初花期进行田间表型鉴定。

(2)对多个世代的群体进行遗传分析，确定花色性状的遗传模式。

(3)对f2代群体中极端表型各20个单株进行全基因组重测序。根据利用混池重测序的方法(bsa-seq)获得控制黄白花性状基因的初定位区域。

(4)根据双亲重测序数据，在初定位候选区域内开发多态性分子标记，利用kasp方法对候选基因进行精细定位。

(5)以特异性引物对候选基因进行扩增，获得bnaa08.pds3基因序列以及变异snp位点。(6)根据bnaa08.pds3基因序列和snp变异位点信息，开发ywf-15的snp分子标记，检测该分子标记的kasp引物为：

primer-allelefam：ttttgaatgaaacagacagagacctg；

primer-allelehex：tttttgaatgaaacagacagagaccta；

primer-common：ggaggaggagtgctggtccttt。

检测甘蓝型油菜bnaa08.pds3基因的试剂在甘蓝型油菜花瓣颜色性状育种中的应用，包括利用本领域的常规方式，对bnaa08.pds3基因的碱基序列进行检测，从而可判定甘蓝型油菜的花瓣颜色。

检测甘蓝型油菜的a08染色体的第13734089位碱基的试剂在甘蓝型油菜花瓣颜色性状育种中的应用，包括利用本领域的常规方式，针对这个碱基设计检测引物，从而判定甘蓝型油菜的花瓣颜色进行育种；

以上所述的应用中，优选的，所述的检测引物为：

primer-allelefam：ttttgaatgaaacagacagagacctg；

primer-allelehex：tttttgaatgaaacagacagagaccta；

primer-common：ggaggaggagtgctggtccttt。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供了甘蓝型油菜花瓣颜色性状相关基因bnaa08.pds3，是克隆甘蓝型油菜的八氢番茄红素脱氢酶基因pds3，其核苷酸序列长为3182bp；该基因在甘蓝型油菜根、茎、叶、花、角果、雄蕊、雌蕊、萼片、新鲜花瓣、盛开花瓣和败花瓣中均有表达，在花器官中表达量较高，尤其是花瓣中，这与花色性状的特征是一致的。

(2)本发明提供了一个甘蓝型油菜花瓣颜色性状相关的snp分子标记，该位点位于甘蓝型油菜a08染色体的第13734089位碱基，黄色花瓣植株该位点碱基是c或g，黄白色花瓣植株该位点碱基位t或a。黄白色植株可以用ywf-15的kasp引物进行筛选。作为一个分子标记可用于甘蓝型油菜的杂交育种和景观育种。

附图说明

图1是本发明的甘蓝型油菜黄白花植株ywf的表型示意图；

其中a：盛花期zs9(a)与ywf突变体(b)的一朵花花瓣颜色比较，scalebar＝1cm；

b：盛花期zs9(a)与ywf突变体(b)主花序的比较，scalebar＝5cm；

c：成熟期各农艺性状比较；

d：类胡萝卜素总含量比较。

图2是本发明的甘蓝型油菜黄白花相关基因的初定位区域；

其中a：内层的a和b分别代表全基因组19条染色体双亲的变异snp和indel的分布；c和d分别代表两个极端混池y池和w池的snp变异频率；e代表两个混池变异频率的差值；

b：上中下三个曼哈顿图分别代表在a08染色体上y池，w池的snp变异频率以及两个混池频率的差值；

c：候选区域在a08的11.0-17.0mb之间。

图3是本发明中开发的snp多态性分子标记。

图4是本发明中黄白花基因bnaa08.pds3的精细定位过程；

其中a：在bsa-seq结果基础上利用开发的分子标记对20株和835株f2代黄白花表型植株筛选交换单株，竖线下面代表的是该分子标记下的交换单株个数，最终将候选基因定位于ywf-14和ywf-16之间；

b：bnaa08.pds3的基因结构；

c：突变位点ywf-15的测序验证；

d：629份油菜品种包括黄白花ywf和zs9在突变位点ywf-15的基因分型；

e：bnaa08.pds3在zs9和黄白花突变体ywf花瓣中的相对表达量。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：

甘蓝型油菜黄白花性状相关基因bnaa08.pds3的获得：

1.表型鉴定及各农艺性状的考察

1)将黄白花突变体ems-60(mappinglocicontrollingfattyacidprofiles,oilandproteincontentbygenome-wideassociationstudyinbrassicanapus中的附件表1，材料编号h425，本发明中将该材料命名为ywf)和zs9(中双9号，花瓣颜色黄色)分别种植在武汉油料所武昌实验基地，厢宽2m，行距0.33m，每行种植15株，分别种植3个生物学重复，每个生物学重复种植3行，用于成熟期考察各农艺性状的表型，具体表型参数如图1所示。

2)类胡萝卜素总量和各单体含量的测定

分别取盛花期zs9和ywf的新鲜花瓣0.5g于15ml干净离心管中，加入2ml萃取液(氯仿：甲醇(v/v)＝2:1)，涡旋混匀，6000r/min离心10min，吸取下层液体于新的离心管中，以萃取液为空白对照，紫外分光光度计测定440nm处吸光值。根据公式(1)计算类胡萝卜素的浓度，公式(2)计算类胡萝卜素的总含量。

(1)类胡萝卜素浓度(mg/l)＝(a/a^％1cm)×103

其中：a：样品的吸光值；a^％1cm：类胡萝卜素分子的平均吸光值(a^％1cm＝250)

(2)类胡萝卜素总量(mg/100g)＝[a×2ml/a^％1cm×m(g)]×100

其中：m：称取花瓣的质量

类胡萝卜素的提取及各单体含量利用高相液相法(hplc)测定。

类胡萝卜素各单体的含量.

2.对多个世代的群体进行遗传分析，确定花色性状的遗传模式

2015年3月开花期，用花色突变体ywf和zs9进行正反交，2015年9月种植正反交f1代，2016年3月花期观察正反交f1代表型，并对f1代套袋自交。2016年9月种植部分正反交f1代自交后代f2群体，并统计不同花瓣颜色的植株数。利用卡方检测验证是否符合孟德尔遗传，该突变体黄白花色是单隐性核基因控制的。

f2世代的分离比

3.bsa-seq文库的构建测序以及数据分析

(1)基因组dna的提取

2017年3月份花期，在田间调查ywf×zs9杂交后代f2代分离群体各单株表型，并选取花瓣颜色极端黄色和极端乳白色植株各20个单株，进行基因组dna的提取。

(2)文库的构建及测序(bsa-seq)

所有基因组dna提取完成后，测定浓度，分别对表型极端单株的dna浓度进行定量，并等量混合均匀，分别组成两个混池y-pool(极端黄花单株)和w-pool(极端黄白花单株)。文库构建完成后，先使用qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/μl，随后使用agilent2100对文库的insertsize进行检测，insertsize符合预期后，使用q-pcr方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2nm)，以保证文库质量。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行illuminahiseqtmpe150测序。

(3)生物信息分析

i.对下机得到的rawdata进行质控得到cleandata

ii.将cleanreads与参考基因组比对

每一个样本的cleanreads用bwa(burrows-wheeleraligner)和参考基因组校对(lianddurbin,2009)。

iii.检测snp和indel并对其进行注释

用genomeanalysistoolkit(gatk)软件提取所有样本的snp，indel以及大片段的变异。

iv.snp-index的计算及候选区域的界定

对snp-index在染色体上的分布进行作图。默认选择1mb为窗口，10kb为步长，计算每个窗口中snp-index的平均值来反应子代的snp-index分布。根据△snp-index的结果，能够清晰的得到控制黄白花表型的候选区域，具体如图2所示，结果显示候选区域在a08的11.0-17.0mb之间。

5.精细定位

(1)多态性分子标记的开发

首先根据bsa-seq的结果确定初定位的候选区域，再以双亲重测序cleanreads数据与参考基因组比对的结果为基础，在候选区域内及两侧提取双亲中纯合且具有多态性的snp位点作为开发分子标记的候选位点。在bsa-seq结果基础上利用开发的分子标记(图3是显示本发明中开发的snp多态性分子标记)对20株和835株f2代黄白花表型植株筛选交换单株，竖线下面代表的是该分子标记下的交换单株个数。最终将候选基因定位于ywf-14和ywf-16之间，在ywf-14和ywf-16之间仅有一个双亲纯合且具有多态性的分子标记ywf-15，且与该分子标记紧密连锁的基因为bnaa08.pds3(图4中a-c)。

6.精细定位群体dna的提取，并将提取的dna置于-20℃冰箱保存。

7.bnaa08.pds3的扩增

利用primestargxldna聚合酶及bnaa08.pds3的特异引物(f:acagaactggcaccaaactc，r:tggctttgctgaaatgaaat)对zs9和ywf基因组dna模板进行扩增，pcr反应程序：98℃预变性2min；98℃变性10s，tm℃退火15s，68℃延伸1kb/min，30个循环；68℃继续延伸10min；温度降至15℃取出pcr产物。在zs9中的扩增的序列的ywf-15位点的碱基是c，其序列为seqidno.1所示，在ywf中扩增的序列的ywf-15位点的碱基是t。

8.针对bnaa08.pds3的突变位点设计的kasp检测引物

针对步骤7中扩增序列中的snp位点，设计检测引物为：

primer-allelefam：ttttgaatgaaacagacagagacctg；

primer-allelehex：tttttgaatgaaacagacagagaccta；

primer-common：ggaggaggagtgctggtccttt。

根据竞争性等位基因特异性pcr(kasp)的原理，利用荧光探针进行基因分型，黄花材料检测出的等位snp是c:c或g:g，黄白花材料检测出的等位snp是t:t或a:a。

实施例2：

甘蓝型油菜黄白花基因snp变异位点kasp检测引物在油菜育种中的应用：

629份甘蓝型油菜，包括476份中国品种和153份国外品种，其中中国品种包括47份ems突变材料和429份核心种质资源(characterizationandfinemappingofayellow-virescentgeneregulatingchlorophyllbiosynthesisandearlystagechloroplastdevelopmentinbrassicanapus附件表1)。

primer-allelefam：ttttgaatgaaacagacagagacctg；

primer-allelehex：tttttgaatgaaacagacagagaccta；

primer-common：ggaggaggagtgctggtccttt。

结果显示，在629份甘蓝型油菜中，只有黄白花植株ywf为t:t基因型，其余材料均为c:c基因型，且表型均为黄色花瓣(图4中d)。

实施例3：

bnaa08.pds3在zs9和黄白花突变体ywf花瓣中的相对表达量：

1.rna的提取以及荧光定量实验

选取盛花期长势一致的甘蓝型油菜zs9和ywf的盛开花瓣(同测定类胡萝卜素含量选取的花瓣)以及zs11的各组织(根、茎、叶、花蕾、角果、萼片、雄蕊、雌蕊、初花期小花瓣、盛花期的盛开花瓣和终花期的败花瓣)。对上述组织提取总rna并合成cdna。

2.real-timepcr分析采用bio-rad生物公司的cfxconnectreal-timepcr系统及该公司sybrgreenreal-timepcrmastermix试剂盒，反应体系如下：

实时荧光定量pcr反应体系

反应程序：95℃3min；95℃10s；58℃30s；40个循环。

油菜基因bnaactin(af111812.1)作为内参基因，采用2^-△ct计算方法(livakandschmittgen,2001)，以目的基因占actin基因的百分比作为该基因的相对表达量。

结果显示该基因在甘蓝型油菜根、茎、叶、花、角果、雄蕊、雌蕊、萼片、新鲜花瓣、盛开花瓣和败花瓣中均有表达，在花器官中表达量较高，尤其是花瓣(图4中e)中，这与花色性状的特征是一致的。

序列表

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>甘蓝型油菜bnaa08.pds3基因在甘蓝型油菜花瓣颜色性状育种中的应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3182

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atggttgtgtttgggaatgtttccgcggcgaatttgccttatcaaaatggatttttgaag60

gcaatttcatctggaggttgtgatttaatgggacaccgcagcttcaaaatttcaacttgt120

tttaagacaagaacaaggaggaggaggagtgctggtcctttgcaggtctctgtctgtttc180

attcaaaaaaatctgatcaaagtattattggtgatcaaaagagcccaattttgaactgtg240

ttgttaggtagtttgtgtggatataccaaggccagagctagagaacactgtcaacttctt300

ggaagctgcaagtttgtctgcatctttccgtagtgctcctcgtcctgcgaagcctttaaa360

agttgtcatcgctggtgctggtatgatgaatgtgtttaaacttattagcttcctcttctt420

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aggcttatgttgaggctcaagatggtttatcagttgaacaatggatgagaaagcaggcga1680

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tttctatgtattctttacagggagtacctgatcgggtgacagatgaggtgttcattgcca1800

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ctttgaatcggtttcttcaggtttttttggcaaactcttcctttttcctctctctctcta1920

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aa3182

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ttttgaatgaaacagacagagacctg26

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<210>4

<211>22

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<210>5

<211>20

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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