本发明涉及天然产物有效成分的提取和纯化领域，尤其是涉及一种一步纯化铁皮石斛水溶性多糖的方法。
背景技术：
铁皮石斛(dendrobiumofficinalekimuraetmigo)属气生兰科草本植物，又名铁皮兰、黑节草，是一种具有药食同源属性的名贵中药材，其主要化学成分有多糖类、生物碱类、氨基酸类和挥发性成分等。铁皮石斛主要有抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、降糖降脂、护肤保湿、保肝护胃、增强体质等功效，具有较高的经济价值。
铁皮石斛多糖是铁皮石斛的主要活性成分，现有提取铁皮石斛多糖的方法中，存在着多糖提取率低，提取的多糖中杂质含量高等不足。目前对铁皮石斛中多糖类成分的分离纯化的方法主要有凝胶色谱法和离子交换色谱法。但是这两种方法操作复杂、分离效果不佳且应用有所局限性。
高速逆流色谱(high-speedcountercurrentchromatography，hsccc)是一项新型液-液分配色谱技术，hsccc不需要固体支撑体，因此采用hsccc分离天然产物具有重现性好、分离度高、分离量大、操作灵活、分离快速、回收率高和适用范围广等特点，目前在生物制药、天然活性成分分离、食品和化妆品等方面得到了广泛应用。
cn110818812a公开了一种铁皮石斛精制多糖提取物的方法，将铁皮石斛粉末加水提取后，往提取物浓缩液中加入sevage试剂重复操作多次脱蛋白，在脱除蛋白的同时，损失了部分多糖；并且采用阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶树脂对粗多糖进行分离纯化，得到铁皮石斛精制多糖，此方法不仅操作复杂，还存在着效率低、成本高等缺点。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种一步纯化铁皮石斛水溶性多糖的方法，以克服现有技术中分离纯化方法在铁皮石斛多糖纯化过程中存在的操作复杂、纯度低、容易破坏多糖结构等不足，本方法中铁皮石斛粉末只需经过无水乙醇处理，热水浸提获得粗多糖后，可以直接采用高速逆流色谱技术一步纯化铁皮石斛水溶性粗多糖得到精制多糖，能最大程度的保持多糖结构不被破坏，可用于铁皮石斛多糖的结构分析与鉴定。
本技术方案所采用的高速逆流色谱(high-speedcountercurrentchromatography，hsccc)是一项新型液-液分配色谱技术，hsccc不需要固体支撑体，因此采用hsccc分离天然产物具有重现性好、分离度高、分离量大、操作灵活、分离快速、回收率高和适用范围广等特点。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明中一步纯化铁皮石斛水溶性多糖的方法，包括以下步骤：
s1：使用无水乙醇回流的方式提取铁皮石斛破壁粉末，弃滤液，收集滤渣，烘干，得到滤渣粉末；
s2：在加热回流装置中采用热水浸提法对s1中得到的滤渣粉末进行水溶性多糖提取，抽滤，收集滤液，合并浓缩，得到多糖浓缩液；
s3：向s2中得到的多糖浓缩液中加入无水乙醇，振荡，静置；
s4：对s3中静置后的液体进行离心并收集沉淀，所得沉淀经无水乙醇多次洗涤，真空干燥，得到多糖沉淀；
s5：将s4中得到的多糖沉淀加入蒸馏水复溶，透析，真空干燥，得铁皮石斛水溶性粗多糖；
s6：配制高速逆流色谱溶剂，待混合溶剂分层、两相分离后进行超声脱气，上层作为固定相，下层作为流动相，采用固定相、流动相体积比为α的混合溶剂溶解s5中得到的铁皮石斛水溶性粗多糖，得到样品溶液；
s7：设置高速逆流色谱仪的转速和分离温度，先以预设流速泵入固定相，充满固定相后，设定转向方式，再以预设流速泵入流动相，待两相溶剂在柱中达到平衡状态时，样品溶液由进样阀进样，同时启动流分自动收集器收集流分，流分采用苯酚-硫酸法检测；
s8：将获得的相同流分合并，流水透析，真空干燥，得铁皮石斛水溶性精制多糖。
进一步地，s1中使用无水乙醇按照料液比1:20-1:30g/ml回流提取铁皮石斛破壁粉末，回流提取2-3h，滤渣重复处理2-3次；
s2中在加热回流装置中采用热水浸提法按照料液比1:40-1:70g/ml加入滤渣粉末，温度为40-60℃，提取时间为1-3h，进行水溶性多糖提取，抽滤，收集滤液，合并浓缩；
s3中在浓缩的滤液中加入3-6倍体积的无水乙醇，充分振荡，静置12-24h；
s4中采用40-60℃真空干燥；
s5中的透析时间为1-2天。
进一步地，s6中所述高速逆流色谱溶剂包括聚乙二醇、无水硫酸镁和水。
进一步地，所述聚乙二醇、无水硫酸镁和水的质量比为(12-16％):(14-16％):(68-74％)。
进一步地，所述聚乙二醇为聚乙二醇600、聚乙二醇800、聚乙二醇1000中的一种或几种的混合物。
进一步地，所述逆流色谱溶剂体系为：16％mgso4-12％peg600-72％h2o(w/w/w)。
进一步地，s6中配制高速逆流色谱溶剂时，将聚乙二醇和无水硫酸镁分别溶于水中，在分液漏斗中混合，静置，待混合溶剂分层，两相分离后超声脱气20-60min。
进一步地，s6中，固定相、流动相体积比为α＝1。
进一步地，s6中，称取铁皮石斛水溶性粗多糖100-300mg，用上相、下相体积比为1的混合溶剂溶解粗多糖样品，超声加热助溶，得到样品溶液。
进一步地，s7中设置高速逆流色谱仪的主机转速为600-900r/min，分离温度为25-30℃，先以10-30ml/min的流速泵入固定相，待充满固定相后，设定转向方式为正转，再以0.8-2ml/min的流速泵入流动相，待两相溶剂在柱中达到平衡状态时，样品溶液由进样阀进样，同时启动流分自动收集器收集流分，设置为5min/管，流分采用苯酚-硫酸法检测。
进一步地，s8中将获得的相同流分合并后，放入截留分子量为3500da的透析袋中，流水透析，对透析后的溶液旋蒸，醇沉，真空干燥，即得铁皮石斛水溶性精制多糖。
本发明与现有技术相比，具有以下技术优势：
1)本发明所提供的基于高速逆流色谱技术一步纯化铁皮石斛水溶性多糖的方法分离得到的铁皮石斛水溶性精制多糖产品的纯度高，多糖含量达93.51％，复溶效果好，活性成分高，且工艺流程操作简单。
2)本发明与传统的分离纯化铁皮石斛多糖的工艺相比，仅使用乙醇进行了前处理，无残留无隐患且能最大程度的保持多糖的活性结构不被破坏，可以做到一步纯化铁皮石斛水溶性粗多糖得到精制多糖。
3)本发明的纯化工艺流程时间短、成本较低，分离的溶剂体系为双水相体系，可循环使用，节约试剂，绿色环保。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但绝不是对本发明的限制。
实施例1
在加热回流装置中加入铁皮石斛破壁粉末5.0g，按照料液比为1:30g/ml加入无水乙醇，回流提取3h，滤渣重复处理2次，弃滤液，收集滤渣，烘干；取烘干的滤渣1.0g，按照料液比为1:70g/ml加入蒸馏水，提取温度为60℃，提取时间为2h，进行水溶性多糖提取，抽滤，收集滤液，合并浓缩；在浓缩的滤液中加入4倍体积的无水乙醇，充分振荡，静置12h；沉淀离心后经无水乙醇多次洗涤，60℃真空干燥；多糖沉淀加入蒸馏水复溶，透析2天，真空干燥，得铁皮石斛水溶性粗多糖0.45g。
配制高速逆流色谱溶剂体系，选用体系为16％mgso4-12％peg600-72％h2o(w/w/w)，将聚乙二醇600和无水硫酸镁分别溶于水中，在分液漏斗中混合，静置，待混合溶剂分层，两相分离后超声脱气30min，上层作为固定相，下层作为流动相；称取铁皮石斛水溶性粗多糖300mg，用上相、下相体积比为1的混合溶剂溶解粗多糖样品，超声加热助溶，得到样品溶液；设置高速逆流色谱仪的主机转速为800r/min，分离温度为30℃，先以20ml/min的流速泵入固定相，待充满固定相后，设定转向方式为正转，再以2ml/min的流速泵入流动相，待两相溶剂在柱中达到平衡状态时，样品溶液由进样阀进样，同时启动流分自动收集器收集流分，设置为5min/管，流分收集采用苯酚-硫酸法检测；将获得的相同流分合并后，放入截留分子量为3500da的透析袋中，流水透析，对透析后的溶液旋蒸，醇沉，真空干燥，即得铁皮石斛水溶性精制多糖6.4mg，多糖含量达93.51％。
实施例2
在加热回流装置中加入铁皮石斛破壁粉末5.0g，按照料液比为1:30g/ml加入无水乙醇，回流提取3h，滤渣重复处理2次，弃滤液，收集滤渣，烘干；取烘干的滤渣1.0g，按照料液比为1:50g/ml加入蒸馏水，提取温度为50℃，提取时间为2.5h，进行水溶性多糖提取，抽滤，收集滤液，合并浓缩；在浓缩的滤液中加入4倍体积的无水乙醇，充分振荡，静置12h；沉淀离心后经无水乙醇多次洗涤，60℃真空干燥；多糖沉淀加入蒸馏水复溶，透析2天，真空干燥，得铁皮石斛水溶性粗多糖0.42g。
配制高速逆流色谱溶剂体系，选用体系为15％mgso4-16％peg600-69％h2o(w/w/w)，将聚乙二醇600和无水硫酸镁分别溶于水中，在分液漏斗中混合，静置，待混合溶剂分层后，两相分离后超声脱气30min，上层作为固定相，下层作为流动相；称取铁皮石斛水溶性粗多糖200mg，用上相、下相体积比为1的混合溶剂溶解粗多糖样品，超声加热助溶，得到样品溶液；设置高速逆流色谱仪的主机转速为900r/min，分离温度为30℃，先以20ml/min的流速泵入固定相，待充满固定相后，设定转向方式为正转，再以1ml/min的流速泵入流动相，待两相溶剂在柱中达到平衡状态时，样品溶液由进样阀进样，同时启动流分自动收集器收集流分，设置为5min/管，流分收集采用苯酚-硫酸法检测；将获得的相同流分合并后，放入截留分子量为3500da的透析袋中，流水透析，对透析后的溶液旋蒸，醇沉，真空干燥，即得铁皮石斛水溶性精制多糖4.9mg，多糖含量达90.43％。
实施例3
在加热回流装置中加入铁皮石斛破壁粉末5.0g，按照料液比为1:30g/ml加入无水乙醇，回流提取3h，滤渣重复处理2次，弃滤液，收集滤渣，烘干；取烘干的滤渣1.0g，按照料液比为1:60g/ml加入蒸馏水，提取温度为40℃，提取时间为2h，进行水溶性多糖提取，抽滤，收集滤液，合并浓缩；在浓缩的滤液中加入4倍体积的无水乙醇，充分振荡，静置12h；沉淀离心后经无水乙醇多次洗涤，60℃真空干燥；多糖沉淀加入蒸馏水复溶，透析2天，真空干燥，得铁皮石斛水溶性粗多糖0.39g。
配制高速逆流色谱溶剂体系，选用体系为15％mgso4-12％peg800-73％h2o(w/w/w)，将聚乙二醇800和无水硫酸镁分别溶于水中，在分液漏斗中混合，静置，待混合溶剂分层后，两相分离后超声脱气30min，上层作为固定相，下层作为流动相；称取铁皮石斛水溶性粗多糖300mg，用上相、下相体积比为1的混合溶剂溶解粗多糖样品，超声加热助溶，得到样品溶液；设置高速逆流色谱仪的主机转速为800r/min、分离温度为30℃，先以20ml/min的流速泵入固定相，待充满固定相后，设定转向方式为正转，再以1ml/min的流速泵入流动相，待两相溶剂在柱中达到平衡状态时，样品溶液由进样阀进样，同时启动流分自动收集器收集流分，设置为5min/管，流分收集采用苯酚-硫酸法检测；将获得的相同流分合并后，放入截留分子量为3500da的透析袋中，流水透析，对透析后的溶液旋蒸，醇沉，真空干燥，即得铁皮石斛水溶性精制多糖5.8mg，多糖含量达91.71％。
实施例4
在加热回流装置中加入铁皮石斛破壁粉末5.0g，按照料液比为1:30g/ml加入无水乙醇，回流提取3h，滤渣重复处理2次，弃滤液，收集滤渣，烘干；取烘干的滤渣1.0g，按照料液比为1:70g/ml加入蒸馏水，提取温度为50℃，提取时间为2h，进行水溶性多糖提取，抽滤，收集滤液，合并浓缩；在浓缩的滤液中加入4倍体积的无水乙醇，充分振荡，静置12h；沉淀离心后经无水乙醇多次洗涤，60℃真空干燥；多糖沉淀加入蒸馏水复溶，透析2天，真空干燥，得铁皮石斛水溶性粗多糖0.41g。
配制高速逆流色谱溶剂体系，选用体系为16％mgso4-12％peg1000-72％h2o(w/w/w)，将聚乙二醇1000和无水硫酸镁分别溶于水中，在分液漏斗中混合，静置，待混合溶剂分层后，两相分离后超声脱气30min，上层作为固定相，下层作为流动相；称取铁皮石斛水溶性粗多糖100mg，用上相、下相体积比为1的混合溶剂溶解粗多糖样品，超声加热助溶，得到样品溶液；设置高速逆流色谱仪的主机转速为800r/min，分离温度为30℃，先以20ml/min的流速泵入固定相，待充满固定相后，设定转向方式为正转，再以0.8ml/min的流速泵入流动相，待两相溶剂在柱中达到平衡状态时，样品溶液由进样阀进样，同时启动流分自动收集器收集流分，设置为5min/管，流分收集采用苯酚-硫酸法检测；将获得的相同流分合并后，放入截留分子量为3500da的透析袋中，流水透析，对透析后的溶液旋蒸，醇沉，真空干燥，即得铁皮石斛水溶性精制多糖3.7mg，多糖含量达91.33％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。