水稻芽鞘紫线基因OsMYB76的应用及实现方法与流程

水稻芽鞘紫线基因osmyb76的应用及实现方法
技术领域
[0001]
本发明属于基因工程领域，涉及水稻芽鞘紫线基因osmyb76、其改造基因osmyb76r和表达下调元件在转基因阳性株鉴定，配子体雄性不育鉴定及转基因污染鉴定与去除，以及应用的实现方法。


背景技术：

[0002]
myb转录因子家族是植物中最丰富的转录因子家族之一。水稻中共有myb转录因子150多个(katiyar等，2012)，其中osmyb76基因(loc_os06g10350，c基因或osc1，以下统一称为osmyb76)被发现为水稻芽鞘紫线等的花青素合成调控所必需(saitoh等，2004；张毅2009；赵沙沙2014)。目前关于该基因的研究主要集中在进化分析，基因定位和功能验证上，对其应用研究有报道用于杂交种纯度鉴定的(张毅等，2005)，但未见将其用作转基因报告基因，更未见将其用作鉴定雄性配子体不育等的研究。
[0003]
目前用于转基因中的报告基因主要为外源的gus基因或一些荧光蛋白基因，这些基因用作报告基因有如下难以克服的缺点：检测过程复杂，需配制专用检测试剂(比如gus染液)或使用专用检测设备(比如荧光发射器)，容易产生假阳性等。雄性配子体不育同孢子体不育是雄性不育的两种重要类型，配子体不育受花粉基因型控制，孢子体不育受植株基因型控制，因此，配子体不育基因一般只能雌性传递，不能花粉传递，所以在自然界仅靠杂合体保存。孢子体不育的花粉全部败育，在田间通常表现花药形态、颜色、大小异常，不结实。而配子体不育的花药由于有一半花粉可育，同野生型比无明显差异，结实也正常。因此，在田间对配子体不育的发现和鉴定十分困难，需要结合室内的显微观察和分子鉴定。
[0004]
花青素性状在植物中肉眼可见，在各器官均可表现。因此，利用花青素合成调控必需基因osmyb76开发一种简单易行的转基因鉴定和配子体不育鉴定方法具有重要意义。


技术实现要素：

[0005]
有鉴于此，本发明的目的在于提供水稻芽鞘紫线等花青素合成调控必需基因osmyb76、其改造基因osmyb76r和下调元件(优选为干涉片段)的应用及实现方法。osmyb76基因具有调控芽鞘等各器官花青素合成的功能，一旦发生功能缺失性突变或下调表达，往往导致所有器官不能表现紫色。将功能正常的osmyb76基因或由其改造而来的osmyb76r基因同待转的目的基因或片段连锁，一起转入osmyb76基因或其同源基因异常的植物；或osmyb76基因的下调元件(优选为干涉片段)同待转的目的基因或片段连锁，一起转入osmyb76基因或其同源基因正常且任一器官表现紫色的植物；通过植物器官中紫色的有无即可直接提示转基因阳性事件是否存在。其中水稻芽鞘紫线等花青素合成调控必需基因osmyb76的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述osmyb76的改造基因osmyb76r的核苷酸序列如seq id no.2所示，osmyb76的干涉片段的核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0006]
本发明提供利用水稻芽鞘紫线基因鉴定转基因阳性植株的方法，包括以下步骤：
[0007]
(1)根据osmyb76基因的cds核苷酸序列和编码的氨基酸序列，改变部分核苷酸以
除去常用酶切位点，获得osmyb76基因改造后的osmyb76r基因的cds序列并人工合成。在不影响基因调控花青素合成的功能的前提下，可以对osmyb76r基因序列进行取代、缺失或添加至少一个核苷酸，这并不限制对osmyb76基因、osmyb76r基因的应用及其实现方法的保护；或通过pcr或人工合成osmyb76基因的干涉片段。
[0008]
(2)将osmyb76基因或改造后获得的osmyb76r基因的cds序列或干涉片段，置于35s等组成性启动子，或osmyb76基因本身的启动子，或胚乳等特异性启动子下游，tnos等终止子上游，然后将上述启动子+osmyb76基因或osmyb76r基因或干涉片段+终止子区段载入植物表达载体，获得载体p1(osmyb76)、p2(osmyb76r基因)或p3(干涉片段)。本步所述启动子和终止子可灵活选择。
[0009]
(3)将任一目的基因x连入上述带水稻花青素合成调控基因osmyb76或osmyb76r的载体p1、p2或p3中，获得载体px1、px2或px3。
[0010]
(4)将载体px1或px2通过转基因技术转入一osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)异常，花青素缺失的植物中，或将px3转入osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)正常，任一器官有花青素的植物中。在水稻中，9311、明恢63和中九b等品系中的osmyb76基因均发生功能缺失突变，所有器官没有紫色表现，均可作为待转入px1或px2的寄主植物，但这并不排除使用其他osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)异常，花青素缺失的植物品系；g46b、ii-32b等品系中的osmyb76基因均正常，在芽鞘、叶鞘、柱头、颖尖等器官表现紫色，均可作为待转入px3的寄主植物，但这并不排除使用其他osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)正常的植物品系。
[0011]
(5)对px1或px2转基因后代，观察各器官是否有紫色，任一器官有紫色的为转基因阳性株；对px3转基因后代，观察各器官紫色变化，任一原来有紫色的器官变成无紫色的为转基因阳性株。
[0012]
本发明还提供osmyb76或其改造基因osmyb76r或其下调元件(优选为干涉片段)在鉴定配子体雄性不育中的应用，包括以下步骤：
[0013]
(1)根据基因表达数据(在线表达数据库，文献中的基因表达数据，或自行进行花药或花粉转录组测序、基因芯片或rt-qpcr等)分析，初步确定在花粉中高和/或特异表达基因为配子体雄性不育相关基因的候选基因gms。
[0014]
(2)根据候选基因序列，构建gms基因下调表达载体，优选为rnai载体pgmsi。
[0015]
(3)将osmyb76基因，改造基因osmyb76r或osmyb76的干涉片段连入pgmsi中，获得载体p1-gmsi、p2-gmsi或p3-gmsi。
[0016]
(4)将载体p1-gmsi或p2-gmsi转入一osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)异常，花青素缺失的植物中；或将p3-gmsi转入osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)正常，任一器官有花青素的植物中。在水稻中，9311、明恢63和中九b等品系中的osmyb76基因均发生功能缺失突变，所有器官没有紫色表现，均可作为待转入p1-gmsi或p2-gmsi的寄主植物，但这并不排除使用其他osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)异常，花青素缺失的植物品系；g46b、ii-32b等品系中的osmyb76基因均正常，在芽鞘、叶鞘、柱头、颖尖等器官表现紫色，均可作为待转入p3-gmsi的寄主植物，但这并不排除使用其他osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)正常的植物品系。
[0017]
(5)在t
0
代中选出转基因阳性株。
[0018]
(6)用p1-gmsi或p2-gmsi阳性株为父本，同osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)异常，花青素缺失的母本杂交，同时让p1-gmsi或p2-gmsi阳性株自交；或用p3-gmsi阳性株为父本，同osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)正常，任一器官有花青素的母本杂交，同时让p3-gmsi阳性株自交。在水稻中，9311、明恢63和中九b等品系中的osmyb76基因均发生功能缺失突变，所有器官没有紫色表现，均可作为同p1-gmsi或p2-gmsi阳性株杂交的母本，但这并不排除使用其他osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)异常，花青素缺失的植物品系；g46b、ii-32b等品系中的osmyb76基因均正常，在芽鞘、叶鞘、柱头、颖尖等器官表现紫色，均可作为同p3-gmsi阳性株杂交的母本，但这并不排除使用其他osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)正常的植物品系。
[0019]
(7)对p1-gmsi或p2-gmsi的杂交f
1
代，调查具有紫色个体同没有紫色个体的比例。如果全部个体无紫色，或有紫色的个体所占比率远小于50％，说明转基因成分无法或难以随花粉在代间传递，候选基因为配子体不育相关基因；对p3-gmsi的杂交f
1
代，调查具有紫色个体同没有紫色个体的比例(观察部位为p3-gmsi阳性t
0
代中发生紫色丢失的器官)，如果全部个体表现紫色，或无紫色的个体所占比率远小于50％，说明转基因成分无法或难以随花粉在代间传递，候选基因为配子体不育相关基因。原理：在一般情况下，配子体雄性不育相关基因的下调会导致带报告基因和下调元件的转基因花粉全部或部分(随抑制效果而定)致死，不能或极少产生后代，因此f
1
代表现报告性状的几率理论上为0或远小于50％，如果候选基因不是配子体雄性不育相关基因，f
1
代表现报告性状的个体的几率理论上为50％。
[0020]
(8)对p1-gmsi或p2-gmsi的t
1
代中紫色的分离比例进行调查，如果紫色:无色比例符合1:1，说明转基因成分无法或难以随花粉在代间传递，只能通过雌配子在代间进行传递，进一步确证候选基因为配子体雄性不育相关基因；或p3-gmsi的t
1
代中紫色(观察部位为p3-gmsi阳性t
0
代中发生紫色丢失的器官)的分离比例进行调查，如果紫色:无色比例符合1:1，说明转基因成分无法或难以随花粉在代间传递，只能通过雌配子在代间进行传递，进一步确证候选基因为配子体雄性不育相关基因。
[0021]
本发明还提供osmyb76或其改造基因osmyb76r或其下调元件(优选为干涉片段)在鉴定转基因成分随花粉传递比率以及去除转基因花粉污染的应用及实现方法，所述方法包括以下步骤：
[0022]
(1)将待鉴定的转基因成分y连入带osmyb76、osmyb76r或其干涉片段的植物表达载体p1、p2或p3中，获得载体py1、py2或py3。
[0023]
(2)将载体py1或py2转入一osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)异常，花青素缺失的植物中；或将载体py3转入一osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)正常，任一器官表现紫色的植物中。在水稻中，9311、明恢63和中九b等品系中的osmyb76基因均发生功能缺失突变，所有器官没有紫色表现，均可作为待转入py1或py2的寄主植物，但这并不排除使用其他osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)异常，花青素缺失的植物品系；g46b、ii-32b等品系中的osmyb76基因均正常，在芽鞘、叶鞘、柱头、颖尖等器官表现紫色，均可作为待转入py3的寄主植物，但这并不排除使用其他osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)正常的植物品系。
[0024]
(3)在t
0
代中选出转基因阳性株。
[0025]
(4)用py1或py2阳性株为父本，同osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)异常，花青素缺失的母本杂交；或用py3阳性株为父本，同osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)正常，任一器官有花青素的母本杂交。在水稻中，9311、明恢63和中九b等品系中的osmyb76基因均发生功能缺失突变，所有器官没有紫色表现，均可作为同py1或py2阳性株杂交的母本，但这并不排除使用其他osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)异常，花青素缺失的植物品系；g46b、ii-32b等品系中的osmyb76基因均正常，在芽鞘、叶鞘、柱头、颖尖等器官表现紫色，均可作为同py3阳性株杂交的母本，但这并不排除使用其他osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)正常的植物品系。
[0026]
(5)对py1或py2的杂交f
1
代，调查f
1
代总个体数n，具有紫色的个体数n，按随后公式计算待检测的转基因成分随花粉的传递比率(％)：100
×
2n/n；对py3的杂交f
1
代，调查f
1
代总个体数m，没有紫色的个体数m，按随后公式计算待检测的转基因成分随花粉的传递比率(％)：100
×
2m/m。
[0027]
(6)对py1或py2和osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)异常，花青素缺失亲本的杂交后代，直接去掉任一器官具有紫色的个体，即可去除随花粉传递而产生的转基因污染；对py3和osmyb76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)正常，任一器官表现紫色的植物的后代，去除没有紫色(观察部位为py3阳性t
0
代中发生紫色丢失的器官)的个体即可去除随花粉传递而产生的转基因污染。
[0028]
作为一个总的技术构思，本发明所述启动子，待鉴定基因，待转物种品种可灵活选用；本发明的同一基因可使用多个靶点，干涉靶点可以是同一基因的不同位置，同一靶点可以多拷贝使用；另外，在方法陈述中所用的载体名称仅仅是为了陈述方便而使用，并不限制在实际应用中使用其他符号来表示相关载体。因而，上述可选内容的实际采用不表明同本发明有实质性差异，从而不影响本发明的保护。
[0029]
本发明的有益效果在于：本发明公开了osmyb76、其改造基因osmyb76r以及其表达下调元件(优选为干涉片段)，主要调控芽鞘紫线等花青素的合成。osmyb76基因或由其改造而来的osmyb76r基因或其表达下调元件(优选为干涉片段)涉及的核酸或蛋白均为水稻内源性，将其用作报告基因可降低转基因风险和减少人们对转基因产品的担忧。
[0030]
本发明的有益效果还在于：osmyb76基因或由其改造而来的osmyb76r基因或其表达下调元件(优选为干涉片段)控制的紫色性状明显，肉眼可见。在转基因阳性鉴定中，比起gus、gfp等报告基因来说：可使转基因阳性后代的检测程序简化，对检测对象无损伤，不需要药品和仪器，根据紫色有无用肉眼直接判断即可；可使检测结果准确，降低假阳性；可节省检测时间，节省培养及种植空间，降低费用。在配子体雄性不育鉴定中，一般利用分子标记，通过pcr扩增，结合电泳或测序来分析可能的配子体雄性不育的连锁标记在后代中的传递情况，这种方法存在费用高，时间长，假阳性等问题，本发明将表现明显的紫色相关基因或下调元件同可能的配子体雄性不育基因的下调元件连锁，可根据可能的配子体雄性不育后代紫色性状的传递情况进行鉴定，具有直观，简单，准确，时间短等优点。
附图说明
[0031]
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
[0032]
图1为紫色在芽鞘、叶鞘和茎基部的表现，a和b分别为本发明osmyb76基因正常和异常的亲本芽鞘紫线的表现；c为利用组培苗茎基部紫色有无判断是否是阳性株；d为osmyb76基因正常的紫色叶鞘材料，其osmyb76基因干涉前后叶鞘颜色的表现；e、f和g为利用芽鞘紫线调查转基因成分在杂交f
1
中的传递情况，其中e为全部传递，f为部分传递，g为全不传递；
[0033]
图2为osmyb76基因精细定位；
[0034]
图3为载体posmyb76r的多克隆位点改造后的酶切位点示意；
[0035]
图4为pcambia1300的多克隆位点改造后的酶切位点示意。
具体实施方式
[0036]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第四版，冷泉港实验室出版)或精编分子生物学实验指南(第五版，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0037]
术语“芽鞘紫线等花青素合成调控必需基因”指编码具有调控芽鞘紫线等花青素合成的myb转录因子基因osmyb76或由其改造而来的osmyb76r基因，碱基序列如seq id no.2或seq id no.1中第1-819位所示的核苷酸序列及其简并序列。简并序列是指，位于seq id no.2或seq id no.1序列的核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。该术语还包括osmyb76或由其改造而来的osmyb76r基因的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5
’
和/或3
’
端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
[0038]
实施例中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。
[0039]
相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本实施例所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库，或基因组dna作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0040]
实施例1、osmyb76基因突变体植株的获得和形态学的观察
[0041]
osmyb76基因突变体来源于籼稻r25(芽鞘有紫色线条，简称芽鞘紫线)的突变。osmyb76突变体与r25杂交，f
l
代全部为芽鞘有紫线，自交f
2
代中出现分离，有紫线同无紫线的比例符合3:1，表明无紫线突变体表型由一个核基因突变造成。对osmyb76突变体植株的形态学观察：突变体和野生型的主要区别是野生型的芽鞘上有一明显紫色线条(图1，a)，而osmyb76突变体的芽鞘没有紫线(图1，b)。
[0042]
实施例2、osmyb76基因的定位和克隆
[0043]
1、定位群体
[0044]
将osmyb76突变体与有紫线的ii-32b杂交，同时将无紫线的中九b同野生型r25杂
交，所得f
1
自交获得f
2
代，种植f
2
获得定位群体。
[0045]
2、提取水稻dna
[0046]
亲本采用改进的ctab法进行提取，包括如下步骤：取叶片0.1-0.2克(约半片)放到小研钵中，加入适量的液氮，立刻研磨至粉状，装入2m1离心管，加入700μl 100℃预热的1.5
×
ctab溶液于离心管中，小心混匀后放入65℃水浴，20分钟后取出离心管，加入等体积氯仿/异戊醇，猛烈混匀，13000rpm离心10分钟，取上清于新管中，加入900μl无水乙醇混匀后-20℃放半小时以上。将析出的dna离心，14000rpm离心10分钟。去掉上清，将沉淀用1ml体积分数为70％乙醇清洗一次，离心干燥，溶于200μl te溶液中，4℃冰箱保存。定位群体的单株dna采用改进的碱煮法提取，包括如下步骤：剪碎嫩叶片1-2cm
2
放入0.5m1离心管，加入100μl浓度为0.125m的naoh溶液，沸水浴30秒，然后加入50μl浓度为1.0m的tris-hcl(ph8.0)，最后加入100μl浓度为0.125m的hcl，沸水浴2分钟后4℃冰箱保存备用。
[0047]
3、群体分离分析初定位
[0048]
取f
2
中有紫线和无紫线单株各15株，分别混合后提取dna，获得有线基因池和无线基因池。根据已发表的序列合成ssr引物(具体参见http://www.gramene.org.microsat/ssr.html)，用所合成的302对引物对基因池进行扩增，pcr扩增程序为:10μl体系中，lμl模板，lμl 10pmol/μl上游引物，lμl10pmol/μl下游引物，lμl 10
×
buffer(mg
2十
)，lμl 2mm dntp，0.lμl taq，3.9μl水；pcr产物用质量体积分数为10％的page胶电泳，银染方法检测。经过两个f
2
代所形成的定位群体的初步定位，得到相同的初步定位结果：第6染色体上的引物rm587和rm5531在基因池间有差异，用隐性单株分析后表明它们都与紫线连锁，且两引物的重组子互不包含，表明它们分别位于目的基因两侧，同目的基因的遗传距离分别为22.9cm和20.3cm(图2)。初步定位引物序列如表1所示。
[0049]
4、精细定位
[0050]
为了进一步缩小候选基因的定位范围，我们用中九b
×
r25的f
2
代作精细定位群体，共获取了1020株无线单株。在初步定位的引物rm587和rm5531间新合成24对ssr引物，其中rm8258、rm5754和rm19665在亲本间有明显差异。进一步分析表明，它们都同目的基因连锁。在1020个隐性单株中分别发现重组子20、14、和186个，根据各引物重组子数及包含关系，将osmyb76基因定位在rm5754和rm19665之间(图2)。根据在http://www.gramene.org/网站对精细定位区间的注释，发现仅有一个与花青素形成有关的myb转录因子—loc_os06g10350，同源分析表明，它在玉米中的同源基因c1调控色素合成相关结构基因的转录。loc_os06g10350极有可能是我们的候选基因osmyb76。通过对r25和突变体中loc_os06g10350基因的测序比对发现：osmyb76突变体中loc_os06g10350基因的cds中第319位碱基后一个10碱基(actggaacag)的缺失，导致突变体中该基因的蛋白质翻译从第107位氨基酸开始发生移码，并提前终止于第206位氨基酸；第369位碱基发生了一个t
→
c替换，第716位碱基发生了一个t
→
c替换。因此，初步确定loc_os06g10350是我们的目标基因osmyb76。该基因cds的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0051]
表1基因定位与功能验证引物序列
[0052][0053]
实施例3、osmyb76基因的功能分析与在转基因阳性后代鉴定中的应用
[0054]
为了进一步确定osmyb76基因是引起无紫线表型的基因，并且检测该基因能否用作报告基因用于转基因阳性后代检测，将osmyb76基因的cds及改造后的osmyb76基因(seq id no.1)分别通过酶切和同源重组方式取代pcambia1301中的gus基因，得载体p1(posmyb76)和p2(posmyb76r)，同时将水稻花粉育性发育相关的基因osabcg15(wu et al.,2014)的互补片段载入p1(posmyb76)和p2(posmyb76r)载体中的多克隆位点，得载体px1(posabcg15-osmyb76)和px2(posabcg15-osmyb76r)，将载体转入相关材料进行紫色和育性性状调查，具体操作如下：
[0055]
1、以r25芽鞘cdna为模板，用引物osmyb76cf/r(带bglii和bsteii，表1)扩出目的片段，用bglii和bsteii将目的片段连入pcambia1301，得载体p1(posmyb76)；以合成的osmyb76r基因为模板，用osmyb76rf/r(分别带pcambia1301的bglii和bsteii附近同源片段，表1)扩出目的片段，用同源重组方式将目的片段连入pcambia1301，得载体p2(posmyb76r)。
[0056]
2、用ecori和sbfi从osabcg15基因的互补载体(wu et al.,2014)中切出osabcg15基因的互补片段，同时载入p1(posmyb76)和p2(posmyb76r)，得载体px1(posabcg15-osmyb76)和px2(posabcg15-osmyb76r)。各载体经测序确保序列正确后，采用冻融法转化根癌农杆菌lba4404，得分别含重组表达载体px1(posabcg15-osmyb76)和px2(posabcg15-osmyb76r)的根癌农杆菌。
[0057]
3、将所得阳性农杆菌转化水稻osmyb76突变体，观察其紫色表现情况，结果显示两个质粒转出的部分t
0
植株的茎基部表现紫色(图1，c)，开花时的叶鞘、茎、柱头和成熟时谷尖也表现紫色，其t
1
代的芽鞘紫线表现3:1的分离，开花时的叶鞘、茎、柱头和成熟时谷尖均表现紫色，且同芽鞘紫线共分离；而茎基部无色的t
0
植株在任何时候和器官均无紫色出现，其t
1
代的也是所有器官在任何时候均无紫色。上述结果说明本发明所克隆的osmyb76就是控制花青素合成的目的基因，同时说明改造而来的osmyb76r基因具有同osmyb76基因相同的功能，也能调控花青素的合成。
[0058]
4、以osmyb76基因异常的中九b为轮回父本，以osabcg15基因的核不育突变体为非轮回母本，选育出osmyb76基因异常，所有器官无紫色的无色核不育材料中九b-osabcg15。将上述阳性农杆菌转化无色中九b-osabcg15，结果发现凡是基部紫色的t
0
植株的花粉均恢复成可育，且这些植株的t
1
代的紫色均与花粉可育共分离，无色与花粉不育共分离。无色核不育材料osabcg15经转基因后变为可育，对osabcg15基因来说发生了转基因阳性事件；可
育与紫色在t
0
植株中相伴出现，在t
1
代中表现共分离，说明紫色可以用来指示转基因阳性事件。因此，基因osmyb76及由其改造而来的osmyb76r基因可用作植株内源性报告基因，用于转基因阳性植株鉴定。
[0059]
实施例4、osmyb76r基因在鉴定配子体雄性不育、鉴定花粉传递转基因成分和筛除由花粉传递的转基因污染中的应用
[0060]
雄配子体发育相关基因往往在中后期的花/花粉中表达。为了找到一些配子体发育相关基因，对bar水稻基因表达数据库(http://bar.utoronto.ca/efprice/cgi-bin/efpweb.cgi)进行分析，发现很多在中后期花中表达的基因，经qpcr验证，选出一批可能同雄配子体发育相关的基因。其中，水稻loc_os05g40740基因在后期花中特异高表达，其拟南芥的同源基因在花粉中特异表达，初步将loc_os05g40740基因列为雄配子体发育相关基因，将其启动子列为花粉特异启动子。为了制备和鉴定出配子体雄性不育材料，以loc_os05g40740为对象，实施了配子体雄性不育创造和鉴定：
[0061]
1、对前述载体p2(posmyb76r)的多克隆位点的酶切位点种类和顺序进行改造。先人工合成新的多克隆位点序列，其核苷酸序列如seq id no.18所示。然后通过同源重组将合成序列替换原有多克隆位点的序列，新的多克隆酶切位点如图3所示。多克隆位点改造后的载体命名为posmyb76r1。
[0062]
2、人工合成nos终止子序列a(带酶切位点sbf i+asc i)，其核苷酸序列如seq id no.19所示；将其载入posmyb76r1得载体posmyb76r2。
[0063]
3、人工合成loc_os05g40740的干涉片段(带酶切位点ecori+sbf i)，其核苷酸序列如seq id no.20所示；将其载入posmyb76r2得载体posmyb76r3。
[0064]
4、用引物p5f(5
’-
gcgtcgacgtcccatgtcaccgacagtact-3
’
，seq id no.21，带酶切位点sali)和p5r(5
’-
cggaattccgtggaaatgtgatcgctaggct-3
’
，seq id no.22，带酶切位点ecori)从中花11中扩出loc_os05g40740的启动子，其核苷酸序列如seq id no.23所示。载入载体posmyb76r3得配子体雄性不育载体posmyb76r-gm。
[0065]
5、将posmyb76r-gm转入农杆菌lba4404，再将阳性农杆菌转染所有器官无色的中九b。
[0066]
6、在t
0
代根据茎基部紫色有无选出阳性株，让其自交，并用阳性株作父本，同前述无色核不育材料中九b-osabcg15杂交。对自交和杂交种子进行紫线调查，发现自交f
2
种子紫线有无分离比例符合1:1，不符合3:1，97.1％的杂交f
1
种子表现无紫线，这说明转基因成分难以随花粉在代间进行传递，但随雌配子在代间进行传递，这正是配子体雄性不育的特征。因此，loc_os05g40740与雄配子体花粉发育有关，通过对其进行干涉，借助连锁的紫线性状的遗传调查，我们获得了配子体雄性不育材料并成功进行了遗传鉴定。
[0067]
用上述创造配子体雄性不育材料的遗传分析所用的f
1
种子，也可通过调查紫线个体的比例，实现鉴定花粉传递转基因成分的几率，通过剔除带紫线的个体，实现筛除由花粉传递的转基因污染。
[0068]
实施例5、osmyb76基因干涉在鉴定转基因阳性株中的应用
[0069]
在水稻中，很多材料的osmyb76基因是正常的，这些材料通常在某一或很多器官表现紫色，比如ii-32b就在芽鞘，叶鞘，叶缘，柱头等器官表现紫色，这些材料如果作为转基因对象，不能通过用osmyb76或改造的osmyb76r基因作报告基因来鉴定转基因阳性株。由此，
设计了利用osmyb76的干涉来鉴定这部分材料的转基因阳性株的方法，具体操作及结果如下：
[0070]
1、对载体pcambia1300的多克隆位点的酶切位点种类和顺序进行改造。先人工合成新的多克隆位点序列，其核苷酸序列如seq id no.24所示。然后通过同源重组将合成序列替换原有多克隆位点的序列，新的多克隆酶切位点如图4所示。多克隆位点改造后的载体命名为prsvm-1300。
[0071]
2、利用prsvm-1300中同尾酶bamhi和bglii依次载入osmyb76基因的干涉元件：
[0072]
(1)人工合成nos终止子序列b(带酶切位点spei+bamhi和bglii)，其核苷酸序列如seq id no.25所示；将其载入puc57得载体ptnosb。
[0073]
(2)用spei+bglii从ptnosb切出目的片段tnosb，同时用spei+bamhi酶切prsvm-1300回收骨架备用，将目的片段和骨架连接得载体prtnosb。
[0074]
(3)人工合成osmyb76干涉片段ic1(带酶切位点spei+bamhi和bglii)，其核苷酸序列如seq id no.3所示；将其载入puc57得载体pic1。
[0075]
(4)用spei+bglii从pic1切出目的片段ic1，同时用spei+bamhi酶切prtnosb回收骨架备用，将目的片段和骨架连接得载体pic2。
[0076]
(5)设计引物pcf5(ggactagtggatccctccctccgtcccaaaatataag，seq id no.26，带spei_bamhi)/pcr5(gaagatctgcagcaagctctcctccccat，seq id no.27，带bglii)，从r25基因组扩出osmyb76基因启动子回收备用，启动子核苷酸序列如seq id no.28所示。
[0077]
(6)用spei+bglii酶切上述osmyb76基因启动子回收备用，同时用spei+bamhi酶切pic2回收骨架备用，将目的片段和骨架连接得载体pic。
[0078]
(7)用ecori和sbfi从osabcg15基因的互补载体中切出osabcg15基因的互补片段，载入pic得载体posabcg15-ic。
[0079]
(8)以叶鞘紫色的ii-32b为轮回父本，以osabcg15基因的核不育突变体osabcg15为非轮回母本，选育出osmyb76基因正常，叶鞘等紫色的核不育材料ii-32b-osabcg15。将含posabcg15-ic的农杆菌转化ii-32b-osabcg15，获得15个t
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单株，其中6个单株叶鞘紫色，9个单株叶鞘无色(图1，d)，凡是叶鞘紫色的t
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植株的花粉仍然不育，无色的t
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植株的花粉恢复可育，且这些可育植株的t
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代的叶鞘无色均与花粉可育共分离，紫色与花粉不育共分离。核不育材料ii-32b-osabcg15经转基因后变为可育，对osabcg15基因来说发生了转基因阳性事件；可育与无色叶鞘在t
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植株中相伴出现，在t
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代中表现共分离，说明干涉产生的无色叶鞘可以用来指示转基因阳性事件。因此，当寄主被转前有紫色性状时(比如紫色叶鞘)，可用基因osmyb76干涉产生的无色性状报告转基因，用于阳性植株鉴定(图1，e～f)。
[0080]
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。