一种鉴别香斜棘*与丝鳍斜棘*的DNA条形码及其鉴别方法和应用与流程

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种鉴别香斜棘与丝鳍斜棘的dna条形码及其鉴别方法和应用。

背景技术：

香斜棘[repomucenusolidus(günther,1873)]隶属于鲈形目(perciformes)、科(callionymidae)。香斜棘为暖水性浅海底层小型鱼类。喜栖于江河入海的河口区和沿岸水域，亦进入河流下游及其附属水体。主要以浮游植物和浮游动物为食，包括硅藻、有孔虫、沙壳纤毛虫等。香斜棘分布于西北太平洋区，包括中国、朝鲜半岛。在中国主要分布于东海、南海的中国沿岸及各河川下游、台湾省近岸海域，偶见于江苏近海及各河口区。其外部形态与丝鳍斜棘[repomucenusvirgis(jordan&fowler,1903)]较为相似：体延长，纵扁。枕骨区平滑。鳃孔背位。前鳃盖骨强棘为头长的0.36～0.42倍，强棘宽，末端向上弯曲，腹缘平滑而直或稍凸，基部具一强倒棘，背缘具三至五个大弯棘(一些样本具二棘)。侧线从眼延伸至尾鳍基部，具一短的眼下分支，体侧线通常具许多极短的向下分支，枕骨区及尾柄背部各具一条横向侧线将体侧二侧线连接。第一背鳍基底短，短于两背鳍之间距，雄鱼第一背鳍稍高，第i棘最长，与第二背鳍同高，雌鱼第一背鳍则低；雌、雄鱼第二背鳍鳍缘平直或稍凹；背鳍与臀鳍除最后一鳍条外，其余鳍条均不分叉；胸鳍延伸至臀鳍第1或第2鳍条基部；尾鳍圆形。酒精保存的标本体呈棕至深棕色，腹部及喉部棕色；眼深灰色；头及体具许多深点及深斑；雌鱼第一背鳍鳍膜黑色，雄鱼第一背鳍色淡；雌雄鱼第二背鳍透明，通常各鳍条基部具一黑斑；臀鳍透明；尾鳍基部具一或二排成垂直列状的黑斑。香斜棘与丝鳍斜棘虽然在背鳍鳍条长度等方面存在一定差异，但二者均属典型的小型鱼类且在众多形态上非常相似，仅凭借形态特征容易造成误鉴定。因此寻找区分香斜棘和丝鳍斜棘的可靠标准，从混杂的个体中鉴别、分离样品成为一个重要问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴别香斜棘与丝鳍斜棘的dna条形码及其鉴别方法和应用，本发明采用微型dna条形码将两种斜棘进行鉴别，操作简单，易于掌握，准确性高；有助于解决种质混杂等问题，为鱼类分类学研究及其多样性保护提供技术支撑。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种鉴别香斜棘与丝鳍斜棘的dna条形码，所述香斜棘的dna条形码序列如seqidno.1所示；所述丝鳍斜棘的dna条形码序列如seqidno.2所示。

本发明提供了扩增所述的dna条形码的引物，包括12s-mifish-f和12s-mifish-r；所述12s-mifish-f的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述12s-mifish-r的核苷酸序列如seqidno.4所示。

本发明提供了一种利用所述的dna条形码鉴别香斜棘与丝鳍斜棘的方法，包括以下步骤：

1)提取待鉴别样本的基因组dna获得待鉴别dna；

2)以步骤1)中获得的待鉴别dna为模板，以所述的引物进行pcr扩增获得扩增产物；

3)将所述扩增产物的序列与dna条形码进行比对；如果所述扩增产物的序列和香斜棘的dna条形码一致，则待鉴别样本为香斜棘如果所述扩增产物的序列和丝鳍斜棘的dna条形码一致，则待鉴别样本为丝鳍斜棘

优选的，步骤2)中所述pcr扩增的扩增体系以25.15μl计，包括以下组分：超纯水17.5μl，10×buffer2.5μl，dntps2μl，rtaq0.15μl，待鉴别dna1μl，引物12s-mifish-f1μl，引物12s-mifish-r1μl。

优选的，步骤2)中所述pcr扩增的扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性25s，54℃退火25s，72℃延伸25s，35个循环；72℃延伸8min，4℃保存。

优选的，步骤3)中所述扩增产物的序列通过测序获得。

本发明还提供了所述的鉴别香斜棘与丝鳍斜棘的dna条形码、扩增所述dna条形码的引物在鉴别香斜棘与丝鳍斜棘中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的鉴别香斜棘与丝鳍斜棘的dna条形码，位于线粒体dna(mtdna)12srrna上；利用所述dna条形码鉴别香斜棘与丝鳍斜棘结果稳定，可重复性强；鉴别方法简单。

具体实施方式

本发明提供了一种鉴别香斜棘与丝鳍斜棘的dna条形码，所述香斜棘的dna条形码序列如seqidno.1所示；所述丝鳍斜棘的dna条形码序列如seqidno.2所示。

在本发明中，所述鉴别香斜棘与丝鳍斜棘的dna条形码位于mtdna12srrna上，所述香斜棘的dna条形码序列seqidno.1所示，具体如下：

caccgcggttatacgagaggcccaaattgacctacaacggcgtaaagggtggttaaaatttactagaatagagccgaactgatccctgactgttatacgttacggaataaagaagaacaataaacgaaggtagctctaaaattttgaaaccacgaaagctaggaaa；

所述丝鳍斜棘的dna条形码序列如seqidno.2所示，具体如下：

caccgcggttatacgagaggcccaaattgataggtacggcgtaaagggtggttaaaatcttattaacctagggccgaactcgtccccgactgttatacgttacggaatgaagaagtactaaaacgaaagtagctctaaatatttgaatccacgaaagctaggaaa。

在本发明中，所述香斜棘与丝鳍斜棘的dna条形码序列存在22个碱基的差异，表现为9个颠换，8个转换、5个插入/缺失。

本发明还提供了扩增所述的dna条形码的引物，包括12s-mifish-f和12s-mifish-r；所述12s-mifish-f的核苷酸序列如seqidno.3所示，具体如下：5’-gttggtaaaactcgtgccagc-3’；所述12s-mifish-r的核苷酸序列如seqidno.4所示，具体如下：5’-catagtggggtatctaatcccagtttg-3’。

本发明还提供了一种利用dna条形码鉴别香斜棘与丝鳍斜棘的方法，包括以下步骤：1)提取待鉴别样本的基因组dna获得待鉴别dna；2)以步骤1)中获得的待鉴别dna为模板，以所述的引物进行pcr扩增获得扩增产物；3)将所述扩增产物的序列与dna条形码进行比对；如果所述扩增产物的序列和香斜棘的dna条形码一致，则待鉴别样本为香斜棘如果所述扩增产物的序列和丝鳍斜棘的dna条形码一致，则待鉴别样本为丝鳍斜棘

在本发明中，首先提取待鉴别样本的基因组dna获得待鉴别dna。本发明对所述待鉴别样本的基因组dna的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的动物基因组dna提取方法即可，优选的采用商品化的dna提取试剂盒进行提取。

本发明在获得所述待鉴别dna后，以所述待鉴别dna为模板，用所述的引物进行pcr扩增获得扩增产物。在本发明中，所述pcr扩增的扩增体系以25.15μl计，优选的包括以下组分：超纯水17.5μl，10×buffer2.5μl，dntps2μl，rtaq0.15μl，待鉴别dna1μl，引物12s-mifish-f1μl，引物12s-mifish-r1μl。在本发明中，所述扩增的扩增程序优选的如下：94℃预变性5min；94℃变性25s，54℃退火25s，72℃延伸25s，35个循环；72℃延伸8min，4℃保存。本发明在所述pcr扩增结束后优选的还包括扩增产物的纯化步骤；本发明对所述扩增产物的纯化方法没有特殊限定，采用本领域常规的pcr产物纯化试剂盒即可。本发明在所述纯化步骤后，优选的将纯化后的扩增产物测序获得扩增产物的序列。本发明对所述测序的方法没有特殊限定，优选的委托生物测序公司进行。

本发明在获得所述扩增产物的序列后，将所述扩增产物的序列与dna条形码进行比对；如果所述扩增产物序列和香斜棘的dna条形码一致，则待鉴别样本为香斜棘如果所述扩增产物序列和丝鳍斜棘的dna条形码一致，则待鉴别样本为丝鳍斜棘

本发明还提供了所述的鉴别香斜棘与丝鳍斜棘的dna条形码、扩增所述dna条形码的引物在鉴别香斜棘与丝鳍斜棘中的应用。利用本发明提供的鉴别香斜棘与丝鳍斜棘的dna条形码、扩增所述dna条形码的引物能够实现香斜棘与丝鳍斜棘简单、快速、准确的鉴别。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

选用浙江舟山近海的香斜棘与丝鳍斜棘组成香斜棘样本群和丝鳍斜棘样本群，提取2个样本群中个体的dna，然后以所提取的dna为模板进行pcr扩增，对扩增结果进行纯化、测序，比对测序结果；

所述的引物序列为12s-mifish-f(seqidno.3)：5’-gttggtaaaactcgtgccagc-3’；12s-mifish-r(seqidno.4)：5’-catagtggggtatctaatcccagtttg-3’；

所述的pcr扩增的反应体系组成为：

0.2ml离心管中依次加入：

pcr扩增程序为94℃预变性5min，(94℃变性25s，54℃退火25s，72℃延伸25s)×35个循环，72℃延伸8min，4℃保存∞。

使用axyprepdna凝胶回收试剂盒对pcr产物进行纯化，具体纯化步骤如下：(1)在紫外灯下切下含有目的dna的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体。提前记录1.5ml离心管重量，并计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μl体积)；(2)加入3个凝胶体积的bufferde-a，混合均匀后于75℃加热，间断混合(每2-5min)，直至凝胶块完全熔化(约6-8min)；(3)加入0.5个bufferde-a体积的bufferde-b，混合均匀；并加入1个凝胶体积的异丙醇；(4)吸取步骤3中的混合液，转移到dna制备管(置于2ml离心管)中，12000×g离心1min，弃滤液；(5)将制备管置回2ml离心管，加500μlbufferw1，12000×g离心30s，弃滤液；(6)将制备管置回2ml离心管，加650μlbufferw2，12000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用650μlbufferw2洗涤一次，12000×g离心1min；(7)将制备管置回2ml离心管中，12000×g离心1min；(8)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加25-30μleluent或去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱dna。收集洗脱液后送上海桑尼生物科技有限公司进行测序，测序平台为美国abi公司3730xl型测序仪。测序结束后对4个群体的测序结果进行比对。

由香斜棘和丝鳍斜棘mtdna12srrna基因166bp碱基排序结果可以看出香斜棘与丝鳍斜棘存在22个碱基的差异，表现为9个颠换，8个转换、5个插入/缺失。

香斜棘和丝鳍斜棘的mtdna12srrna基因166bp序列比对结果如表1所示。

表1香斜棘和丝鳍斜棘的mtdna12srrna基因166bp序列比对

其中“*”表示相同的碱基序列位点，“-”表示缺失位点。zsro：舟山近海香斜棘样品；zsrv：舟山近海丝鳍棘样品。

测序结果表明，香斜棘的dna条形码序列为：caccgcggttatacgagaggcccaaattgacctacaacggcgtaaagggtggttaaaatttactagaatagagccgaactgatccctgactgttatacgttacggaataaagaagaacaataaacgaaggtagctctaaaattttgaaaccacgaaagctaggaaa；丝鳍斜棘的dna条形码序列为：caccgcggttatacgagaggcccaaattgataggtacggcgtaaagggtggttaaaatcttattaacctagggccgaactcgtccccgactgttatacgttacggaatgaagaagtactaaaacgaaagtagctctaaatatttgaatccacgaaagctaggaaa。

香斜棘5尾样品扩增结果一致，结果稳定且可重复性强。

综上所述，本发明提供的香斜棘种内(舟山群体)的扩增结果表现出高度的一致性；与丝鳍斜棘的扩增结果差异显著。本发明提供的基于12srrna基因的碱基差异的dna条形码能够区分香斜棘和丝鳍斜棘

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>海南热带海洋学院

<120>一种鉴别香斜棘䲗与丝鳍斜棘䲗的dna条形码及其鉴别方法和应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>166

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

caccgcggttatacgagaggcccaaattgacctacaacggcgtaaagggtggttaaaatt60

tactagaatagagccgaactgatccctgactgttatacgttacggaataaagaagaacaa120

taaacgaaggtagctctaaaattttgaaaccacgaaagctaggaaa166

<210>2

<211>165

<212>dna

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<400>2

caccgcggttatacgagaggcccaaattgataggtacggcgtaaagggtggttaaaatct60

tattaacctagggccgaactcgtccccgactgttatacgttacggaatgaagaagtacta120

aaacgaaagtagctctaaatatttgaatccacgaaagctaggaaa165

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

gttggtaaaactcgtgccagc21

<210>4

<211>27

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>4

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