本发明属于肉牛的选种与培育技术领域，具体公开一种基于肠道菌群评价牛肉品质性状的方法。
背景技术：
肉品质性状是肉牛重要的经济性状，提高肉牛肉品质性状已经成为肉牛肉用性能进一步选育的主要目标。其中，肌纤维的组织学特征是评价食用肉品质的重要指标，同时大部分肉品质相关性状，诸如背膘厚度、大理石花纹、嫩度、多汁性以及肌内脂肪沉积等均与脂代谢相关。
以往对肉牛的选种与培育是通过对肉品质性状的表型指标，在基因水平筛选与肉品质性状相关的分子遗传标记作为主要技术手段。然而，在操作过程中这种方式需要更专业的技术人员、器械和设备才能采集所需血液、组织等样品，再通过分析差异表达基因，获得特异性分子标记。整个过程需投入大量人力、物力、财力和时间。但随着微生物组学技术飞速发展及深入的研究，揭示了肠道菌群与机体脂肪代谢存在高度相关性，故脂代谢相关肉品质性状肯定与其调控脂代谢的肠道菌群有着密不可分关系。因此通过对肠道菌群的研究，设计和建立一个简便、快捷的对肉牛肉品质性状进行评价的方法体系，对于优良肉品质肉牛的育种与肉品质的提高具有重要意义。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种基于肠道菌群与肉品质性状相关性辅助肉牛选育的方法，其目的在于，基于二代高通量测序技术检测粪便样本中16srrna高可变区，分析肠道菌群物种组成和属水平菌群，实现通过肠道菌群判断其肉品质性状的目的。
本发明的技术方案：一种基于肠道菌群评价牛肉品质性状的方法，该方法包括下述步骤：
s1粪便采集与保存
s1.1采用直肠采集或拾取新鲜粪便的方法采集粪便样品置于液氮中贮存备用；
s1.2肠道菌群dna提取：采用mobio/qiagen公司的dneasypowersoilkit进行抽提，并对抽提的dna进行检测；
s1.3采用荧光分光光度计在260nm和280nm处分别测定dna的吸光值，检测dna的浓度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测dna的质量；
s1.4调整dna溶液浓度，dna工作液保存于4℃，储存液保存于-20℃，备用；
s2pcr扩增：按照常规的生物学方法设计引物，利用16srrna的v3-v4区通用引物338f和806r进行pcr扩增，其中338f的序列为5'-actcctacgggaggcagca-3'，806r的序列为5'-ggactachvgggtwtctaat-3'，并采用标准的illuminatruseqdna文库，制备实验流程构建所需的上机文库；
s3肠道菌群多样性组成谱分析流程如下：(1)利用illuminamiseq平台对dna片段进行双端测序，得到原始数据；(2)采用qiime2软件对原始数据进行质控；(3)out分类统计，菌群结构和丰度分析；
s4相关性分析方法
使用统计学软件spss22.0中的spearman检验来分析肉品质性状相关指标和肠道菌群中属水平菌群相对丰度的相关性，p<0.05认为差异具有统计学意义。
本发明的技术效果：本辅助肉牛选育的方法，是基于二代高通量测序技术，利用粪便样本中的16srrna高可变区，计算肠道菌群物种组成及丰度，与肉牛肉品质相关性状做关联分析，提出通过肠道菌群与肉品质相关性状的相关性筛选出与肉品质性状相关的生物标志物，并以此判定肉牛肉品质性状，其具有采样便捷、分析快速、成本低廉的优点。
具体实施方式
实施例1：选择相同饲养条件下的18月龄左右健康肉牛共12头，从中挑选体重最大和最小各4头，共8头牛测定肉品质性状相关指标，并采集粪便放置液氮保存与运输。基于肠道菌群与肉品质性状相关性辅助肉牛选育的方法，包括下述步骤：第一步，肉牛指标测定：(1)胴体性状测定：对肉牛进行空腹称重，活体测定肉牛背膘厚度、眼肌面积。测定结束后进行屠宰取样，采集肉牛背最长肌。(2)肉品质性状测定；将肌肉样品分别测定嫩度、肌内脂肪、水分和灰分。
第二步，肠道菌群dna提取：采用mobio/qiagen公司的dneasypowersoilkit进行抽提，并对抽提的dna进行检测。采用荧光分光光度计(quantifluor-stfluorometer，promega，e6090；quant-itpicogreendsdnaassaykit，invitrogen，p7589)，在260nm和280nm处分别测定dna的吸光值，检测dna的浓度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测dna的质量。调整dna溶液浓度，dna工作液保存于4℃，储存液保存于-20℃。
第三步，pcr扩增：首先对16srrna基因可变区进行扩增：(1)针对样本dna特定区域进行pcr预试验；(2)大批量pcr扩增(pyrobestdnapolymerase，takara，dr500a)；然后进行胶回收纯化：针对目标条带进行割胶回收，得到纯化的样本(axyprepdnagelextractionkit，axygen，ap-gx-500)；然后进行各样本定量：利用biotek酶标仪对各个样品定量(biotekflx800酶标仪；quant-itpicogreendsdnaassaykit，invitrogen，p7589)；最后采用标准的illuminatruseqdna文库制备实验流程(illuminatruseqdnasamplepreparationguide)构建所需的上机文库。建库测序流程实验主要流程如下：(1)dna双末端修复：利用endrepairmix中3’-5’核酸外切酶和聚合酶的共同作用，修复带有突出末端的dna片段。(2)3’端引入“a”碱基：在修复平整的dna片段3’端引入单碱基“a”。而在接头的3’末端含有单碱基“t”，从而保证dna片断和接头能够通过“a”“t”互补配对连接，并防止接头连接dna片段的过程中，dna插入片断彼此相连。(3)接头连接：在连接酶的作用下，孵育含有标签的接头与dna片段，使其相连。(4)纯化连接产物：凝胶纯化连接产物，去除游离的及发生自连的接头序列，同时选择大小合适的dna片段进行纯化，用于后续的簇生成反应。(5)富集dna片段：利用pcr选择性地富集两端连有接头的dna片段，同时扩增dna文库。pcr应尽量使用较少的循环数，避免pcr扩增中文库出现错误。(6)验证文库：利用picogreen和荧光分光光度计方法定量文库；并使用安捷伦(agilent)2100对pcr富集片段进行质量控制，验证dna文库的片段大小及分布。(7)均一化并混合文库：多样品dna文库(multiplexeddnalibraries)均一化至10nm后等体积混合。(8)上机测序：将混合好的文库(10nm)逐步稀释定量至4-5pm后进行上机测序。
第四步，菌群多样性组成谱分析流程如下：(1)利用illuminamiseq平台对dna片段进行双端(paired-end)测序，得到原始数据。(2)采用qiime2软件对原始数据进行质控(去引物、拼接、质量过滤、去重、去嵌合体、聚类等)。(3)out分类统计，菌群结构(门、纲、目、科、属的细菌群落结构)和丰度分析。
第五步，数据分析方法：(1)相关性分析：使用统计学软件graphpadprism8.2.1中的spearman检验来分析肉品质性状相关指标和肠道菌群中属水平菌群相对丰度的相关性。(2)差异分析：使用统计学软件graphpadprism8.2.1中的t检验来分析大体重组肉牛与小体重组肉牛肉品质性状差异与菌群差异，所测数据用平均值±标准误(mean±se)表示。
结论与分析：(1)肉品质性状差异：试验结果表明大体重组肉牛与小体重组肉牛之间体重、眼肌面积、嫩度、水分、灰分均无差异(p＞0.05)；大体重组肉牛背膘厚度极显著小于小体重组肉牛(p＜0.01)；大体重组肉牛背最长肌肌内脂肪显著大于小体重组肉牛(p＜0.05)。(2)与肉品质性状相关的肠道菌群筛选：试验结果表明肉牛肠道菌群中共有13个菌属与肉牛6个肉品质相关指标相关，其中嫩度与bifidobacterium菌属呈负相关；水分与cf231菌属呈负相关；灰分与lactobacillus菌属呈负相关；眼肌面积与lactobacillus菌属呈负相关，与treponema菌属呈正相关；肌内脂肪与5-7n15菌属、rc4-4菌属、phascolarctobacterium菌属呈负相关，与turicibacter菌属呈正相关；背膘厚度与parabacteroides菌属、prevotella菌属呈正相关，与bacillus菌属、turicibacter菌属、smb53菌属、epulopiscium菌属呈负相关。(3)菌群差异分析：试验结果表明大体重组肉牛与肠道菌群相关的肠道菌群prevotella菌属相对丰度显著小于小体重组肉牛(p＜0.05)；大体重组肉牛肠道菌群phascolarctobacterium菌属相对丰度极显著小于小体重组肉牛(p＜0.01)；其余菌属无显著差异。结果表明，prevotella菌属与phascolarctobacterium菌属是肉牛肉品质相关肠道菌群生物标志物，其在肉牛肠道菌群中的相对丰度可作为评价肉牛肉品质性状的指标。
表一是肉品质性状指标差异列表。
表一
表二是本发明肠道菌群与肉品质指标相关列表。
表二
表三是肉品质相关菌群差异列表。
表三
实施例2：选择相同饲养条件下的24月龄左右健康肉牛共10头，从中挑选体重最大和最小各3头，共6头牛测定肉品质性状相关指标，并采集粪便放置液氮保存与运输。基于肠道菌群与肉品质性状相关性辅助肉牛选育的方法，包括下述步骤：第一步，肉牛指标测定：(1)胴体性状测定：对肉牛进行空腹称重，活体测定肉牛背膘厚度、眼肌面积。测定结束后进行屠宰取样，采集肉牛背最长肌。(2)肉品质性状测定：将肌肉样品分别测定嫩度、肌内脂肪、水分和灰分。
第二步，肠道菌群dna提取：采用mobio/qiagen公司的dneasypowersoilkit进行抽提，并对抽提的dna进行检测。采用荧光分光光度计(quantifluor-stfluorometer，promega，e6090；quant-itpicogreendsdnaassaykit，invitrogen，p7589)，在260nm和280nm处分别测定dna的吸光值，检测dna的浓度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测dna的质量。调整dna溶液浓度，dna工作液保存于4℃，储存液保存于-20℃。
第三步，pcr扩增：首先对16srrna基因可变区进行扩增：(1)针对样本dna特定区域进行pcr预试验；(2)大批量pcr扩增(pyrobestdnapolymerase，takara，dr500a)；然后进行胶回收纯化：针对目标条带进行割胶回收，得到纯化的样本(axyprepdnagelextractionkit，axygen，ap-gx-500)；然后进行各样本定量：利用biotek酶标仪对各个样品定量(biotekflx800酶标仪；quant-itpicogreendsdnaassaykit，invitrogen，p7589)；最后采用标准的illuminatruseqdna文库制备实验流程(illuminatruseqdnasamplepreparationguide)构建所需的上机文库。建库测序流程实验主要流程如下：(1)dna双末端修复：利用endrepairmix中3’-5’核酸外切酶和聚合酶的共同作用，修复带有突出末端的dna片段。(2)3’端引入“a”碱基：在修复平整的dna片段3’端引入单碱基“a”。而在接头的3’末端含有单碱基“t”，从而保证dna片断和接头能够通过“a”“t”互补配对连接，并防止接头连接dna片段的过程中，dna插入片断彼此相连。(3)接头连接：在连接酶的作用下，孵育含有标签的接头与dna片段，使其相连。(4)纯化连接产物：凝胶纯化连接产物，去除游离的及发生自连的接头序列，同时选择大小合适的dna片段进行纯化，用于后续的簇生成反应。(5)富集dna片段：利用pcr选择性地富集两端连有接头的dna片段，同时扩增dna文库。pcr应尽量使用较少的循环数，避免pcr扩增中文库出现错误。(6)验证文库：利用picogreen和荧光分光光度计方法定量文库；并使用安捷伦(agilent)2100对pcr富集片段进行质量控制，验证dna文库的片段大小及分布。(7)均一化并混合文库：多样品dna文库(multiplexeddnalibraries)均一化至10nm后等体积混合。(8)上机测序：将混合好的文库(10nm)逐步稀释定量至4-5pm后进行上机测序。
第四步，菌群多样性组成谱分析流程如下：(1)利用illuminamiseq平台对dna片段进行双端(paired-end)测序，得到原始数据。(2)采用qiime2软件对原始数据进行质控(去引物、拼接、质量过滤、去重、去嵌合体、聚类等)。(3)out分类统计，菌群结构(门、纲、目、科、属的细菌群落结构)和丰度分析。
第五步，数据分析方法：使用统计学软件graphpadprism8.2.1中的t检验来分析大体重组肉牛与小体重组肉牛肉品质性状差异与菌群差异。
结论与分析：(1)肉品质性状差异：试验结果表明大体重组肉牛与小体重组肉牛之间眼肌面积、肌内脂肪、嫩度、灰分均无差异(p＞0.05)；大体重组肉牛体重显著大于小体重组肉牛(p＜0.05)；大体重组肉牛背膘厚度显著小于小体重组肉牛(p＜0.05)；大体重组肉牛背最长肌水分显著大于小体重组肉牛(p＜0.05)。(2)肉品质相关肠道菌群生物标志物相对丰度差异分析：试验结果表明大体重组肉牛肠道菌群中phascolarctobacterium菌属相对丰度显著大于小体重组肉牛(p＜0.05)；大体重组肉牛肠道菌群中prevotella菌属相对丰度与小体重组肉牛无显著差异，但有差异趋势(p＜0.1)。结果表明，肉牛肠道菌群中prevotella菌属与phascolarctobacterium菌属相对丰度可作为评价肉牛肉品质性状的指标。
表四是肉品质性状指标差异列表。
表四
表五是肉品质相关肠道菌群生物标志物相对丰度差异
表五
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<110>新疆农业大学
<120>一种基于肠道菌群评价牛肉品质性状的方法
<160>2
<170>patentinversion3.5
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<213>人工序列
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<212>dna
<213>人工序列
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ggactachvgggtwtctaat