天津拟甲小球藻及其培养方法与应用与流程

本发明属于微藻生物技术领域，尤其涉及第一个已知起源的绿藻-天津拟甲小球藻及其培养方法与应用。

背景技术：

绿藻是含叶绿素b的真核藻类，种类多，分布广，在生物技术领域具有独特的应用和开发价值。目前绿藻主要用于生产食品、保健品、色素、动物饲料和生物柴油，以及废气和废水的处理。

然而，现有绿藻都是从野外环境中分离采集的，其起源和形成过程未知，由此造成两个方面的问题：第一，绿藻的遗传背景不清楚，因此很难准确地确定其独特的代谢特性和潜在的优势，并以此有针对性地对其进行高效开发应用。第二，难以准确地分类和命名，造成生产过程中所用绿藻的名称混乱和错误，进而导致产品，特别是用藻粉加工的食品、保健品、动物饲料和饵料等成分和功能的异质性。

以小球藻为例，自1890年beijerinck发现第一个小球藻即普通小球藻(chlorellavulgaris)以来，有100多种小球藻被分离和命名。然而小球藻的分类和命名被频繁地修订并且仍在调整中。目前的分类体系中，小球藻只有15种。如此一来，我国、欧盟、美国和日本批准用以生产食品/功能性食品的三种小球藻chlorellavulgaris,chlorellapyrenoidosa(蛋白核小球藻)和chlorellaluteoviridis中，蛋白核小球藻属于无效名称被取消,而chlorellaluteoviridis则不是小球藻被删除^[1]。因此用这两种绿藻生产的小球藻产品名不符实。即使是普通小球藻，不同厂家使用的藻种由于来源不同也不完全相同，甚至由于分类错误而完全不同，产品质量和营养价值差异很大，无法达到统一的标准。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明首先提供了一种起源和形成过程已知的绿藻tdx16-de。tdx16-de是由与耐热拟甲色球藻(chroococcidiopsisthermalis)相似度最高的内共生蓝藻-拟甲色球藻tdx16在获得其宿主绿藻-雨生红球藻(haematococcuspluvialis)的dna后，通过将获得的dna与自身dna杂交并合成细胞器而形成的^[2]。tdx16-de的18srrna(seqidno.1)和its(seqidno.2)序列均与普通小球藻的相似度最高，但其细胞形态和超微结构与普通小球藻以及小球藻分支中的其它绿藻的不同，主要表现在：(1)细胞直径2.0-3.6μm，只有普通小球藻的1/2左右；(2)细胞没有内质网，高尔基体和过氧化物酶体；(3)细胞核有两套核被膜(4个单位膜)，细胞质膜有两层(2个单位膜)。因此tdx16-de是一种新的绿藻，分类命名为天津拟甲小球藻(chroococcidiorellatianjinensis)^[3]，属于绿藻门(chlorophyta)，共球藻纲(trebouxiophyceae)，小球藻目(chlorellales)，小球藻科(chlorellaceae)，小球藻分支(chlorella-clade)，拟甲小球藻属(chroococcidiorella)。保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccaf2020007^t，保藏日期为2020年8月6日。拟甲色球藻和雨生红球藻分别是具有独特生理特性的蓝藻和绿藻：拟甲色球藻能够在极端的环境中，如寒冷的南极岩石上和高温的温泉中生长，也是最耐干燥和脱水的蓝藻，因此被认为是能够移植火星的微生物^[4]；雨生红球藻能够大量合成最强的抗氧化剂-虾青素(一种类胡萝卜素)，并且也是虾青素含量最高的生物，因此广泛用于生产天然虾青素^[5]。

天津拟甲小球藻具有蓝藻-拟甲色球藻tdx16和绿藻-雨生红球藻的遗传背景，因此表现出二者的生理代谢特征：(1)能够在较宽的温度范围内生长(10-40℃)，尤其耐高温，生长速率快；(2)在适宜的生长条件下大量合成蛋白质和多糖；(3)在不利的生长条件下，大量合成脂类、虾青素和其它类胡萝卜素。

其次，本发明提供了天津拟甲小球藻的培养方法：将藻株接种于自养培养基中在光照条件下进行自养方式培养或在异养培养基中在无光条件下进行异养方式培养或接种于异养培养基中在光照条件下进行混合营养方式培养。

作为本发明藻株的培养方法之一，可以将天津拟甲小球藻接种于自养培养基中在光照条件下进行自养方式培养；优选地，所述自养方式培养的条件为：光照强度20-300μmolphotonsm^-2s^-1,ph5-9和温度10-40℃，培养过程中搅拌或向反应器中通入空气或含co2的工业废气；

所述自养培养基是不含有机碳源的合成培养基，优选bbm培养基等由无机盐构成的培养基；

更优选地，培养在光照强度20-260μmolphotonsm^-2s^-1的条件下进行。

自养方式培养使用的生物反应器为光生物反应器，即有光照的生物反应器，如管式、罐式、桶式、柱式和袋式光生物反应器，以及跑道池光生物反应器等。

作为本发明藻株的另外一种培养方法，可以将天津拟甲小球藻接种于异养培养基中在无光条件下进行异养方式培养；

优选地，所述异养方式培养的条件为：ph5-9和温度10-35℃，培养过程中向反应器中通入空气或含o2的气体；

所述异养培养基是添加了有机碳源的自养培养基，如添加了葡萄糖的bbm培养基；更优选地，所述培养在ph6-8的条件下进行。

作为本发明藻株的又一种培养方法，可以将天津拟甲小球藻接种于接种于异养培养基中在光照条件下进行混合营养方式培养。

优选地，所述混合营养方式培养在光照强度ph5-9，温度10-35℃，光照强度20-350μmolphotonsm^-2s^-1条件下进行。

本发明还提供了一种促进天津拟甲小球藻合成虾青素的培养方法。

所述方法包括如下步骤：

第一步，将天津拟甲小球藻以上述自养方式或异养方式或混合营养方式进行培养，使藻细胞快速增殖，提高生物量；

第二步，采收第一步培养的藻细胞并转至无氮培养基中进行培养，促进虾青素合成，提高虾青素产量。

优选地，第二步在ph6-8，温度10-35℃，光照强度60-300μmolphotonsm^-2s^-1，搅拌或通入空气的条件下进行培养，所述无氮培养基为不含无机氮和有机氮的培养基。

除此以外，本发明还提供了天津拟甲小球藻在以下方面的应用：

1)在生产食品、药品、保健品和化妆品方面的应用。天津拟甲小球藻能够大量合成蛋白质、脂类和类胡萝卜素。其蛋白质含有人体必须的氨基酸；其脂类组成中不饱和脂肪酸含量高；并且与雨生红球藻相似，其类胡萝卜素主要是虾青素、叶黄素和玉米黄质。由于不饱和脂肪酸能降低血脂有益于心脑血管健康，虾青素是最强的天然抗氧化剂能提高人体的免疫力；叶黄素和玉米黄质则有益于眼睛健康，保护视力，因此，天津拟甲小球藻可用于生产食品(新食品原料/新资源食品)、保健品、药品和化妆品。

2)在动物饲料和饵料方面的应用。天津拟甲小球藻易培养，产量高，富含蛋白质、多糖、脂类和类胡萝卜素等营养成分，因此可用做动物饵料和饲料。

优选地，用高含氮/磷废水培养天津拟甲小球藻，离心或沉降获得的细胞，即可作为动物饲料和饵料。

3)在生产类胡萝卜素、叶绿素、脂类、脂肪酸、蛋白质和多糖方面的应用。天津拟甲小球藻有雨生红球藻的遗传背景，能够大量合成虾青素，叶黄素和玉米黄质等类胡萝卜素，叶绿素以及不饱和脂肪酸含量高的脂类、蛋白质和多糖；并且天津拟甲小球藻比雨生红球藻容易培养，因此可用于生产天然虾青素、叶黄素和玉米黄质等类胡萝卜素，叶绿素以及脂类、脂肪酸、蛋白质和多糖。

4)在生产生物柴油方面的应用。天津拟甲小球藻能大量合成脂类，其脂类中的脂肪酸主要是c16-c18脂肪酸，而c16-c18脂肪酸是制备生物柴油的原料，可用于生产生物柴油。

5)在制备促进细胞增殖和生长活性物质、抑菌性物质和抗氧化性物质方面的应用。天津拟甲小球藻的提取物能够促进细胞分裂和生长并具有抑菌性和抗氧化性，因此可用于制备促进细胞增殖和生长的活性物质以及抑菌性物质和抗氧化性物质。

6)在废水废气处理方面的应用。天津拟甲小球藻tdx16-de能够在较宽的温度和ph范围内快速生长，生长过程中大量吸收co2、硝态氮、氨态氮和磷酸盐。因此可用于处理废气和废水，回收利用废气中的co2和废水中的硝态氮、氨态氮和磷酸盐。

7)在生产生物肥料方面的应用。天津拟甲小球藻tdx16-de的提取物和胞外产物够促进植物的生长，因此可用于生产生物肥料。

本发明的有益效果是：1、天津拟甲小球藻的起源和形成过程已知，遗传背景清楚，分类明确且稳定。2、用天津拟甲小球藻生产的产品的性质和功能具有唯一性，质量具有可追溯性。3、天津拟甲小球藻的唯一性和高效的培养技术使其在食品、药品、保健品、化妆品、色素、饲料/饵料、生物肥料、生物柴油和环保等方面的应用具有独特的竞争优势，从而提升我国微藻生物技术和产品的国际竞争力。

附图说明

图1是天津拟甲小球藻在光学显微镜下(物镜为油镜100×)的细胞形态照片。a中箭头显示3个细胞的孢子囊；b中箭头显示2个细胞的孢子囊，c:叶绿体。

图2是天津拟甲小球藻在透射电镜下的细胞结构照片。

图中，a显示细胞核有两套核被膜；b显示两层细胞质膜；c显示两组类囊体穿过淀粉核；液泡膜有两层单位膜；细胞壁的内侧是‘暗-明-暗’三层结构域，外被层由于细胞固定过程中渗透压的变化而脱落；d显示脂类在双层的细胞质膜上合成并形成脂滴；

其中：c：叶绿体；ce：双层细胞质膜；cw：细胞壁；edv：高电子密度膜泡；es：细胞基质外空间；fb：微纤丝；ies：核被摸间隙；ld：脂滴；m：线粒体；n：细胞核；ne：细胞核被膜；oe：细胞核外被膜；p：淀粉核；pg：质体小球；s：淀粉粒；sh：外被层；sp：淀粉片；td：三层结构域；v：液泡；c中大箭头头：2套类囊体；小箭头头：液泡的2层单位膜；标尺＝0.5μm。

图3是天津拟甲小球藻似亲孢子囊在透射电镜下的结构照片。

图中，a显示似亲孢子囊形成初期叶绿体分裂产生2个小叶绿体，细胞核去组装而消失；b显示似亲孢子囊顶端破裂释放似亲孢子；c显示一个似亲孢子囊中有3个成熟的似亲孢子，每个似亲孢子都有细胞核和叶绿体；d显示一个似亲孢子囊中有4个未成熟的似亲孢子，每个似亲孢子都有叶绿体，但只要一个似亲孢子有细胞核；

其中，au：似亲孢子囊；c：叶绿体；cw：细胞壁；ld：脂滴；m：线粒体；n：细胞核；v：液泡；b中箭头：孢子囊顶端破裂；标尺＝0.5μm。

具体实施方式

为了更清楚地阐述本发明，下面将对本发明进一步地举例描述，因此，以下实例用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明的绿藻tdx16-de是由与耐热拟甲色球藻(chroococcidiopsisthermalis)相似度最高的内共生蓝藻-拟甲色球藻tdx16在获得其宿主绿藻-雨生红球藻(haematococcuspluvialis)的dna后，通过将获得的dna与自身dna杂交并合成细胞器而形成的^[2]，分类命名为chroococcidiorellatianjinensis^[3](天津拟甲小球藻)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccaf2020007^t，保藏日期为2020年8月6日。科研工作者可以向保藏机构索取。

实施例1tdx16-de的形态和超微结构观察

1.tdx16-de细胞形态观察

将一接种环tdx16-de单藻落细胞接入装有100mlbbm培养基(nano3,250mg/l；mgso4.7h2o,75mg/l；nacl,25mg/l；k2hpo4,75mg/l；kh2po4,175mg/l；cacl2.2h2o,25mg/l；znso4.7h2o,8.82mg/l；mncl2.4h2o,1.44mg/l；moo3,0.71mg/l；cuso4.5h2o,1.57mg/l；co(no3)2.6h2o,0.49mg/l；feso4.7h2o,4.98mg/l；h3bo3,11.4mg/l；koh,31mg/l；edtana2,50mg/l)的200ml锥形瓶中，置于光照培养箱内培养，连续光照60μmolphotonsm^-2s^-1，25℃，培养6天后，取样用光学显微在油镜下(100×)观察细胞形态并拍摄细胞图片。如图1所示，tdx16-de呈绿色，圆形或椭圆形，直径2.0-3.6μm，具有1个贴壁的叶绿体。细胞通过产生似亲孢子增殖，每个似亲孢子囊产生2个(图1a)或3个(图1b)似亲孢子。

2.tdx16-de超微结构观察

用离心机离心培养液(3000rpm,10min)收集tdx16-de细胞，将藻细胞分散于2.5％的戊二醛(50mm磷酸缓冲溶液,ph7.2)中固定12小时，然后用1％四氧化锇溶液在室温下固定2小时。经乙醇梯度脱水后，用树脂(60℃)包埋藻细胞24小时。将包埋好的树脂用钻石刀切成60-80nm薄片，用3％的乙酸双氧铀和0.1％的柠檬酸铅染色后，再用透射电子显微镜观察细胞和似亲孢子囊的超微结构。

如图2所示，tdx16-de细胞内有1个由两套核被膜(4个单位膜)围绕的细胞核(图2a)，1个‘e’型有淀粉核的叶绿体，以及1-2个线粒体和双层膜液泡(2个单位膜)(图2c)，但没有内质网，高尔基体和过氧化物酶体。细胞质膜由2个单位膜构成(图2b,c)，脂滴在双层细胞质膜上组装(图2d)，说明双层细胞质膜具有内质网的功能-合成脂类物质。细胞壁内侧是稳定的‘暗-明-暗’三层结构域(与蓝藻和细菌的细胞壁相似)；外侧是不稳定的外被层，有时由于细胞固定过程中渗透压的变化而脱落(图2c)。

如图3所示，tdx16-de的似亲孢子囊在形态和结构上与tdx16^[2]和耐热拟甲色球藻^[6]的孢子囊相似，而与雨生红球藻的不动孢子囊^[2]差异很大。似亲孢子囊形成初期，叶绿体一分为二产生2个小叶绿体，细胞核去组装而消失(图3a)。在一个未成熟的似亲孢子囊中，4个似亲孢子都有叶绿体，但只有1个似亲孢子有细胞核(图3d)；而在一个成熟的似亲孢子囊中，3个似亲孢子都有叶绿体和细胞核(图3c)，这一结果表明似亲孢子的叶绿体是分裂形成的，而细胞核则是从头组装的。似亲孢子成熟后，似亲孢子囊顶端破裂，释放似亲孢子(图3b)。

实施例2tdx16-de的测序

(1)用ctab法提取tdx16-de的dna。

(2)用引物rp8(5’-acctggttgatcctgccagtag-3’)和rp9(5’-accttgttacgacttctccttcctc-3’)扩增dna后测序，tdx16-de的18srrna序列如seqidno.1所示。blast比对分析结果表明tdx16-de的18srrna(1687bp)与普通小球藻的相似度最高，达到99.8％(querycover75％)。

(3)用引物its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’)和its4(5-tcctccgcttattgatatgc-3’)扩增dna后测序，tdx16-de的its序列如seqidno.2所示。blast比对分析结果表明tdx16-de的its(761bp)与普通小球藻的相似度最高，达到100％(querycover99％)。

tdx16-de的18srrna和its序列均与普通小球藻的相似度最高，说明tdx16-de与普通小球藻最相似。然而tdx16-de与普通小球藻的细胞形态、超微结构和增殖过程中细胞核的形成方式差异显著或者不同，主要表现在6个方面：(1)tdx16-de的细胞直径为2.0-3.6μm，只有普通小球藻(5.0-7.0μm)的1/2左右；(2)tdx16-de没有内质网、高尔基体和过氧化物酶体,而普通小球藻则具有这三种细胞器；(3)tdx16-de的叶绿体呈‘e’型，而普通小球藻的叶绿体是杯状；(4)tdx16-de的细胞核有两套核被膜，而普通小球藻的细胞核只有一套核被膜；(5)tdx16-de的细胞质膜和液泡膜是双层膜，而普通小球藻的细胞质膜和液泡膜是单层膜；(6)tdx16-de增殖过程中似亲孢子的细胞核是从头合成，而普通小球藻似亲孢子的细胞核是分裂形成的。

上述实验结果表明：tdx16-de是一种与普通小球藻最相似但不同的新绿藻。

目前，对于未知起源藻类的分类主要是通过对其18srrna或its进行系统发育分析即推测其起源和进化关系来确定的。但是对于tdx16-de的分类来讲，系统发育分析没有必要，也不可行。这是因为(1)tdx16-de的起源和形成过程已知；(2)目前系统发育分析的基本假设是所有藻类(真核)都直接起源于其它藻类(真核)，而tdx16-de起源于蓝藻(亦称作蓝细菌，是原核光合生物而不是真核藻类)，即蓝藻tdx16获得了绿藻-雨生红球藻的dna后形成的，在一定程度上只是间接源于绿藻。因此，目前的系统发育分析不能推测tdx16-de的起源和形成过程(也不能推测藻类祖先的形成过程，因为藻类祖先不起源于藻类)。换言之，采用目前系统发育分析方法推测的tdx16-de起源和进化关系与事实不符。

由于tdx16-de具有小球藻的特征结构，即叶绿体中有一个被两组类囊体分开的淀粉核(图2c)，因此分类上属于小球藻分支。然而tdx16-de的其它细胞结构与小球藻分支中所有属的小球藻(包括普通小球藻)的结构不同，因此我们根据tdx16-de的起源建立了一个新属：拟甲小球藻属(chroococcidiorella)，根据tdx16-de形成过程被发现和研究的地点-天津，将其命名为天津拟甲小球藻(chroococcidiorellatianjinensis)，分类上属于绿藻门(chlorophyta)，共球藻纲(trebouxiophyceae)，小球藻目(chlorellales)，小球藻科(chlorellaceae)，小球藻分支(chlorella-clade)，拟甲小球藻属(chroococcidiorella)。

实施例3天津拟甲小球藻在不同温度条件下的生长

将一接种环的天津拟甲小球藻单藻落细胞接入装有100mlbbm培养基的200ml锥形瓶中，置于光照培养箱内在不同的温度下进行培养，连续光照60μmolphotonsm^-2s^-1，每天摇动两次，培养10天后，测定培养液的吸光度od680。实验结果表明，天津拟甲小球藻在10-40℃均可生长，在25-35℃生长最好。

实施例4天津拟甲小球在不同ph条件下的生长

将一接种环的天津拟甲小球藻单藻落细胞接入装有100ml不同phbbm培养基的250ml锥形瓶中，置于光照摇床内培养，光照80μmolphotonsm^-2s^-1，25℃，转速100rpm，培养6天后，测定培养液的吸光度od680。实验结果表明，天津拟甲小球藻在ph4-11的范围内均可生长，在ph6-8生长最好。

实施例5天津拟甲小球藻总脂和脂肪酸组成分析

将天津拟甲小球藻接种到装有bbm培养基的机械搅拌罐式光生物反应器中培养，装液系数0.75，接种比例10％，搅拌转速125rpm，并通入无菌空气，通气比0.5vvm,温度25℃，侧光照90μmolphotonsm^-2s^-1(1-5天)，200μmolphotonsm^-2s^-1(6-10天)。培养10天后离心采收藻细胞并冷冻干燥测定藻细胞的脂类含量和脂肪酸组成。分析结果表明，天津拟甲小球藻的脂类含量55.2％，其中c16-c18脂肪酸91.6％，不饱和脂肪酸72.1％。由于天津拟甲小球藻的脂类含量高，因此可用于生产脂类和脂肪酸，并且其脂肪酸主要是c16-c18脂肪酸，而c16-c18脂肪酸是制备生物柴油的原料，可用于生产生物柴油。

实施例6促进天津拟甲小球藻的虾青素合成

将10ml天津拟甲小球藻藻种接入装有100mlbbm培养基的250ml锥形瓶中置于光照摇床中培养，转速130rpm，光照强度60μmolphotonsm^-2s^-1，温度28℃。培养6天后离心采收细胞，并将细胞转接入5l装有无氮bbm培养基的气升式光生物反应器中进行虾青素的诱导合成，装料系数0.75，细胞的初始浓度2.0g/l，温度25℃，侧光照260μmolphotonsm^-2s^-1，无菌空气的通气比0.2vvm。培养6天后离心采收细胞并测定虾青素，藻细胞虾青素含量达到26.5mg/gdcw，即细胞干重的2.65％，仅次于雨生红球藻的虾青素含量^[5]。由于天津拟甲小球藻的虾青素含量高且易于培养，因此可用于生产天然虾青素。

实施例7用天津拟甲小球藻处理高含氮/磷废水

取2l某食品厂的高含氮/磷废水经沉淀和0.22μm滤膜过滤后，测定其总氮和总磷分别为136.2和6.8mg/l，然后平均分装到10只500ml锥形瓶中，并分别接入10ml天津拟甲小球藻，置于光照摇床内培养，转速130rpm，光照90μmolphotonsm^-2s^-1，28℃，培养6天后，离心收集细胞和上清液，测定上清液的总氮和总磷分别为12.1和0.5mg，因此总氮和总磷的去除率分别达到91.1％和92.6％。

实施例8天津拟甲小球藻的蛋白质含量分析

将实施例7中离心收集的用高含氮/磷废水培养的天津拟甲小球藻细胞真空冷冻干燥后，测定其蛋白质含量为52.2％，接近于鱼粉的蛋白质含量，因此可用于动物饲料或饵料。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，凡在本发明的精神与原则内所作的任何修改、替代、组合和简化，均属于等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

参考文献

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序列表

<110>河北工业大学

<120>天津拟甲小球藻及其培养方法与应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acctggttgatcctgccagtag22

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

accttgttacgacttctccttcctc25

<210>3

<211>1687

<212>dna

<213>天津拟甲小球藻(chroococcidiorellatianjinensis)

<400>3

cccgcacagaagacagcgaagggatgaacatgaggcagaggaagcgaggaggggagggga60

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<213>天津拟甲小球藻(chroococcidiorellatianjinensis)

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