一种用于造血干细胞体外培养的免疫隔离动态共培养生物反应器的制作方法

本发明涉及一种用于造血干细胞体外培养的免疫隔离动态共培养反应器，特别是指三维动态旋转和不同氧含量条件下应用于干细胞、饲养层细胞或细胞-支架构建物的共同培养和收获，属于生物医学工程技术领域。

背景技术：

目前，骨髓、脐带血、外周血来源的造血干细胞移植已成为白血病、再生障碍性贫血、免疫缺陷病等疾病的关键治疗方法。然而，这些组织中造血干细胞的数量都不可观。此外，免疫相容供体数量不足、移植物抗宿主病和移植后延迟重建等也是限制其临床应用的主要因素。造血干细胞的体外培养被认为是增加可移植干细胞数量的潜在可行性研究方向。

造血干细胞是成人造血系统的基础。人体内所有的血细胞皆起源于多能原始造血干细胞的发育、更新和分化。造血干细胞最重要的功能特质在于它们能够维持或重建机体造血体系，这些稀有的细胞具有自我更新和多向分化的双重能力。经过不对称分裂，保留一个具备原始干细胞活性的子代干细胞，另一个子代造血祖细胞则向下游分化，最终生成红细胞、单核/巨噬细胞、巨核细胞/血小板、免疫细胞、粒细胞等。这一功能特性既保证了干细胞池的相对稳定，又实现了足够数量的成熟血细胞的机体循环和功能表达。成体骨髓造血微环境是一个复杂的实体，不同细胞和非细胞参与者间的动态交流维持着造血系统的体内平衡。细胞-细胞、细胞-细胞外基质、细胞-细胞因子相互作用和局部微环境参数触发的信号传导机制以及物理信号(例如氧气张力、剪切应力、收缩力和温度)参与调控造血干细胞的休眠、更新、增殖分化和迁移。

一种有效扩大造血干细胞数量并离体调节其特性的策略是通过整合可溶性因子、基质细胞和生物材料并结合生物反应器创造的流体力学条件、氧张力和机械性能的空间变化，仿生构建造血微环境的复杂空间组织系统。三维动态仿生造血微环境不仅可以辅助细胞治疗，而且有助于阐明造血干细胞命运的调控机制。

此外，由于在生物反应器中的多个位置安装探针不切实际和繁琐，而基于流体动力学技术的商业化软件包ansysfluent(ansys，canonsburg，pa，usa)，可以用于生物反应器培养系统中流体流动及物质传递的模拟，实验方法无法测量到的区域，也能对其进行图视化分析。这便于我们找出一个适合培养种子细胞或者组织的最佳操作范围，节省成本和时间、加快实验进程。

技术实现要素：

本发明的目的旨在提供一种用于造血干细胞体外培养的免疫隔离动态共培养反应器，以解决现有技术中的不足。采用三维动态旋转、不同氧含量以及支持性细胞模拟造血微环境，实现造血干细胞和支持性细胞的共同培养和体外收获，以用于组织工程和再生医学领域。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于造血干细胞体外培养的免疫隔离动态共培养反应器，包括电机动力系统和位于培养箱内的旋转培养室。所述的旋转培养室包括外筒1、内筒2、曲面筛网4、左培养室5、右培养室6、造血干细胞加样口7、饲养层细胞加样口8、造血干细胞取样口9、饲养层细胞取样口10、不锈钢筛网11。

所述外筒1中部设有曲面筛网4，曲面筛网4边缘与外筒1内壁面贴合，将外筒1分为左培养室5和右培养室6。所述曲面筛网4为s型双侧曲面设计结构，且双侧曲面对称设计，其中，曲面筛网4可以通过机械加工获得其特殊构型。

所述的曲面筛网4上贴附有聚碳酸酯隔膜，由曲面筛网4支撑并固定隔膜形状。所述隔膜孔径为2μm，s型曲面隔膜可以实现并促进两侧物质扩散，又起到分隔不同细胞的作用，从而便于同时收获两种细胞，用于组织工程和再生医学领域。

所述的内筒2设于左培养室5内，内外筒同向旋转；内筒2左端为开口侧，右端为封闭侧3，内筒封闭侧3固定在曲面筛网4的中心处。

所述的左培养室5外周筒壁处开有造血干细胞加样口7、造血干细胞取样口9，右培养室6外周筒壁处开有饲养层细胞加样口8、饲养层细胞取样口10，其中，两个加样口位于同一侧，两个取样口位于同一侧。为防止细胞或材料外漏，在两个取样口、两个加样口处安装不锈钢筛网11。

所述的外筒1的左右两端各安装一个硅胶透气膜12(即左右培养室外侧各安装有硅胶透气膜)，细胞培养箱内的氧气通过硅胶透气膜渗透到旋转培养室；两个硅胶透气膜12上均设有一个直径为1mm的排气孔13。

工作时，旋转培养室位于细胞培养箱内，电机动力系统则位于细胞培养箱外，旋转培养室与电机动力系统之间通过带状电线连接，由电机动力系统控制旋转培养室轴向旋转，可连续或间歇操作。旋转培养室轴向旋转，阻力、离心力和净重力保持在一个平衡状态，为细胞提供了一个低剪切力且高传质速率的微重力环境。另外，反应器的两侧培养室可以提供不同的剪切力场，双筒侧(即左培养室5)可提供较低的剪切力供干细胞生长，单筒侧(即右培养室6)可提供较大的剪切力以促进饲养层细胞的生长和细胞因子分泌。将干细胞添加到左侧培养室，将生长在微载体表面的饲养层细胞(例如间充质干细胞)添加到右侧培养室，细胞在培养液中呈自由悬浮的状态。

进一步的，所述的外筒1为无毒、透明且耐高温的聚碳酸酯材料；内筒2和曲面筛网4采用医用不锈钢材料。

进一步的，所述的两个取样口、两个加样口的口径为2mm。

进一步的，所述培养箱是生物学细胞培养常规使用的，可以从市场上购买；所述培养箱内氧气含量为5％-10％，通过在培养箱内加入co2和n2来共同调控实现的(例如市面上销售的三气培养箱)。

进一步的，所述的细胞是造血干细胞及其支持性细胞(也成为了饲养层细胞)，该生物反应器不仅用于造血干细胞的培养，也可以实现其他类型干细胞、细胞-支架复合体等的培养，支持性细胞不仅包括间充质干细胞，也可以由成骨细胞、血管内皮细胞、支持性细胞-支架或微球复合培养物等替代。

进一步的，所述的旋转培养室的密封系统采用硅橡胶型0型环和轴承为动密封。旋转培养室可通过70％乙醇水溶液三次浸泡，无菌超纯水三次润洗后晾干备用。

进一步的，所述的电机动力系统可调控旋转培养室的转速范围(0-100rpm)。培养室通过电机控制水平旋转，阻力、离心力和净重力保持在一个平衡状态，为细胞提供了一个低剪切力且高传质速率的微重力环境。

此外，本发明借助商业化流体动力学软件fluent15.0，模拟计算了20rpm转速下，免疫隔离动态共培养生物反应器内部流体流动以及营养物质浓度分布情况，通过数值模拟检测了此免疫隔离共培养系统的可行性，20rpm转动状态形成的培养环境对于左右侧的细胞而言都是较为适宜的。这种非常接近人体微环境的培养体系适合工程化种子细胞或组织的大规模扩增。

本发明具有如下优点和有益效果：本发明结构简单，使用方便，能够为细胞或组织构建物提供了一个低剪切力且高传质速率的微重力环境，并为两种细胞同时创造不同的剪切力环境，实现干细胞和饲养层细胞的隔离共培养。多参数仿生人体骨髓造血微环境，有利于造血干细胞的体外扩增和原始干细胞活性的维持。这种非常接近人体微环境的培养体系适合工程化种子细胞或组织的大规模扩增。

附图说明

图1为本发明生物反应器总框图。

图2为本发明生物反应器的结构和功能示意图。

图3为本发明生物反应器左右侧培养室侧面硅胶透气膜安装示意图。

图4为本发明生物反应器设计结构的轴向剖面图。

图5为曲面筛网4的局部放大图。图a为正向剖面；图b为右侧向剖面。

图6为数值模拟本发明生物反应器内网格分布和20rpm转动状态下左侧培养室流场分析。图a为旋转培养室三维动态模型网格分布；图b为左侧培养室内剪切力分布；图c为左侧培养室内动压分布。

图7为本发明生物反应器右侧培养室流场分析。图a为右侧培养室内的剪切力分布；图b为右侧培养室内的动压分布。

图8为本发明生物反应器旋转培养室整体流场分析。图a为三维流场的动压分布；图b为两侧培养室纵横剖面和筛网表面的动压分布；图c为两侧培养室纵横剖面和筛网表面的切向速度分布。

图中：1外筒、2内筒、3内筒封闭侧、4曲面筛网、5左培养室、6右培养室、7造血干细胞加样口、8饲养层细胞加样口、9造血干细胞取样口、10饲养层细胞取样口、11不锈钢筛网、12透气膜、13进气孔。

具体实施方式

为使本发明的目的、使用方法及效果更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明做进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

一种用于造血干细胞体外培养的免疫隔离动态共培养生物反应器，如图1包括：旋转培养室和电机动力系统。

所述的旋转培养室包括外筒1、内筒2、曲面筛网4、左培养室5、右培养室6、造血干细胞加样口7、饲养层细胞加样口8、造血干细胞取样口9、饲养层细胞取样口10、不锈钢筛网11。

所述外筒1为无毒、透明且耐高温的聚碳酸酯材料，外筒1中部设有曲面筛网4，曲面筛网4边缘与外筒1内壁面贴合，将外筒1分为左培养室5和右培养室6。所述曲面筛网4为s型双侧曲面设计结构，且双侧曲面对称设计，其中，曲面筛网4可以通过机械加工获得其特殊构型。所述的曲面筛网4上设有聚碳酸酯隔膜，由曲面筛网4支撑并固定隔膜形状，隔膜孔径为2μm。所述的内筒2设于左培养室5内，内外筒同向旋转(图2)；内筒2设左端为开口侧，右端为封闭侧3，内筒封闭侧3固定在曲面筛网4的中心处。

所述的左培养室5外周筒壁处开有造血干细胞加样口7、造血干细胞取样口9，右培养室6外周筒壁处开有饲养层细胞加样口8、饲养层细胞取样口10，其中，两个加样口位于同一侧，两个取样口位于同一侧。为防止细胞或材料外漏，在两个取样口、两个加样口处安装不锈钢筛网11。所述的左右侧培养室外侧各安装硅胶透气膜，且硅胶透气膜12上均开一个直径为1mm的排气孔，培养箱内的氧气通过硅胶透气膜渗透到旋转培养室(图3)。

本发明所述培养箱内氧气含量(5％-10％)，是通过在培养箱内加入co2和n2来共同调控实现的(例如市面上销售的三气培养箱)。本发明所述培养室左侧为适应低剪切力的造血干细胞的培养室，在此培养室左侧为硅胶透气膜(出气)，右侧为隔离细胞且渗透细胞因子及其他营养物质的2μm孔径的s曲面聚碳酸酯隔膜；右侧为可适应较大剪切力的饲养层细胞培养室，在其右侧同样为硅胶透气膜(进气)。图4是旋转培养室的轴向剖面结构。

工作时，旋转培养室位于细胞培养箱内，电机动力系统则位于细胞培养箱外，通过带状电线实现旋转培养室和电机控制器间的连接，培养室轴向旋转，可连续或间歇操作，为细胞提供了一个低剪切力且高传质速率的微重力环境。培养箱内氧气含量为5％-10％，温度37℃。将干细胞添加到左侧培养室，将生长在微载体表面的饲养层细胞(例如间充质干细胞)添加到右侧培养室，细胞在培养液中呈自由悬浮的状态。另外，反应器的两侧培养室可以提供不同的剪切力场，双筒侧可提供较低的剪切力供干细胞生长，单筒侧可提供较大的剪切力以促进饲养层细胞的生长和细胞因子分泌。

本发明借助基于计算流体动力学原理而广泛应用于多方面流动问题模拟的fluent15.0软件。反应器尺寸设定为筒高100mm，外筒直径60mm，内筒直径20mm，左右侧培养室筒高各为50mm。利用四面体网格对生物反应器建立了网格划分模型，模拟计算了20rpm角速度转动状态下，免疫隔离动态共培养生物反应器内部流体流动以及营养物质浓度分布情况。20rpm转动状态形成的培养环境对于左右侧的细胞而言都是较为适宜的。如图6-8，展示了20rpm转速下生物反应器内的流场和细胞因子浓度分布情况。在20rpm转速下，两侧的三维流场均为典型的层流流动状态。采用四面体对反应器模型进行网格划分。计算时间步长1e-3s。在聚碳酸酯隔膜处的网格单元密度是培养室网格划分密度的2倍。隔膜传质速率：2.88×10^-3kg/(m³.s)，培养基质密度：1×10³kg/m³采用二阶迎风离散格式，层流模型。

当内外筒以相同角速度转动时，fluent三维动态模拟结果显示，其内部流场因避免了与湍流相关的剪切力可实现可控的剪应力场，此时流场层流速度梯度为最小，剪切力可最小化(图6b)，且此时左侧培养室的动压值也极低(图6c)，在持续培养的过程中可形成稳定的环流状态，故非常适合作为cd34⁺细胞这类对剪切力非常敏感的干细胞的培养室。

反应器右侧为只有外筒单独存在的培养室，因此当反应器以一定角速度转动时，培养室内部将会产生相对较大的流体剪切力(图7a)，且会对所培养的成骨细胞产生较大的周期性应力刺激(图7b)，这将有利于成骨细胞加速分泌支持和调控造血细胞的生长因子。

为了实现目的干细胞在培养及收获过程中的免疫隔离，在中间设置了一个带有双侧曲面设计的固定于不锈钢筛网内的聚碳酸酯隔膜。在此隔膜组件中，不锈钢筛网起支撑的作用，聚碳酸酯隔膜起到连通两侧培养室的作用；模拟结果显示，双侧曲面的存在，可使得具有不同内部结构的两侧培养室内产生动压差(图8a-b)，从而在旋转状态下产生隔膜两侧部分流体流动和交换(图8c)以实现细胞因子的质量传递；作用适量时间后，可形成较大的环流，从而实现在无外加灌注回路(无外加回路可有效降低染菌风险)的前提下，通过反应器本身的轴向旋转而实现两侧培养室的液体交换，从而实现基质细胞所分泌的造血因子在整个反应器内的均衡分布。

以上所述实施例仅表达本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。