本发明涉及酶催化技术领域，具体涉及一种胞磷胆碱钠的合成方法。
背景技术：
胞磷胆碱钠又称胞二磷胆碱钠，是一种脑代谢激活剂，其为核苷衍生物，是磷酯酰胆碱的前体物质，也是卵磷脂合成所必需的辅酶。研究表明，胞磷胆碱钠具有修复脑损伤，抗缺氧，改善记忆，增强智力的作用，临床应用较广。
因此，胞磷胆碱钠的制备方法是研究人员比较关心的研究课题。
现有技术中，制备胞磷胆碱钠的方法包括：
①化学合成法：利用cmp(5'-胞苷酸)和磷酸胆碱作为反应物，对甲苯磺酰氯为缩合剂，在n-二甲基甲酰胺(dmf)存在下缩合成胞磷胆碱钠，然而，化学合成存在反应转化率低，副产物多，生产成本高，环境污染严重等问题。
②微生物发酵法：用酵母菌或产氨短杆菌等微生物利用葡萄糖，并添加cmp、cp等前提物发酵生成胞磷胆碱钠，但是微生物发酵法存在产物浓度低，产率不稳定等问题。
③酶促合成法：抽提细胞液用胞苷三磷酸(ctp)和磷酸胆碱生物合成胞磷胆碱钠，但是，现有的酶和细胞液合成需要使用底物ctp，从而造成合成成本较高。
因此，亟需提供一种适于大规模工业化生产的胞磷胆碱钠的制备方法，以解决酶来源受限制和合成成本过高的技术问题。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的种种技术缺陷，本发明旨在提供胞磷胆碱钠的新制备方法，其以大肠杆菌表达的游离酶为生物催化剂，以5'-胞苷酸、磷酸胆碱、atp为反应原料进行生物转化，成功制得了目标产物；同时，本发明提供的技术方案还解决了酶来源受限制和合成成本过高的技术问题。
同时，本发明提供了一条新的胞磷胆碱钠的合成路线，如下所示：
具体地，一种胞磷胆碱钠的合成方法，其包括以下步骤：
向反应容器中加入5'-胞苷酸，氯化磷酸胆碱钙盐，atp，氯化镁水溶液，tris-hcl缓冲液，混合均匀；接着，调节ph值至6.0～8.0，并加入cmp磷酸激酶、核苷二磷酸激酶和磷酸胆碱-胞苷酰转移酶，在25～50℃下搅拌反应4～10小时，高速离心后，取上清液，即得所述胞磷胆碱钠；
其中，所述cmp磷酸激酶的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述核苷二磷酸激酶的氨基酸序列如seqidno.2所示，所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的氨基酸序列如seqidno.3所示；详见下表1：
表1氨基酸序列表
优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法中，在反应体系中，所述cmp磷酸激酶、所述核苷二磷酸激酶和所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的浓度分别为1～50g/l。
优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法中，在反应体系中，所述5'-胞苷酸的浓度为5～150mmol/l。
优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法中，在反应体系中，所述氯化磷酸胆碱钙盐的浓度为15～200mmol/l。
优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法中，在反应体系中，所述atp的浓度为6～200mmol/l。
应当说明的是，上述优选实施方式中各物质的浓度，例如，5'-胞苷酸的浓度、氯化磷酸胆碱钙盐的浓度、atp的浓度等均是相对于催化体系总体积(例如反应罐的有效容积)而言的，换言之，上述浓度描述的是它们分别相对于催化体系总体积的浓度。
优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法中，所述cmp磷酸激酶、所述核苷二磷酸激酶和所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的制备方法分别包括：
s1：将所述cmp磷酸激酶或所述核苷二磷酸激酶或所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶对应的基因克隆到pacyc-duet1载体上，并转化到bl21(de3)大肠杆菌的宿主细胞内；
s2：将克隆得到的酶的工程菌的种子接种到培养体系中，培养18-24小时，培养结束后离心收集菌体；
其中，3种不同的工程菌的种子液加入的体积为培养基的体积的5％-10％；
s3：取上述菌体悬浮在50mmtris-hcl缓冲液中，破碎后，获得破碎液，将上述破碎液进行高速离心，即得到3种不同酶的酶液上清；其中，采用超声破碎仪或匀浆仪实施破碎。
进一步优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法的步骤s3中，所述tris-hcl缓冲液的ph值为7.5。
进一步优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法的步骤s3中，所述菌体质量与所述tris-hcl缓冲液的悬浮比例为1:10～1:20g/ml。并且，值得说明的是，此处所述菌体质量指的是湿菌体质量。
综上所述，本发明所提供的技术方案与现有技术相比至少具备以下有益效果：
采用分子克隆cmp磷酸激酶、核苷二磷酸激酶、磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的大肠杆菌工程菌制备3种不同的酶，酶源稳定，从而避免目前国内普遍采用的啤酒酵母的反应体系所带来的车间环境污染及大量废酵母渣需处理的缺点；采用cmp作为合成原料之一相比现有技术所用ctp作为合成原料之一具有明显的成本优势。
总之，与传统的胞磷胆碱钠合成工艺相比，本发明提供的合成路线对环境友好，产率稳定，有利于节省能耗和保护环境，因此适用于大规模工业化生产。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
根据优选实施例所述的胞磷胆碱钠的合成方法，主要包括以下步骤：利用分子克隆cmp磷酸激酶、核苷二磷酸激酶、磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的大肠杆菌工程菌并制备以上的3种酶，并提供3种酶的酶液上清；以氯化磷酸胆碱钙盐、atp、cmp为原料，由以上三种酶共同催化生成胞磷胆碱钠，其中，所使用的cmp磷酸激酶的氨基酸序列如seqidno.1所示，所使用的核苷二磷酸激酶的氨基酸序列如seqidno.2所示，所使用的磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的氨基酸序列如seqidno.3所示。
在一个优选实施例中，所述胞磷胆碱钠的合成方法包括以下步骤：
向反应容器中加入5'-胞苷酸，氯化磷酸胆碱钙盐，atp，氯化镁水溶液，tris-hcl缓冲液，混合均匀；接着，调节ph值至6.0～8.0，并加入cmp磷酸激酶、核苷二磷酸激酶和磷酸胆碱-胞苷酰转移酶，在25～50℃下搅拌反应4～10小时，高速离心后，取上清液，即得所述胞磷胆碱钠；
其中，所述cmp磷酸激酶的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述核苷二磷酸激酶的氨基酸序列如seqidno.2所示，所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的氨基酸序列如seqidno.3所示；
其中，所述cmp磷酸激酶、所述核苷二磷酸激酶和所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的制备方法分别包括：
s1：将所述cmp磷酸激酶或所述核苷二磷酸激酶或所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶对应的基因克隆到pacyc-duet1载体上，并转化到bl21(de3)大肠杆菌的宿主细胞内；
s2：将克隆得到的酶的工程菌的种子接种到培养体系中，培养18-24小时，培养结束后离心收集菌体；
s3：取上述菌体悬浮在50mmtris-hcl缓冲液中，破碎后，获得破碎液，将上述破碎液进行高速离心，即得到酶液上清。
在一个进一步优选的实施例中，在反应体系中，所述cmp磷酸激酶、所述核苷二磷酸激酶和所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的浓度分别为1～50g/l。
在一个进一步优选的实施例中，在反应体系中，所述5'-胞苷酸的浓度为5～150mmol/l。
在一个进一步优选的实施例中，在反应体系中，所述氯化磷酸胆碱钙盐的浓度为15～200mmol/l。
在一个进一步优选的实施例中，在反应体系中，所述atp的浓度为6～200mmol/l。
在一个更进一步优选的实施例中，在步骤s3中，所述tris-hcl缓冲液的ph值为7.5。
在一个更进一步优选的实施例中，在步骤s3中，所述菌体质量与所述tris-hcl缓冲液的悬浮比例为1:10～1:20g/ml。
实施例
依次按照以下具体步骤制备胞磷胆碱钠：
i分别构建3类菌种：
通过基因检索的方式找到3个针对特定底物有活性的基因(这3类酶的基因)，通过基因公司合成对应的碱基序列并且克隆到pacyc-duet-1载体上。我们将收到的质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)(实验室保藏宿主)，在氯霉素(cam+)-lb的平板上筛选取阳性菌落。
以单菌落为模板用引物1和引物2进行pcr扩增，扩增条件包括：起始变性95℃5min，然后执行如下的反应条件：95℃30s，55℃30s，72℃90s，30个循环，最后72℃延伸3min，得到与预期大小相符pcr产物；pcr产物测序由上海生工技术有限公司进行。测序结果表明获得的基因序列与设计的完全一致。其中，引物1碱基序列(seqidno.4)：5‘-accgcgaaaggttttgcgccat-3’，引物2碱基序列(seqidno.5)：5‘-cagggtcgttaaatagccgc-3’。
ii3种工程菌培养：
从上一步氯霉素(cam+)-lb平板上筛选得到的单菌落接种到5ml含有30ug/ml的氯霉素(cam+)的lb液体培养基中，37℃培养14小时，然后按1：100转接到lb培养基中，37℃培养2-3小时，加入诱导物异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度1mm，37℃诱导16小时。离心收集菌体。
iii制备3种不同酶的酶液上清：
称取步骤2中的3种菌体各2g，使用悬50mmtris-hcl缓冲液释至100g/l，置于冰水浴中，使用超声细胞破碎仪，设置超声波功率30％，工作4秒停6秒，循环30min，得到20ml破菌液。将其于4℃、8000rpm离心10min，收集离心上清液；即分别制得cmp磷酸激酶酶液上清、核苷二磷酸激酶酶液上清和磷酸胆碱-胞苷酰转移酶酶液上清。
iv胞磷胆碱钠的合成：
在5ml反应体系中实施酶催化合成，反应液含有：20mm5'-胞苷酸(cmp)，25mm氯化磷酸胆碱钙盐，45mmatp，10mm氯化镁，100mmtris-hcl缓冲液，ph值调节至7.5；加入步骤iii中的cmp磷酸激酶酶液上清3g/l(加入后相对反应体系总体积的浓度，下同)，核苷二磷酸激酶酶液上清3g/l，磷酸胆碱-胞苷酰转移酶酶液上清10g/l，30℃反应24小时。以cmp和氯化磷酸胆碱钙盐计算收率分别为93.2％和75.8％。
v反应样品分析方法：
分析设备：hplc，液相分析柱:lp-c18，流动相：0.6％磷酸(使用二乙胺调节ph至6.60)，流速：1.5ml/min，柱温：30℃，波长：272nm，各物质的出峰时间：cmp-5.1min，cdp-7.8min，ctp-12.6min，ctp-c(胞磷胆碱钠)-4.5min。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
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