本发明属于油脂加工技术领域，具体涉及一种酶法制备甘油二酯的方法。
背景技术：
甘油二酯(diacylglycerol,dag)是油脂中的天然成分，在大部分动植物油脂中含量都较低(<10％)。dag属于公认安全的物质(gras,generallyrecognizedassafe)，食用安全，且口感、色泽、风味与甘油三酯(triacylglycerol,tag)相近；但与tag相比，其具有不同的代谢途径，不会在体内重新酯化生成tag，而是经过β氧化为机体代谢提供能量，因而dag可有效防止脂肪在体内的蓄积，具有减肥等功效。目前，许多关于dag生理功能的研究已表明，dag还具有降低餐后血脂、预防心脑血管疾病、改善糖尿病人血脂与血糖水平等功能。此外，dag可广泛应用于食品、医药及化妆品等领域。因此，关于dag的制备研究目前受到了广泛关注。
酶法具有反应条件温和、催化特异性高及环保等优点近年来被广泛应用于dag的制备，其中酶法水解、甘油解和酯化是制备dag的常用方法。水解法具有高效、低能耗、低成本等优点，但dag的产率较低，且产物中含有大量脂肪酸和甘油单酯(monoacylglycerols,mag)，采用分子蒸馏分离纯化时所需温度(>170℃)较高。如在水解法制备dag的工艺研究中，在优化的反应条件下(油：水＝9:1，脂肪酶添加量3.5％，反应温度45℃，以250rpm的转速进行磁力搅拌并反应3h)，反应产物中dag的含量为32.82％；经分子蒸馏纯化(一级分子蒸馏蒸发面温度180℃，二级分子蒸馏蒸发面温度270℃)后，得到dag含量为90.12％的产物(卢梦青，浙江大学，2018)。和水解法相比，甘油解法的dag产率高，但产物中含大量mag，分离难度较大，采用分子蒸馏分离纯化时所需温度(>170℃)较高。如在酶法甘油解猪油制备dag的研究中，在优化的反应条件下(底物摩尔比1:1，磁力搅拌速度500pm，65℃孵育2h后转至45℃孵育8h)，反应产物中dag含量达61.76％；经分子蒸馏纯化(一级分子蒸馏蒸发面温度185℃，二级分子蒸馏蒸发面温度255℃)后，得到dag含量为82.03％的产物(koreanj.foodsci.an.,2017,37(6):813～822)。酯化法具有dag产率高的优点，但原料脂肪酸需要提前制备，且产物中往往含tag、mag等副产物。如使用脂肪酶lipozymermim，采用填充床酶反应器连续酯化制备dag，在优化的反应条件下(底物摩尔比1:1，反应温度60℃，进料流速1.5ml/min)，反应产物中dag含量达60.9％；经分子蒸馏分离纯化(一级分子蒸馏蒸发面温度150℃，二级分子蒸馏蒸发面温度180℃)后，得到dag含量为92.2％的产物(中国油脂，2009，34(03)：15～19)。综上可知，目前酶法水解、甘油解和酯化法制备dag时，由于反应产物中含有较多的mag和脂肪酸等副产物，分子蒸馏纯化时所需温度较高，增加了脂类风险因子如缩水甘油酯、氯丙醇酯及反式脂肪酸等产生的风险。
技术实现要素：
为了解决上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种酶法制备甘油二酯的方法，所需分子蒸馏纯化的温度较低，避免了脂类风险因子的产生，大大提高了产品品质；同时降低了生产维护成本，具有良好的经济效益和工业应用前景。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种酶法制备甘油二酯的方法，包括以下步骤：
步骤1：在过量无水乙醇存在的条件下采用固定化脂肪酶催化油脂进行醇解反应，反应结束后回收固定化脂肪酶和乙醇，得到反应中间产物；
步骤2：将步骤1得到的反应中间产物作为底物，加入无水乙醇后混合均匀，加入固定化甘油单酯脂肪酶后进行醇解反应；
步骤3：反应结束后回收固定化甘油单酯脂肪酶和乙醇，将产物在110～120℃下进行分子蒸馏，分离得到甘油二酯。
优选地，步骤1中，油脂为动物油脂、植物油脂、海洋动植物油脂或微生物发酵产生的油脂。
优选地，步骤1中，油脂与无水乙醇的摩尔比为1:40～100。
优选地，步骤1中，醇解反应的温度为25～40℃。
优选地，步骤1中，固定化脂肪酶为novozym435或lipozyme435，固定化脂肪酶添加量为底物总质量的3％～10％。
优选地，步骤1中，醇解反应的时间为15～120min。
优选地，步骤2中，固定化甘油单酯脂肪酶为固定化mglpii。
进一步优选地，固定化载体为ecr8285、immobead150、ecr8806或ecr1030；固定化条件为：酶载体比例30～120mg/g，固定化温度为20～35℃，转速为50～200rpm，时间为2～8h。
优选地，步骤2中，反应中间产物中甘油单酯与无水乙醇的摩尔比为1:1～3，加酶量为100～400u/g底物油，醇解反应的温度为30～50℃，醇解反应的时间为0.5～2h。
优选地，步骤3中，分子蒸馏的进料温度为65℃，进料流速为1.5～2.5ml/min，分离柱真空度为0.1～10pa。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开的酶法制备甘油二酯的方法，第一步采用固定化脂肪酶催化油脂醇解，然后采用固定化甘油单酯脂肪酶催化第一步反应的副产物(甘油单酯)醇解。两步醇解反应结束后，甘油单酯被彻底去除，反应副产物仅为脂肪酸乙酯。相比于副产物为甘油单酯和脂肪酸，副产物为脂肪酸乙酯进行分子蒸馏纯化时，所需纯化温度更低，不仅可降低能量消耗，而且可避免纯化过程中脂类风险因子的产生，提高产品品质；同时降低了设备的要求，节约了生产维护成本，具有良好的经济效益和工业应用前景。
进一步地，油脂和无水乙醇的底物摩尔比为1:40～100，可保证所用脂肪酶具有较强的sn-1,3位特异性，促进甘油二酯的生成，且可保证所用脂肪酶具有较好的操作稳定性。
进一步地，反应温度为25～40℃，可保证所用脂肪酶具有较好的操作稳定性。
进一步地，所用固定化脂肪酶为novozym435或lipozyme435，添加量为底物总质量的3～10％，可保证所用脂肪酶在过量乙醇存在情况下具有较强的sn-1,3位特异性和酶活性，且可保证反应的经济性。
进一步地，第一步醇解反应的时间为15～120min，可确保产物中甘油二酯具有较高的含量。
进一步地，固定化甘油单酯脂肪酶采用固定化mglpii，可确保甘油单酯快速转化生成脂肪酸乙酯。
更进一步地，固定化载体为ecr8285、immobead150、ecr8806或ecr1030，固定化条件为酶载体比例30～120mg/g，固定化温度为20～35℃，转速为50～200rpm，时间为2～8h，可确保所得固定化甘油单酯脂肪酶具有较高的活性和较好的操作稳定性。
进一步地，反应中间产物中甘油单酯与无水乙醇的摩尔比为1:1～3，加酶量为100～400u/g底物油，反应温度为30～50℃，反应时间为0.5～2h，可确保甘油单酯快速转化生成脂肪酸乙酯，且可保证固定化mglpii具有较好的操作稳定性。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。如非写明，所有百分比均为质量百分比。
实施例1
称取100g大豆油和无水乙醇的混合物置于500ml圆底烧瓶中(大豆油与无水乙醇的摩尔比为1:60)，搅拌使之混合均匀，加热至25℃后连接回流装置。再向其中加3gnovozym435，待反应120min后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇。以上述反应产物为底物，加入无水乙醇(甘油单酯与无水乙醇的摩尔比为1:1.5)，搅拌使之混合均匀，加热至30℃后连接回流装置；再向其中加入400u/g固定化mglpii，待反应0.5h后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇。最后用分子蒸馏(蒸发面温度为120℃)分离纯化得到dag，经测定产物中dag的含量为58.63％，未检测到脂肪酸乙酯及缩水甘油酯、氯丙醇酯和反式脂肪酸等脂类风险因子的存在。
实施例2
称取100g大豆油和无水乙醇的混合物置于500ml圆底烧瓶中(大豆油与无水乙醇的摩尔比为1:40)，搅拌使之混合均匀，加热至30℃后连接回流装置。再向其中加6glipozyme435，待反应60min后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇。以上述反应产物为底物，加入无水乙醇(甘油单酯与无水乙醇的摩尔比为1:1)，搅拌使之混合均匀，加热至40℃后连接回流装置；再向其中加入100u/g固定化mglpii，待反应2h后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇。最后用分子蒸馏(蒸发面温度为110℃)分离纯化得到dag，经测定产物中dag的含量为51.24％，未检测到脂肪酸乙酯及缩水甘油酯、氯丙醇酯和反式脂肪酸等脂类风险因子的存在。
实施例3
称取100g海藻油和无水乙醇的混合物置于500ml圆底烧瓶中(大豆油与无水乙醇的摩尔比为1:100)，搅拌使之混合均匀，加热至40℃后连接回流装置。再向其中加10gnovozym435，待反应15min后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇。以上述反应产物为底物，加入无水乙醇(甘油单酯与无水乙醇的摩尔比为1:3)，搅拌使之混合均匀，加热至50℃后连接回流装置；再向其中加入200u/g固定化mglpii，待反应1h后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇。最后用分子蒸馏(蒸发面温度为120℃)分离纯化得到dag，经测定产物中dag的含量为54.39％，未检测到脂肪酸乙酯及缩水甘油酯、氯丙醇酯和反式脂肪酸等脂类风险因子的存在。
实施例4
称取100g海藻油和无水乙醇的混合物置于500ml圆底烧瓶中(大豆油与无水乙醇的摩尔比为1:80)，搅拌使之混合均匀，加热至35℃后连接回流装置。再向其中加8glipozyme435，待反应40min后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇。以上述反应产物为底物，加入无水乙醇(甘油单酯与无水乙醇的摩尔比为1:2)，搅拌使之混合均匀，加热至35℃后连接回流装置；再向其中加入300u/g固定化mglpii，待反应50min后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇。最后用分子蒸馏(蒸发面温度为120℃)分离纯化得到dag，经测定产物中dag的含量为60.13％，未检测到脂肪酸乙酯及缩水甘油酯、氯丙醇酯和反式脂肪酸等脂类风险因子的存在。
实施例5
称取100g大豆油和无水乙醇的混合物置于500ml圆底烧瓶中(大豆油与无水乙醇的摩尔比为1:60)，搅拌使之混合均匀，加热至30℃后连接回流装置。再向其中加5gnovozym435，待反应60min后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇。以上述反应产物为底物，加入无水乙醇(甘油单酯与无水乙醇的摩尔比为1:1.5)，搅拌使之混合均匀，加热至40℃后连接回流装置；再向其中加入300u/g固定化mglpii，待反应40min后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇。最后用分子蒸馏(蒸发面温度为110℃)分离纯化得到dag，经测定产物中dag的含量为58.96％，未检测到脂肪酸乙酯及缩水甘油酯、氯丙醇酯和反式脂肪酸等脂类风险因子的存在。
对比例1
称取100g大豆油和无水乙醇的混合物置于500ml圆底烧瓶中(大豆油与无水乙醇的摩尔比为1:60)，搅拌使之混合均匀，加热至25℃后连接回流装置。再向其中加3gnovozym435，待反应120min后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇。随后用分子蒸馏(蒸发面温度为180℃)分离纯化得到dag，经测定产物中dag的含量为57.65％，产物中缩水甘油酯含量为0.34ppm，氯丙醇酯含量为0.21ppm，未检测到反式脂肪酸。与实施例1相比，本对比例仅采用一步醇解，分子蒸馏纯化时的蒸发面温度高达180℃，远高于实施例1的120℃，且产物中检测到缩水甘油酯和氯丙醇酯的存在。
对比例2
称取100g海藻油和无水乙醇的混合物置于500ml圆底烧瓶中(大豆油与无水乙醇的摩尔比为1:80)，搅拌使之混合均匀，加热至35℃后连接回流装置。再向其中加8glipozyme435，待反应40min后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇。随后用分子蒸馏(蒸发面温度为180℃)分离纯化得到dag，经测定产物中dag的含量为58.89％，产物中缩水甘油酯含量为0.33ppm，氯丙醇酯含量为0.23ppm，未检测到反式脂肪酸。与实施例4相比，本对比例仅采用一步醇解，分子蒸馏纯化时的蒸发面温度高达180℃，远高于实施例4的120℃，且产物中检测到缩水甘油酯和氯丙醇酯的存在。