一种基于DNA条形码鉴定落羽杉属种质资源无性系的方法与流程

本发明属于植物无性系鉴定领域，更具体地说，涉及一种基于dna条形码鉴定落羽杉属种质资源无性系的方法。

背景技术：

落羽杉属(taxodiumrich.)树种原产美洲和墨西哥，包括三个类群，落羽杉、墨西哥落羽杉(简称墨杉)和池杉，然而将这三个类群分为一个种、两个种还是三个种在分类学上一直争议不断。当观察到极端的形态时，可以很容易地识别出这三个类群的个体。其中，落羽杉的小叶为线形，也呈螺旋状排列，但基部扭转成两列，小枝通常下垂，淡绿色，树皮较薄。墨杉叶片也是线形，偏平，深绿色，侧生短枝螺旋状散生，不为2列。而池杉以锥状到鳞状的叶子为特征的，螺旋状排列在通常上升的落叶的嫩枝周围，树皮相对较厚。由于落羽杉、墨杉和池杉的天然地理分布范围有明显的重叠，导致存在大量的难以或甚至不可能积极识别的中间表型存在。落羽杉个体的上枝上可能有与池杉形态相似的叶和芽，而浓荫的池个体通常表现出与落羽杉相似的叶和芽形态。一些个体，甚至整个种群，可能表现出不同于极端形态的中间形态，叶的排列从螺旋状到假二叉状不等。正是这些中间体的存在和性质引起了关于落羽杉形态分类地位的争论。可见，只靠形态指标很难进行落羽杉属物种的鉴定。

我国开展落羽杉属树种的引种栽培工作已经有100多年，并从1960s开始进行落羽杉属树种的杂交、回交工作，优良子代无性系“中山杉”具有耐盐、耐水、抗风、抗病、速生、材优和树形优美等优势，已在我国长江流域、东南沿海及内陆地区的湖泊湿地、水网、滩涂和平原绿化造林中广泛应用，目前，已累计推广2000多万株，经济价值约20.8亿元，产生重大的经济和生态价值。“江苏省中国科学院植物研究所落羽杉属林木种质资源库”是2018年江苏省林业局发起的，由江苏省中国科学院植物研究所实施，该资源库是国内唯一的落羽杉无性系资源库，是落羽杉属种质资源收集、保存、研究和利用的主要平台。目前，对落羽杉属树种的鉴定工作主要是借助形态指标，然而，这种分类研究受到季节变化、栽培管理方式、环境因素和人为主观因素的影响。因此，有必要从dna分子水平上进一步开展关于落羽杉属种质资源无性系鉴定的相关研究，以提升落羽杉属种质创新效率。

分子标记技术在资源鉴定中的应用，可以弥补形态学鉴别的缺陷。目前，已有的分子标记方法有同工酶标记、aflp标记、srap标记、rapd标记及ssr微卫星标记等，新的分子标记技术也正处于研究与尝试中，主要原因是准确鉴别资源品种越来越重要。dna条形码技术(dnabarcoding)是利用基因组中一段标准的、相对较短的dna片段来代表物种，作为物种的条形码编码，从而进行物种识别的分子鉴定新技术。其概念原理与超市利用条形码扫描区分成千上万种不同的商品相同，流程为收录已知种名物种的选定标准基因建立条形码数据库，然后输入未知种名物种的基因数据进行检索，依据序列相速度来快速鉴定物种。与其他dna分子鉴定技术相比，dna条形码技术的重复性与准确率更高，并且所需要的引物数量及投入的人力、物力、时间显著减少。合适的标准dna片段的选择是dna条形码技术应用成功的关键。植物dna条形码筛选区域主要集中在叶绿体dna(choroplastdna，简称cpdna)和核核糖体dna(nucleusribosomaldna，简称nrdna)的内转录间隔区(internaltranscribedspacer，简称its)。目前，落羽杉属的dna条形码研究尚未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于dna条形码鉴定落羽杉属种质资源无性系的方法。本发明所要解决的另一技术问题在于提供用于鉴定落羽杉属种质资源无性系的dna条形码引物对。本发明所要解决的另一个技术问题在于提供用于鉴定落羽杉属种质资源无性系的35条落羽杉属种质资源无性系的dna条形码。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种基于dna条形码鉴定落羽杉属种质资源无性系的方法，步骤包括：

1)提取待测样品的叶绿体dna；

2)利用dna条形码引物对pcr扩增所提取的待测样品的叶绿体dna，所述的dna条形码引物对如下所示：

上游引物：5′-tcacagcccaggcacaa-3′，

下游引物：5′-ggtgcggctggattacct-3′；

3)对pcr扩增产物进行测序；

4)以步骤3)获得的测序结果与35条落羽杉属种质资源无性系的dna条形码构建系统进化树，序列与35种落羽杉属种质资源无性系中的一种聚在一起，且与该条序列碱基100％匹配，则待测样品属于该落羽杉属种质资源无性系。

进一步地，步骤4)中，所述的35条落羽杉属种质资源无性系的dna条形码，如下所示：

落羽杉l2的dna的条形码，如seqidno.3所示；

落羽杉l7的dna的条形码，如seqidno.4所示；

落羽杉l8的dna的条形码，如seqidno.5所示；

落羽杉lp2的dna的条形码，如seqidno.6所示；

落羽杉l12的dna的条形码，如seqidno.7所示；

落羽杉l13的dna的条形码，如seqidno.8所示；

落羽杉l14的dna的条形码，如seqidno.9所示；

落羽杉l17的dna的条形码，如seqidno.10所示；

落羽杉cl的dna的条形码，如seqidno.11所示；

池杉c1的dna的条形码，如seqidno.12所示；

池杉c5的dna的条形码，如seqidno.13所示；

池杉c6的dna的条形码，如seqidno.14所示；

池杉c7的dna的条形码，如seqidno.15所示；

池杉c8的dna的条形码，如seqidno.16所示；

池杉c9的dna的条形码，如seqidno.17所示；

池杉c10的dna的条形码，如seqidno.18所示；

池杉ct的dna的条形码，如seqidno.19所示；

池杉zm8的dna的条形码，如seqidno.20所示；

池杉zm10的dna的条形码，如seqidno.21所示；

墨西哥落羽杉dd的dna的条形码，如seqidno.22所示；

墨西哥落羽杉a2的dna的条形码，如seqidno.23所示；

墨西哥落羽杉a3的dna的条形码，如seqidno.24所示；

墨西哥落羽杉a4的dna的条形码，如seqidno.25所示；

墨西哥落羽杉xm1的dna的条形码，如seqidno.26所示；

墨西哥落羽杉xm3的dna的条形码，如seqidno.27所示；

墨西哥落羽杉xm4的dna的条形码，如seqidno.28所示；

墨西哥落羽杉xm5的dna的条形码，如seqidno.29所示；

墨西哥落羽杉xm6的dna的条形码，如seqidno.30所示；

墨西哥落羽杉xm7的dna的条形码，如seqidno.31所示；

墨西哥落羽杉xm8的dna的条形码，如seqidno.32所示；

墨西哥落羽杉jm2的dna的条形码，如seqidno.33所示；

墨西哥落羽杉jm4的dna的条形码，如seqidno.34所示；

墨西哥落羽杉jm5的dna的条形码，如seqidno.35所示；

墨西哥落羽杉b4的dna的条形码，如seqidno.36所示；

墨西哥落羽杉b6的dna的条形码，如seqidno.37所示。

进一步地，步骤4)所述的35种落羽杉属种质资源无性系包括：池杉c1、池杉c5、池杉c6、池杉c7、池杉c8、池杉c9、池杉c10、池杉ct、池杉zm8、池杉zm10、落羽杉l2、落羽杉l7、落羽杉l8、落羽杉lp2、落羽杉l12、落羽杉l13、落羽杉l14、落羽杉l17、落羽杉cl、墨西哥落羽杉dd、墨西哥落羽杉a2、墨西哥落羽杉a3、墨西哥落羽杉a4、墨西哥落羽杉xm1、墨西哥落羽杉xm3、墨西哥落羽杉xm4、墨西哥落羽杉xm5、墨西哥落羽杉xm6、墨西哥落羽杉xm7、墨西哥落羽杉xm8、墨西哥落羽杉jm2、墨西哥落羽杉jm4、墨西哥落羽杉jm5、墨西哥落羽杉b4、墨西哥落羽杉b6。

进一步地，步骤2)中，所述pcr扩增的反应体系具体为：2×tapmastermix7.5μl，浓度为10μmol/l的上、下游引物各1μl，ddh2o4.5μl，5～10ng·μl^-1的模板dna1μl。

进一步地，所述pcr扩增的程序为：98℃预变性3min；98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸3min。

进一步地，所述的引物对为：

上游引物：5′-tcacagcccaggcacaa-3′；

下游引物：5′-ggtgcggctggattacct-3′。

用于鉴定落羽杉属种质资源无性系的35条落羽杉属种质资源无性系的dna条形码，如下所示：

落羽杉l2的dna的条形码，如seqidno.3所示；

落羽杉l7的dna的条形码，如seqidno.4所示；

落羽杉l8的dna的条形码，如seqidno.5所示；

落羽杉lp2的dna的条形码，如seqidno.6所示；

落羽杉l12的dna的条形码，如seqidno.7所示；

落羽杉l13的dna的条形码，如seqidno.8所示；

落羽杉l14的dna的条形码，如seqidno.9所示；

落羽杉l17的dna的条形码，如seqidno.10所示；

落羽杉cl的dna的条形码，如seqidno.11所示；

池杉c1的dna的条形码，如seqidno.12所示；

池杉c5的dna的条形码，如seqidno.13所示；

池杉c6的dna的条形码，如seqidno.14所示；

池杉c7的dna的条形码，如seqidno.15所示；

池杉c8的dna的条形码，如seqidno.16所示；

池杉c9的dna的条形码，如seqidno.17所示；

池杉c10的dna的条形码，如seqidno.18所示；

池杉ct的dna的条形码，如seqidno.19所示；

池杉zm8的dna的条形码，如seqidno.20所示；

池杉zm10的dna的条形码，如seqidno.21所示；

墨西哥落羽杉dd的dna的条形码，如seqidno.22所示；

墨西哥落羽杉a2的dna的条形码，如seqidno.23所示；

墨西哥落羽杉a3的dna的条形码，如seqidno.24所示；

墨西哥落羽杉a4的dna的条形码，如seqidno.25所示；

墨西哥落羽杉xm1的dna的条形码，如seqidno.26所示；

墨西哥落羽杉xm3的dna的条形码，如seqidno.27所示；

墨西哥落羽杉xm4的dna的条形码，如seqidno.28所示；

墨西哥落羽杉xm5的dna的条形码，如seqidno.29所示；

墨西哥落羽杉xm6的dna的条形码，如seqidno.30所示；

墨西哥落羽杉xm7的dna的条形码，如seqidno.31所示；

墨西哥落羽杉xm8的dna的条形码，如seqidno.32所示；

墨西哥落羽杉jm2的dna的条形码，如seqidno.33所示；

墨西哥落羽杉jm4的dna的条形码，如seqidno.34所示；

墨西哥落羽杉jm5的dna的条形码，如seqidno.35所示；

墨西哥落羽杉b4的dna的条形码，如seqidno.36所示；

墨西哥落羽杉b6的dna的条形码，如seqidno.37所示。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优势为：

1)本发明利用trni-gau-rrn16中的一段序列作为落羽杉属植物dna条形码，是叶绿体基因trni-gau和rrn16的间隔区。能够将落羽杉属植物不同个体进行鉴定，实现了高效，低成本，操作方便的落羽杉属种质资源无性系的鉴定，有利于以提升落羽杉属种质创新效率，保证“中山杉”产业中亲本种源的质量。

2)本发明的用于扩增前述dna条形码的引物，具有扩增片段清晰、分辨力高、灵敏度好、结果可靠准确、高效快速等优点，使用该引物建立的基于dna条形码鉴定落羽杉属种质资源无性系的方法能够将落羽杉属植物进行鉴定，实现了高效，低成本，操作方便的落羽杉属种质资源的鉴定，提升了落羽杉属种质创新效率。

附图说明

图1为引物hr11-r2在trni-gau-rrn16扩增条带图；注：e1为池杉c1、e2为池杉c5、e3为池杉c6、e4为池杉c7、e5为池杉c8、e6为池杉c9、e7为池杉c10、e8为池杉zm10、e9为池杉zm8、e10为池杉ct、f1为落羽杉cl、f2为落羽杉l2、f3为落羽杉l7、f4为落羽杉l8、f5为落羽杉l12、f6为落羽杉l13、f7为落羽杉l14、f8为落羽杉l17、f9为落羽杉lp2、f10为墨西哥落羽杉a2、f11为墨西哥落羽杉a3、f12为墨西哥落羽杉a4、g1为墨西哥落羽杉b4、g2为墨西哥落羽杉b6、g3为墨西哥落羽杉dd、g4为墨西哥落羽杉jm2、g5为墨西哥落羽杉jm4、g6为墨西哥落羽杉jm5、g7为墨西哥落羽杉xm1、g8为墨西哥落羽杉xm3、g9为墨西哥落羽杉xm4、g10为墨西哥落羽杉xm5、g11为墨西哥落羽杉xm6、g12为墨西哥落羽杉xm7、h1为墨西哥落羽杉xm8；mark自下而上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、5000b；

图2为使用trni-gau-rrn16序列所构建的系统树序列构建系统进化树；

图3为“未知1”和“未知2”与35落羽杉属种植dna条形码构建的系统进化树图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

本发明所需材料分别为落羽杉、池杉和墨西哥落羽杉三个品种，主供试35个样本属于不同的无性系(基因型)，均来源于“江苏省中国科学院植物研究所落羽杉属林木种质资源库”，包括9个落羽杉、10个池杉和16个墨西哥落羽杉的单株。

(1)9个落羽杉单株中，l2来自河南鸡公山；l7、l8、和lp2来自南京中山植物园；l12、l13、l14、l17、cl引自美国；

(2)10个池杉单株中，c1、c5、c6、c7、c8、c9、c10和ct来自南京中山植物园盲人植物园；zm8、zm10来自南京中山植物园树木园；

(3)16个墨西哥落羽杉单株中，dd引自南京东南大学校园；a2、a3、a4、xm1、xm3、xm4、xm5、xm6、xm7、xm8、jm2、jm4和jm5引自美国；b4、b6引自墨西哥。

实施例1：基于dna条形码鉴定落羽杉属种质资源无性系的方法

1、基因组dna提取

每棵单株取200mg嫩芽，在液氮冷冻下，快速研磨至粉末，采用优化ctab法提取植物全基因组dna，标本样品的dna采用试剂盒采用新型快速植物基因组dna提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取dna，并用bertholdcolibri超微量分光光度计(德国bertholdtechnology公司)检测dna的浓度和纯度；将dna质量浓度用双蒸水稀释至5～10ng·μl-1，置于-20℃冰箱中保存、备用。具体步骤如下：

1)称取新鲜落羽杉属植物叶片200mg，放入标记好的ep管内，加入已经灭菌好的钢珠，使用核酸提取仪震荡研磨20s；

2)将bufferp1预热到65℃，向淹研磨好的在ep离心管内的植物样品加入550μl预热的bufferp1(已经加入β-巯基乙醇至0.2％)和4μlrnasea剧烈涡旋摇荡混匀1分钟，室温放置10分钟。

3)加入130μl的bufferp2充分混匀，12000rpm离心3分钟。

4)小心吸取上清液到分离柱a，注意不要吸入到界面物质，12000rpm离心1分钟，收集下液，加入1.5倍体积的bufferp3立刻轻柔涡旋，充分混匀。

5)将上一步所得混合物加入到一个吸附柱ac中，吸附柱放入收集管内，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

6)加入700μl漂洗液wb，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

7)加入500μl漂洗液wb，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

8)将吸附柱ac放回空收集管中，13000rpm离心3-5分钟，尽量除去漂洗液。

9)取出吸附柱ac，放到一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加入50μl洗脱缓冲液eb，室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟收集dna。

10)并用bertholdcolibri超微量分光光度计(德国bertholdtechnology公司)检测dna的浓度和纯度；将dna质量浓度用双蒸水稀释至5～10ng·μl-1，置于-20℃冰箱中保存、备用。

提取过程中，传统方法使用液氮将叶片迅速研磨成粉末，本发明使用研磨仪处理叶片，此样品处理系统与目前已有的其它样品制备方法相比，此方法可同时处理48个样品，而且，采用快速8字形振荡方式，配合钢珠，可以高效充分地破碎样品，具有通用性广、高效灵活的优点。

2、dna条形码引物筛选

以前期筛选的11个高变区为基础设计叶绿体基因组引物，由于sanger测序序列两端150bp左右通常信号不稳定，测序不准确，为保证获得准确的高变区序列信息，引物设计在高变区两端侧翼150bp之外的区域，在此长度下，每个高变区设计五对引物，挑选出扩增出清晰的单一条带，且产物片段长度在预计范围内的引物。

itsdna条形码序列its1、its2区引物参考“裸子植物dna条形码its2高通用性引物的筛选(李燕，吴丁，高连明等)”，每个区域挑选1对引物。

dna条形码引物委托南京擎科生物有限公司进行合成。所有引物序列如表1所示。

表1dna条形码引物信息

以扩增样本的总dna作模板，pcr反应体系15μl，包括2×tapmastermix(南京诺唯赞生物科技有限公司)7.5μl；浓度为10μmol/l的上、下游引物各1μl；ddh2o4.5μl；模板dna1μl(5～10ng·μl^-1)。依据各条形码上、下游引物的退火温度，设置合适的4个梯度：50℃、55℃、60℃、65℃。最终确定最佳退火温度为55℃。扩增程序为：98℃预变性3min；98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸3min。扩增产物置于4℃保存。

3、琼脂糖凝胶电泳

1％琼脂糖凝胶电泳步骤：

1)琼脂糖凝胶的制备：称取0.5g琼脂糖凝胶粉末与锥形瓶中，并加1×tae溶液50ml，微波炉加热溶解至无胶体颗粒呈溶液状态，稍稍冷却后，然后开始灌胶，灌胶结束后立即插上梳子，形成样品孔槽。

2)上样与电泳：琼脂糖凝胶板制成后，拔出梳子，将其放入电泳缓冲液中，为避免产生气泡影响实验结果，缓冲液液面超过胶面，然后进行点样，按loadingbuffer1μl，dna样品4μl比例混合后，用移液器加入到相应的点样孔中。220v/200ma电压电泳20min，观察。

3)凝胶成像：20min结束后，取出凝胶在凝胶成像系统下拍照观察、记录。最后若凝胶电泳成像样品显示为清晰的单一条带，除引物二聚体外无其他杂带，且产物片段长度在预计范围内，亮度适中，则扩增成功。将pcr扩增产物直接测序，样品设置三次重复，使用引物hr11-r2扩增trni-gau-rrn16的电泳图如图1所示。

4、叶绿体条形码数据分析

1)测序序列的拼接、对齐和校正

将扩增好的pcr产物委托南京擎科生物有限公司进行上下游引物双端测序，测序方法为sanger测序。双向测序获得的序列的拼接、对齐和校正在seqman中完成。双向测序得到的序列片段采用denovoassemble选项进行无参考序列组装，组装程序选择seqman，敏感度设置为最高，然后手动调整或去除测序质量不佳的部分碱基，提取得到的一致序列consensus并保存。

2)扩增及测序成功率统计和序列特征分析

扩增产物凝胶成像有清晰的单一条带，且双向测序序列能顺利拼接，则计为扩增测序成功；如果通用引物不能扩增得到目的产物，或目的产物测序后不能拼接为完整的目的序列，则计为扩增/测序失败；增加分段引物后，样品能顺利扩增计为引物通用性良好，但扩增不成功(因为此种情况的扩增失败是由dna降解严重引起，而非引物问题)。

首先将测序获得的所有序列按照同一基因/间隔区归并到一起的方式，得到不同样本的相同基因/间隔区合并后的fasta格式文件，然后和测序结果一起导入bioedit(version7.01)，在capcontigassambleprogram中剪切并校正和多重比对，设置参数为minimumbaseoverlap为20，percentmatch为85，除去序列两端质量差的碱基，部分在bioedit比对不成功的序列，使用mega(version6.0)下的alignmentbymuscle选项进行比对，最后选择nj法(neighbor-joining，nj)构建系统进化树，并以kimura.2-parametermodel做1000次可信度分析。

its2的引物扩增率和测序成功率皆为100％，能单独鉴别出35棵落羽杉种质资源中的6棵，6棵单株全是落羽杉，分辨率为17.14％；

ycf1的引物扩增率和测序成功率皆为100％，能单独鉴别出35棵落羽杉属种质资源中的4棵池杉，分辨率为11.43％；条形码扩增的目的区域位于参考池杉基因序列(ncbi登录号为mn535012)的101391bp到102429bp，保留位于参考池杉基因序列的101718bp到102232bp作为该条形码核心区域。

trni-cau-ycf2的引物扩增率和测序成功率皆为100％，仅能鉴别35棵单株中的1棵池杉，分辨率为2.9％；条形码扩增的目的区域位于参考池杉基因序列(ncbi登录号为mn535012)的73202bp到74530bp，保留位于参考池杉基因序列的73741bp到74005bp作为该条形码核心区域。

psbj-clpp引物扩增率和测序成功率皆为100％，能单独鉴别出35棵落羽杉属种质资源中的3棵，分辨率为8.57％，条形码扩增的目的区域位于参考池杉基因序列(ncbi登录号为mn535012)的114385bp到115672bp，保留位于参考池杉基因序列的115155bp到115375bp作为该条形码核心区域。

trni-gau-rrn16的引物(hr11-r2引物对)扩增率和测序成功率皆为100％，条形码扩增的目的区域位于参考池杉基因序列(ncbi登录号为mn535012)的65154bp到66343bp，保留位于参考池杉基因序列的65713bp到65995bp作为该条形码核心区域，条带单一且非常明亮，如图1所示；所有35棵落羽杉属种质资源无性系的扩增得到的dna条形码序列如序列表中seqidno.3～37所示，所构建的系统进化树如图2所示。可以鉴别所有35棵种质资源无性系，分别是池杉10棵：c1、c5、c6、c7、c8、c9、c10、ct、zm8、zm10；落羽杉9棵：l12、l13、l14、l17、l2、l7、l8、lp2、cl；墨西哥落羽杉16棵：dd、a2、a3、a4、xm1、xm3、xm4、xm5、xm6、xm7、xm8、jm2、jm4、jm5、b4、b6。分辨率为100％，分辨率最高，因此将hr11-r2引物对扩增的这一段叶绿体dna序列作为落羽杉属的专属dna条形码，这一段在不同种落羽杉属单株中的变化很大，所以对落羽杉属单株有很好的鉴定能力，大大提高了落羽杉属种质资源无性系的鉴定效率。

实施例2：鉴定未知落羽杉属无性系

对“未知1”和“未知2”进行无性系鉴定，利用实施例1中的基因组dna提取方法和dna条形码pcr扩增方法，使用trni-gau-rrn16的引物(hr11-r2引物对)进行扩增，得到“未知1”的dna条形码如seqidno.38所示，得到“未知2”的dna条形码如seqidno.39所示。

将所得到“未知1”的dna条形码和“未知2”的dna条形码与seqidno3～37所示的35棵落羽杉属种质资源无性系的dna条形码构建系统进化树，结果如图3所示，“未知1”的dna条形码与墨西哥落羽杉dd聚集到一起，且序列与dd100％匹配，可以说明“未知1”属于墨西哥落羽杉dd无性系；而“未知2”的dna条形码序列与35个无性系均不相同，其无性系来源不能确定，可以通过其它方法进一步确定其属于哪一种落羽杉属种质资源无性系，可见本申请的方法可以完全鉴定出属于本方法中的35个种质资源无性系。

序列表

<110>江苏省中国科学院植物研究所

<120>一种基于dna条形码鉴定落羽杉属种质的方法

<130>100

<160>39

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>hr11-r2-f(artificial)

<400>1

tcacagcccaggcacaa17

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>hr11-r2-r(artificial)

<400>2

ggtgcggctggattacct18

<210>3

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>3

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattattgaaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaataggagcctatcaacttgtctc120

gacctgggaaaacgagcttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagc180

gaacttcactgccgataaacgacaaaagactccatctcttgcagatgcatcctcgtgtca240

ctcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc284

<210>4

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>4

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattatttcaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaataggagcctatcaacttgtctc120

gacctgggaaaacgagcttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagc180

gaacttcactgccgataaacgacaaaagactccatctcttgcagatgcatcctcgtgtca240

ctcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc284

<210>5

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>5

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattatttcaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaataggagcctatcaacttgtctc120

gacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtaac180

gaacttcactgccgaaaaacgacaaaaaactccatctcttgcagatgcatcctcgtgtca240

ctcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc284

<210>6

<211>285

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>6

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattatttcaataatttctct60

atttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacaaaaaataggagcctatcaacttgtct120

cgacctgggaaaacgagcttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtag180

cgaacttccctgccgataaacgacaaaaaactccatctcttgcaaatgcatcctcgtgtc240

actcgctctctttcgcaagcgtaacagggtatgagctcaacaagc285

<210>7

<211>285

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>7

agttattaaaaaaaaaaaaaaagaaaattgaaataaaaaaattattgaaataatttctct60

atttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacaaaaaataggagcctatcaacttgtct120

cgacctgggaaaacgagcttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtag180

cgaacttccctgccgataaacgacaaaagactccatctcttgcaaatgcatcctcgtgtc240

actcgctctctttcccaagcgtaacagggtatgagctcaacaagc285

<210>8

<211>285

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>8

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattattgaaataatttctct60

atttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacaaaaaataggagcctatcaacttgtct120

cgacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtag180

cgaacttccctgccgataaacgacaaaaaactccatctcttgcaaatgcatcctcgtgtc240

cctccctctctttcccaagcgtaacagggtatgagctcaacaagc285

<210>9

<211>285

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>9

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattattgaaataatttctct60

atttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacaaaaaataggagcctatcaacttgtct120

cgacctgggaaaacgagcttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtag180

cgaacttcactgccgaaaaacgacaaaaaactccatctcttgcaaatgcatcctcgggtc240

actcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc285

<210>10

<211>285

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>10

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaaaaaaaaaattatttcaataatttctct60

atttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacaaaaaaaaggaacctatcaacttgtcc120

ccacctgggaaaacaaacttacttatgaacttccttcttacttacgtgactatcaagtaa180

cgaacttccctggcgaaaaacgaaaaaaaaatccatctcttggaaaagcatcctcggggc240

actcgctctctttcgcaagcgtaacaggggatgaactcaacaagc285

<210>11

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>11

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattattgaaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaataggagcctatcaacttgtctc120

gacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagc180

gaacttcactgccgaaaaacgacaaaaaactccatctcttgcagatgcatcctcgtgtca240

ctcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc284

<210>12

<211>283

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>12

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaatagaaaaattatttcaataatttctctat60

ttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaataggagcctatcaacttgtctcg120

acctgggaaaacgagcttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagcg180

aacttcactgccgataaacgacaaaagactccatctcttgcagatgcatcctcgtgtcac240

tcgctctctttcgcaagcgtaacagggtatgagctcaacaagc283

<210>13

<211>283

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>13

agttattaaaaaaaaaaaaagaaaattgaaatagaaaaattatttcaataatttctctat60

ttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaataggagcctatcaacttgtctcg120

acctgggaaaacgagcttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagcg180

aacttcactgccgataaacgacaaaagactccatctcttgcagatgcatcctcgtgtcac240

tcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc283

<210>14

<211>285

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>14

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaaaaaaaaaattatttcaataatttctct60

atttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacaaaaaataggagcctatcaacttgtct120

cgacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtag180

cgaacttcactgccgaaaaacgacaaaaaactccatctcttgcaaatgcatcctcggggc240

actcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc285

<210>15

<211>283

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>15

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaatagaaaaattatttcaataatttctctat60

ttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaataggagcctatcaacttgtctcg120

acctgggaaaacgagcttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagcg180

aacttcactgccgataaacgacaaaagactccatctcttgcagatgcatcctcgtgtcac240

tcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc283

<210>16

<211>283

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>16

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattatttcaataatttctctat60

ttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaataggagcctatcaacttgtctcg120

acctgggaaaacgagcttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagcg180

aacttccctgccgataaacgacaaaaaactccatctcttgcaaatgcatcctcgtgtccc240

tcgctctctttcccaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc283

<210>17

<211>283

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>17

agttattaaaaaaaaaaaaagaaaattgaaatagagaaattattgaaataatttctctat60

ttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaataggagcctatcaacttgtctcg120

acctgggaaaacgagcttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagcg180

aacttcactgccgataaacgacaaaagactccatctcttgcagatgcatcctcgtgtcac240

tcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc283

<210>18

<211>283

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>18

agttattaaaaaaaaaaaaagaaaattgaaataaagaaattatttcaataatttctctat60

ttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaataggagcctatcaacttgtctcg120

acctgggaaaacgagcttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagcg180

aacttcactgccgataaacgacaaaagactccatctcttgcagatgcatcctcgtgtcac240

tcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc283

<210>19

<211>283

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>19

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaatagagaaattatttcaataatttctctat60

ttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaataggagcctatcaacttgtctcg120

acctgggaaaacgagcttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagcg180

aacttcactgccgataaacgacaaaagactccatctcttgcagatgcatcctcgtgtcac240

tcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc283

<210>20

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>20

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattattgaaataatttcccta60

tttcaaattccatattaaactaaaacaaacccagaaaataggagcctatcaacttgtctc120

cacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtaac180

gaacttccctgccgaaaaacgacaaaaaactccctctcttgcaaatgcatcctcggggcc240

ctccctctctttcccaagcgtaacaggggatgaactcaacaagc284

<210>21

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>21

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattattgaaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaaaaggagcctatcaacttgtctc120

gacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagc180

gaacttcactgccgaaaaacgacaaaaaactccatctcttgcagatgcatcctcgtgtca240

ctcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc284

<210>22

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>22

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattattgaaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacaaaaaaaaggagcctatcaacttgtctc120

gacctgggaaaacgagcttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtaac180

gaacttcactgccgataaacgacaaaaaactccatctcttgcagatgcatcctcgggtca240

ctcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc284

<210>23

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>23

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaaaaaaaaaattattgaaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacaaaaaataggagcctatcaacttgtctc120

gacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagc180

gaacttcactgccgataaacgacaaaaaactccatctcttgcaaatgcatcctcgtgtca240

ctcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc284

<210>24

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>24

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattatttcaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaataggagcctatcaacttgtctc120

gacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtaac180

gaacttccctgccgaaaaacgacaaaaaactccatctcttgcaaatgcatcctcgtgtcc240

ctccctctctttcccaagcgtaacagggtatgagctcaacaagc284

<210>25

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>25

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattattgaaataatttcccta60

tttcaaattccatattaaactaaaacaaacacaaaaaataggagcctatcaacttgtctc120

cacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtaac180

gaacttccctgccgaaaaacgacaaaaaactccctctcttgcaaaagcatcctcggggcc240

ctccctctctttcccaagcgtaacaggggatgagctcaacaagc284

<210>26

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>26

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattatttcaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaaaaggagcctatcaacttgtctc120

cacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagc180

gaacttccctgccgaaaaacgacaaaaaactccatctcttgcaaatgcatcctcggggca240

ctcgctctctttcgcaagcgtaacaggggatgagctcaacaagc284

<210>27

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>27

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattatttcaataatttcccta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacaaaaaaaaggagcctatcaacttgtccc120

cacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagc180

gaacttcactgccgaaaaacgacaaaaaactccatctcttgcagatgcatcctcgggtca240

ctcgctctctttcgcaagcgtaacagtggatgagctcaacaagc284

<210>28

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>28

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattatttcaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacccagaaaataggagcctatcaacttgtctc120

gacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtaac180

gaacttccctgccgaaaaacgacaaaaaactccctctcttgcaaaagcatcctcggggcc240

ctccctctctttcccaagcgtaacaggggatgagctcaacaagc284

<210>29

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>29

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattatttcaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacaaaaaaaaggagcctatcaacttgtctc120

cacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtaac180

gaacttcactgccgaaaaacgacaaaaaactccatctcttgcaaatgcatcctcggggca240

ctcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc284

<210>30

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>30

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattatttcaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaaaaggagcctatcaacttgtctc120

cacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagc180

gaacttcactgccgaaaaacgacaaaaaactccatctcttgcaaatgcatcctcggggca240

ctcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc284

<210>31

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>31

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattatttcaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaataggagcctatcaacttgtctc120

cacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtaac180

gaacttcactgccgaaaaacgacaaaaaactccatctcttgcagatgcatcctcgtgtca240

ctcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc284

<210>32

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>32

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattatttcaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaataggagcctatcaacttgtctc120

gacctgggaaaacgaacttacttatgaacttctttcttacttacgtgactatcaagtaac180

gaacttccctgccgaaaaacgacaaaaaactccctctcttgcaaatgcatcctcgtgtcc240

ctccctctctttcccaagcgtaacaggggatgagctcaacaagc284

<210>33

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>33

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattatttcaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaaaaggagcctatcaacttgtctc120

cacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagc180

gaacttcactgccgaaaaacgacaaaagactccatctcttgcagaagcatcctcggggca240

ctcgctctctttcgcaagcgtaacagggtatgagctcaacaagc284

<210>34

<211>279

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>34

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaatagaaaaattatttcaataatttctctat60

ttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacaaaaaataggagcctatcaacttgtctcg120

acctgggaaaacgagcttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagcg180

aacttcactgccgataaacgaaaaagactccatctcttgagatgcatcctcgtgtcactc240

gctctctttccaagcgtaacagtgtatgagctcacaagc279

<210>35

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>35

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattatttcaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacaaaaaaaaggagcctatcaacttggctc120

gacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtaac180

gaacttcactgccgaaaaacgacaaaaaactccatctcttgcagatgcatcctcggggca240

ctcgctctctttcgcaagcgtaacagtggatgagctcaacaagc284

<210>36

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>36

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattatttcaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacaaaaaataggagcctatcaacttgtctc120

gacctgggaaaacgaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagc180

gaacttcactgccgataaacgacaaaaaactccatctcttgcagatgcatcctcgtgtca240

ctcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc284

<210>37

<211>285

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>37

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaaaaaaaaaattatttcaataatttctct60

atttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacaaaaaaaaggagcctatcaacttgtcc120

cgacctgggaaaacaaacttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaaatag180

cgaacttcactgccgaaaaacgaaaaaaaactccatctcttgcaaatgcatcctcgtgtc240

actcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc285

<210>38

<211>284

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>38

agttattaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgaaataaaaaaattattgaaataatttctcta60

tttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacaaaaaaaaggagcctatcaacttgtctc120

gacctgggaaaacgagcttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtaac180

gaacttcactgccgataaacgacaaaaaactccatctcttgcagatgcatcctcgggtca240

ctcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc284

<210>39

<211>283

<212>dna

<213>taxodiumrich.

<400>39

agttattaaaaaaaaaaaaagaaaattgaaatagagaaattatttcaataatttctctat60

ttcaaattcaatattaaactaaaacaaacacagaaaataggagcctatcaacttgtctcg120

acctgggaaaacgagcttacttatgaacttcattcttacttacgtgactatcaagtagcg180

aacttcactgccgataaacgacaaaagactccatctcttgcagatgcatcctcgtgtcac240

tcgctctctttcgcaagcgtaacagtgtatgagctcaacaagc283