产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其是涉及一种产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗。
背景技术：
：产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)也称魏氏梭菌，是一种重要的人畜共患病，产气荚膜梭菌可以导致创伤性气性坏疽以及人类食物中毒，还可以导致牛羊坏死性肠炎、羊快疫、牛羊肠毒血症和羔羊痢疾，因此对畜牧业具有巨大的威胁。产气荚膜梭菌主要分泌α、β、ε、ι这四种外毒素，通过分泌的外毒素的种类不同，产气荚膜梭菌可以分为a、b、c、d、e五个毒素型。产气荚膜梭菌致病后具有发病急、病程短和死亡率高的特点，因此人或动物一旦发病容易发生猝死，因此接种疫苗是对产气荚膜梭菌导致的疾病的有效防控手段。传统商业化疫苗主要为灭活疫苗，由d型产气荚膜梭菌c60-1或c60-2菌株使用甲醛灭活后与氢氧化铝胶佐剂混合制成。由于d型产气荚膜梭菌c60-1或c60-2菌株在培养时采用的培养基为厌气肉肝汤，而该培养基成分复杂，导致难于质量控制，因此制备得到的灭活疫苗批间差异大，难于质量控制；且疫苗中含有完整的产气荚膜梭菌，因此疫苗中除去有效的抗原外，杂蛋白含量较多；同时，灭活疫苗的毒素定量只能通过小鼠毒力试验测定，操作繁琐且定量不准；由于d型产气荚膜梭菌c60-1或c60-2菌株毒力较强，因此需要较高含量的甲醛来对菌株进行灭活，这就导致了疫苗制备过程中甲醛含量高，灭活时间长。从上述可以看出灭活疫苗还存在着许多的不足，依据中国兽医药品监察所的抽检效力检验数据，目前产气荚膜梭菌疫苗的疫苗效率检验不合格率高达37％。ε毒素由b型和d型产气荚膜梭菌产生，其以前毒素的形式分泌于菌体外，全长296个氨基酸。前毒素被宿主的胰蛋白酶和糜蛋白酶或梭菌自身的λ蛋白酶作用后，去除n端11-13个以及c端22-29个氨基酸，从而活化为成熟毒素。ε毒素属于β穿孔素家族的成员，是产气荚膜梭菌毒素中毒力最强的毒素，其毒力仅次于肉毒杆菌素和破伤风神经毒素的毒力而成为第三强的梭菌毒素。因此，实现ε毒素的减毒以及构建相关减毒体，对于开发ε毒素基因工程减毒亚单位疫苗以及其作为抗原组分的多价亚单位疫苗的研究和应用就显得尤为重要。目前，已有关于产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗的报道，如抑制产气荚膜梭菌感染的重组ε毒素及其方法与应用(cn106008682b)和大量外文文献报道。这些报道中，均采用iptg作为诱导剂在大肠杆菌系统中表达，同时加入促融标签，导致蛋白结构发生变化，免疫原性不好；同时ε毒素重组蛋白均在胞内表达，需要进行超声破碎及镍柱纯化等复杂的生产过程。因此一种能够作为疫苗抗原的产气荚膜梭菌ε毒素及其制备方法是目前市场需要的。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白，相比于野生型，该产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白毒性显著降低且具有良好的免疫原性。本发明的第二目的在于提供一种上述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的制备方法。本发明的第三目的在于提供一种包含上述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白或能够表达其的前体疫苗。为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：根据本发明的一个方面，本发明提供了一种产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白，包括：将氨基酸序列如seqidno.3所示的产气荚膜梭菌ε毒素的第151位氨基酸突变为丙氨酸。根据本发明的另一个方面，本发明还提供了含有编码权所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的区域的核酸。根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的制备方法，包括在宿主中表达编码所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的基因。根据本发明的另一个方面，本发明还提供了表达盒、载体、重组微生物和细胞系中的至少一种；所述表达盒、所述载体、所述重组微生物和所述细胞系分别独立的表达所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白，和/或含有所述核酸。根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白，所述核酸，所述制备方法或所述表达盒、所述载体、所述重组微生物和所述细胞系中的至少一种在如下(x1)～(x3)中至少一种的应用；(x1)制备产气荚膜梭菌基因工程疫苗；(x2)制备产气荚膜梭菌病诊断抗原；(x3)制备单克隆抗体。根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种疫苗，该疫苗包含所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白，所述核酸，所述表达盒、所述载体、所述重组微生物和所述细胞系中的至少一种。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白对mdck细胞毒性与野生成熟ε毒素相比，降低了6000倍。100μg的重组蛋白对小鼠无毒力，减毒成功，毒素安全；在兔子和牛模型呈现良好的免疫原性和免疫保护性，能够应用于制备预防产气荚膜梭菌亚单位疫苗或多价梭菌毒素亚单位疫苗。本发明提供的上述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的制备方法，通过在革兰氏阳性菌表达系统中表达目的蛋白，实现了目的蛋白分泌表达在培养基中，易纯化的效果。采用革兰氏阳性菌表达系统中制备产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白，蛋白含量不低于300μg/ml，蛋白纯度不低于80％，高于大肠杆菌的表达量。本发明提供的包含上述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白或能够表达其的前体的疫苗，具有生产工艺简单、表达量和纯度高、成本低和疫苗副作用小等优点，能够缓解灭活疫苗生产工艺复杂、成本高、抗原复杂、批间差异和副作用大等技术问题。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例1中重组载体的目的基因pcr扩增产物；图2为本发明实施例1中酶切产物的电泳结果；图3为实施例2中产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白sds-page电泳结果；图4为实施例2中产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白westernblot图；图5为产气荚膜梭菌ε毒素突变体对mdck细胞的毒力试验结果；图6为产气荚膜梭菌ε毒素突变体疫苗抗体持续期试验结果；图7为实施例7以优化后的发酵条件发酵制备得到的产气荚膜梭菌ε毒素突变体的sds-page电泳结果；图8为表达质粒pyl的结构图谱示意图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。根据本发明的一个方面，本发明提供了一种产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白，包括：将氨基酸序列如seqidno.3所示的产气荚膜梭菌ε毒素的第151位氨基酸突变为丙氨酸。突变后的产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白相比于野生型蛋白，对mdck细胞毒性与野生成熟ε毒素相比，降低了6000倍。100μg的产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白对小鼠无毒力，减毒成功，毒素安全；在兔子和牛模型呈现良好的免疫原性和免疫保护性，能够应用于制备预防产气荚膜梭菌亚单位疫苗或多价梭菌毒素亚单位疫苗。mkknlvkslaiasavisiysivnivsptnviakeisntvsnemskkasydnvdtliekgryntkynylkrmekyypnamayfdkvtinpqgndfyinnpkveldgepsmnyledvyvgkalltndtqqeqklksqsftckntdtvtattthtvgtsiqatakftvpfnetgvslttsysfantntntnskeithnvpsqdilvpanttveviaylkkvnvkgnvklvgqvsgsewgeipsylafprdgykfslsdtvnksdlnedgtiningkgnysavmgdelivkvrnlntnnvqeyvipvdkkeksndsnivkyrslsikapgik(seqidno.3)。在一些优选的实施方式中，所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。mkknlvkslaiasavisiysivnivsptnviakeisntvsnemskkasydnvdtliekgryntkynylkrmekyypnamayfdkvtinpqgndfyinnpkveldgepsmnyledvyvgkalltndtqqeqklksqsftckntdtvtatttatvgtsiqatakftvpfnetgvslttsysfantntntnskeithnvpsqdilvpanttveviaylkkvnvkgnvklvgqvsgsewgeipsylafprdgykfslsdtvnksdlnedgtiningkgnysavmgdelivkvrnlntnnvqeyvipvdkkeksndsnivkyrslsikapgik(seqidno.1)。在一些优选的实施方式中，所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白由革兰氏阳性菌表达系统表达，由革兰氏阳性菌表达系统表达的产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白能够保留蛋白的天然构象。根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种含有编码所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的区域的核酸。所述核酸指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。核酸的实例包括但不限于单链、双链或多链dna或rna、基因组dna、cdna、dna-rna杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。在一些优选的实施方式中，所述核酸的核苷酸序列优选如seqidno.2所示。atgaaaaaaaatcttgtaaaaagtttagcaatcgcatcagcggtgatatccatctattcaatagttaatattgtttcaccaactaatgtaatagctaaggaaatatctaatacagtatctaatgaaatgtccaaaaaagcttcttatgataatgtagatacattaattgagaaaggaagatataatacaaaatataattacttaaagagaatggaaaaatattatcctaatgctatggcatattttgataaggttactataaatccacaaggaaatgatttttatattaataatcctaaagttgaattagatggagaaccatcaatgaattatcttgaagatgtttatgttggaaaagctctcttaactaatgatactcaacaagaacaaaaattaaaatcacaatcattcacttgtaaaaatactgatacagtaactgcaactactactgctactgtgggaacttcgatacaagcaactgctaagtttactgttccttttaatgaaacaggagtatcattaactactagttatagttttgcaaatacaaatacaaatactaattcaaaagaaattactcataatgtcccttcacaagatatactagtaccagctaatactactgtagaagtaatagcatatttaaaaaaagttaatgttaaaggaaatgtaaagttagtaggacaagtaagtggaagtgaatggggagagatacctagttatttagcttttcctagggatggttataaatttagtttatcggatacagtaaataagagtgatttaaatgaagatggtactattaatattaatggaaaaggaaattatagtgcagttatgggagatgagttaatagttaaggttagaaatttaaatacaaataatgtacaagaatatgtaatacctgtagataaaaaagaaaaaagtaatgattcaaatatagtaaaatataggagtctttctattaaggcaccaggaataaaataa(seqidno.2)。根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的制备方法，包括在宿主中表达编码产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的基因。其中宿主指的是包含编码产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白基因的细胞，宿主通过直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法含有编码所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白基因，宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。表达指的是内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。本发明提供的制备方法工艺简单、成本低、过程可控。在一些优选的实施方式中，宿主包括革兰氏阳性菌。宿主采用革兰氏阳性菌够使蛋白外分泌，“胞外分泌”的形式表达，即目的蛋白分泌至细胞外的培养基中，获得具生物活性的蛋白质，从而避免了因包涵体复性带来的困难，易于蛋白产物的纯化。采用革兰氏阳性菌表达产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白能够保留蛋白的天然构象，且革兰氏阳性菌不含有类似脂多糖的毒性化合物，减少疫苗纯化内毒素的成本和副反应，这使得它们特别适合宿主来生产医学和药学上的蛋白。在一些优选的实施方式中，革兰氏阳性菌包括葡萄球菌、枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒状杆菌。在一些优选的实施方式中，包括将含有编码所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的基因克隆至载体，得到重组载体；然后将重组载体转化至大肠杆菌，筛选后将重组载体阳性克隆经金黄色葡萄球菌rn4220转化，将重组载体转化进入表皮葡萄球菌中，然后经诱导表达得到所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白。其中载体优选包括pyl质粒载体，pyl质粒载体是将xyl/tet片段、ori区域和erm抗性基因插入prb373质粒的多克隆位点及抗性区域中，得到的重组质粒pyl。重组质粒pyl有两个复制子：puc18的复制子保证此载体能在大肠杆菌中复制；pe194复制子保证质粒在葡萄菌中复制。同时由于在其多克隆位点上游加入了可诱导表达的xyl/tet片段，为四环素抗性基因表达调控元件，外源基因的表达受四环素诱导，使其下游基因限制性表达(严谨型表达)，避免本底性表达造成表型的不可控性。erm抗性基因则赋予质粒及克隆子方便快捷的抗生素筛选表型。金黄色葡萄球菌rn4220来源nctc8325-4，是一株限制性内切酶缺陷菌株，能够接受来源于外部的其他物种的dna质粒。rn4220体内没有其他质粒，对大部份抗生素都敏感。rn4220是用来转化大肠杆菌质粒dna的金黄色葡萄球菌菌株。该菌株在基因sau1hsdr上有突变，该突变的产生可以导致rn4220成为限制修饰系统基因缺陷型，可以用来作为大肠杆菌质粒dna和葡萄球菌质粒转化的中间宿主菌。表皮葡萄球菌(s.epidermidis)一般不产生外毒素(溶血毒素)、杀白细胞毒素和肠毒素，故侵袭力较弱，属于非致病性葡萄球菌，在中国医学细菌保藏管理中心和atcc官网中均规定生物安全等级1，非常适合作为受体菌。在一些优选的实施方式中，诱导表达的条件为使用终浓度300～700ng/ml诱导剂脱水四环素(atc)在36～38℃诱导16～36小时。诱导剂atc使用时的终浓度例如可以为但不限于为300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml或700ng/ml，诱导时间例如可以为但不限于为16小时、18小时、20小时、22小时、25小时、28小时、30小时、32小时、35小时或36小时；诱导温度例如可以为但不限于为36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃。在一些更优选的实施方式中，诱导表达的条件为使用终浓度400ng/ml诱导剂atc在37℃诱导36小时。在一些优选的实施方式中，种子液接种量0.1～5％(v/v)，例如可以为但不限于为0.1％(v/v)、0.5％(v/v)、1％(v/v)、2％(v/v)、3％(v/v)、4％(v/v)或5％(v/v)，优选为0.5％(v/v)。在一些优选的实施方式中，补料碳源包括葡萄糖和/或甘油，优选为甘油。根据本发明的另一个方面，本发明还提供了表达盒、载体、重组微生物和细胞系中的至少一种；所述表达盒、所述载体、所述重组微生物和所述细胞系分别独立的表达所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白，和/或含有所述核酸。表达盒指的是能够提供和/或调控编码外源蛋白基因的核酸构建体，除去含有编码外源蛋白的核酸区域外，还包括但不限于启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mrna翻译的其他控制元件。载体指的是能够使编码所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的基因整合至宿主细胞内的元件，使外源基因在宿主中复制、表达和/或整合至宿主的基因组中，载体的实例包括但不限于为质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组。重组微生物和细胞系指的是经过修饰、改变或者工程化等操作后，与起始微生物或细胞呈现不同基因型或者表型的，能够复制和/或表达所述基因的微生物或细胞系。具体的实施例包括但不限于：含有编码产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白基因的载体，以及包含该载体的金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌能够表达产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白；或含有编码产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白基因的载体的大肠杆菌，载体能够在大肠杆菌中复制，以实现载体的克隆。根据本发明的另一个方面，本发明还提供了产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白，核酸，或制备方法，或表达盒、载体、重组微生物和细胞系中至少一种在如下(x1)～(x3)中至少一种的应用；(x1)制备产气荚膜梭菌基因工程疫苗，疫苗实例包括但不限于以产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白作为主要活性成分的亚单位疫苗；以核酸作为主要成分的核酸疫苗；或能够表达产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的重组微生物作为产气荚膜梭菌基因工程疫苗的制备原料。(x2)制备产气荚膜梭菌病诊断抗原，产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白可以直接作为产气荚膜梭菌病诊断抗原，或者核酸或其他能够表达生产所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的前体物质用于制备产气荚膜梭菌病诊断抗原。(x3)制备单克隆抗体，将产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白，或核酸或其他能够表达生产产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的前体物质免疫动物后可以用于生产单克隆抗体。根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种疫苗，疫苗包含产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白，核酸，或表达盒、载体、重组微生物和细胞系中至少一种。本发明提供的疫苗具有生产工艺简单、表达量和纯度高、成本低和疫苗副作用小等优点，能够有效避免灭活疫苗生产工艺复杂、成本高、抗原复杂、批间差异和副作用大等缺点。疫苗的实例包括但不限于以所述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白作为主要活性成分的亚单位疫苗；以所述核酸作为主要成分的核酸疫苗。可以理解的是，本发明提供的疫苗除去产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白或能够产生其的前体外还可以含有其他抗原物质，以制备成多价疫苗或多联疫苗；以及本发明的提供的疫苗还可以含有本领域可接受的任意的辅料，包括但不限于佐剂、抗生素和稳定剂中的一种或多种等。在一些优选的实施方式中，疫苗包含产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白和佐剂。在一些优选的实施方式中，产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的浓度为25～75μg/ml，例如可以为但不限于为25μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml或75μg/ml，优选为50μg/ml。在一些优选的实施方式中，佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、mf59佐剂或montanideisa系列佐剂；优选使用montanideisa系列佐剂；更优选使用isa35a佐剂。本发明通过试验发现将isa35a佐剂与产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白配合使用对免疫的动物保护效力最高。下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。试验材料、试剂、菌株、细胞与试验动物如下：实验材料：质粒载体pyl和rn4220感受态细胞由发明人实验室冻存；菌株rn4220、表皮葡萄球菌购自atcc；e.colidh5α感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司。高保真fastpfudna聚合酶和dntps购自全式金公司；限制性内切酶(ascⅰ；pmeⅰ)、dl2000dnamarker、10×loadingbuffer、4×proteinsdspageloadingbuffer、pcr产物回收纯化试剂盒，均购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。mdck细胞系由发明人实验室冻存；产气荚膜梭菌ε毒素抗体检测试剂盒购自bio-xdiagnostics。d产气荚膜梭菌c60-2购自中国兽医药品监察所菌种保藏中心；体重16～20g的小鼠、体重1.5～2.0kg的兔均购自新疆医科大学实验动物中心。实施例11.pyl表达质粒的构建：1.1合成启动子、ori区域和erm抗性基因：根据对表达载体的需求，人工化学合成可使用四环素进行表达调控的xyl/tet片段、ori区域及可使用抗生素进行筛选的erm抗性基因。1.2pyl表达质粒的构建：将上述1.1合成的基因片段通过分子生物学的方法插入到prb373质粒中，测序正确，获得表达质粒pyl，质粒的结构图谱如图8所示。2.获取目的基因：对产气荚膜梭菌ε毒素编码基因进行优化设计，并将第151位组氨酸突变为丙氨酸，经人工合成获得基因片段，核苷酸序列为seqidno.2，氨基酸序列如seqidno.1所示。上游引物序列为：5’-aaactatgaaaaaaaatcttgtaaaa-3’(seqidno.4)；下游引物序列为：5’-ttggcgcgccttattttattcctggtgcctt-3’(seqidno.5)。pcr扩增体系如下：dnatemple1.0μlprimer10.5μlprimer20.5μlpremixextaq12.5μlddh2o10.5μlpcr反应程序为：目的dna条带回收，然后与载体pyl一起进行双酶切(ascⅰ/pmeⅰ)，并将酶切产物回收，载体双酶切结果如图2所示，图2中泳道1为质粒；泳道2为经双酶切的质粒；泳道m1和m2为dnamarker。连接及转化目的基因片段与pyl载体连接及转化：10μl连接体系：吸取dnaligasebuffer1μl，目的片段回收产物4μl，表达载体回收产物2μl，t4dnaligase1μl，双蒸水2μl加入pcr管中，轻弹pcr管管壁，使反应混合液混合均匀，瞬离，置连接仪中16℃连接过夜。将连接产物转化e.colidh5α感受态细胞，涂布于含300μg/mlerm的lb固体培养板上，置36～38℃恒温培养箱中培养16～24小时。挑选单菌落，提取重组表达质粒并进行pcr鉴定和测序。目的基因片段pcr扩增电泳图如图1所示，图1中泳道1为目的基因pcr扩增产物；泳道2为阴性对照；泳道3为d型产气荚膜梭菌ε毒素；泳道m为dnamarker。将测序正确重组质粒再转化至rn4220后，置于36～38℃恒温培养箱培养20～24小时，从平板上挑取5个菌落转接到10mltsb液体培养基(含5μg/ml红霉素)中，置于36～38℃恒温振荡培养箱，以200r/min振荡培养16～20小时，将菌液按照核酸提取试剂盒说明书进行操作，提取rn4220中的质粒转化表皮葡萄球菌(se)中，获得最终用于诱导表达的重组菌株se/pyl-etxh151a。实施例2重组蛋白产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的表达与鉴定：2.1将制备好的重组菌株se/pyl-etxh151a按0.5％的比例接种含5μg/mlerm的tsb液体培养基中，按400ng/ml加入诱导剂atc置36～38℃恒温振荡培养箱中，以200r/min振荡培养18～36小时。2.2收集上清：将培养液高速离心收集上清，将培养液高速离心收集上清，进行sds-page检测，观察记录重组蛋白产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白含量和蛋白纯度。具体见图3，图3中泳道m为蛋白分子量marker；泳道a～d依次为1000μg/mlbsa、500μg/mlbsa、250μg/mlbsa和125μg/mlbsa、泳道1为重组产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白。2.3重组蛋白westernblot鉴定：重组蛋白经sds-page电泳后转印至pvdf膜上，以hrp标记的ε毒素的特异性单抗(1∶20)为进行孵育，按照底物显色试剂盒说明进行显色，检测重组蛋白反应原性。具体见图4，图4中泳道m为蛋白分子量marker；泳道1为诱导后上清；泳道2为诱导前培养基。实施例3重组蛋白产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白小鼠毒力试验：本研究根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)三部中的规定，选择尾静脉注射的方法来检测产气荚膜梭菌ε毒素突变体对小鼠的毒力。将16～20g的小鼠随机分为6组，每组5只，分别以1μg、10μg以及100μg三个注射剂量注射，同时设置培养基作为阴性对照以及1个mld的天然毒素为阳性对照。样品用明胶缓冲液进行稀释，注射的液体总体积为200μl，观察1～3日，记录小鼠死亡情况。结果，1mld的天然毒素小鼠全部死亡，阴性对照组和重组毒素三个不同注射剂量小鼠均存活。实施例4重组蛋白mdck细胞毒力试验：4.1细胞培养：将mdck细胞(2×105个/ml)加入96孔板，100μl/孔，于37℃，5％co2培养箱中过夜培养。4.2蛋白稀释接种和培养：将产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白和野生ε毒素蛋白用0.2μm的滤器过滤后稀释，进行蛋白定量。将蛋白进行2倍倍比稀释，共12个浓度，每个浓度接种3孔，正常细胞接种空培养基，于37℃，5％co2培养箱中培养。4.3细胞观察：记录细胞病变时间24h细胞状态并拍照，结果见图5，其中，a图为200μg/mlε毒素突变体的结果图，b图为对照组，c图为0.05μg/ml野生ε毒素的结果图。4.4mts检测：培养24小时后，弃上清，每孔加入100μl培养基，每孔再加入20μlmts试剂，于37℃，5％co2培养箱中培养1-2小时，在酶标仪上读取a490nm下的od值来判定细胞死亡情况。4.5细胞死亡率计算：细胞死亡率(％)＝(1-试验组a490nm/阴性对照组a490nm)100％。4.6毒素ct50值计算：ct50＝㏒-1[xm-i(∑p-0.5)]+i/4(1-pm-pn)。4.7ε毒素突变体细胞半数病变量ct50＝242.38μg/ml，野生ε毒素细胞半数病变量ct50＝0.038μg/ml。实施例5产气荚膜梭菌ε毒素突变体免疫原性研究：5.1目的蛋白的表达：将实施例1制备好的se/pyl-etxh151a株接种在含5μg/mlermtsa固体平板上，置于36～37℃恒温培养箱中培养16～18小时，选取单个菌落接种于10ml含5μg/mlermtsb液体培养基内，置于36～37℃恒温振荡培养箱中200r/min振荡培养12～14h，然后按1％的比例接种含5μg/mlermtsb液体培养基中，按300ng/ml加入诱导剂atc，置36～37℃恒温振荡培养箱中，以200r/min振荡培养16～24小时。将培养液高速离心收集上清，然后将上清液进行sds-page检测，观察记录重组蛋白含量和蛋白纯度。5.2蛋白定量以及纯度分析5.2.1sds-page凝胶电泳：将蛋白marker、待检样品及bsa标准品依序上样至胶片中，进行sds-page凝胶电泳，结束后，用考马斯亮蓝r250进行染色30分钟，然后用脱色液脱色至目的条带清晰，拍照保存。5.2.2产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白定量：5.2.2.1标准曲线绘制：打开launchvisionworksls软件，依次框选待检样品及bsa标准品目的条带，依次输入bsa标准品蛋白浓度，绘制标准曲线，当r2≥0.99时，可进行待检样品的测定。5.2.2.2待检样品蛋白含量：测定以标准曲线为参照，launchvisionworksls软件分析得出待检样品中的目的蛋白浓度。5.2.2.3蛋白纯度测定：打开alphaeasefc软件，点击“aanlysistools”按钮，再打开“1d-muti”界面，框选待检样品所有条带，点击“autogrid”按钮，得出待检样品所有条带百分比含量，记录目的蛋白百分比含量，即为目的蛋白纯度结果。5.3抗原处理：5.3.1按0.2％比例加入甲醛溶液，置于36～37℃恒温振荡摇床中，以100r/min振荡24～48h，灭活残留菌体。然后放入2～8℃冷藏箱中备用。5.3.2灭活检测：5.3.2.1无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。5.3.2.2灭活检验：用体重16～20g的小白鼠2只，各静脉注射离心上清0.4ml，观察24小时，均应健活。5.4乳化：将产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白与水包油佐剂乳化，然后将两部分充分混合，制备成抗原含量为100μg/ml的疫苗400ml。5.5兔子免疫试验：5.5.1中和抗体试验：用体重1.5～2.0kg兔4只，每只肌肉注射疫苗0.25ml，免疫21天后，采血分离血清，4只动物血清等量混合，取混合血清0.4ml与0.8ml的d型产气荚膜梭菌毒素(含12个小鼠mld)，置36～37℃作用40分钟，然后静脉注射15～20g的小鼠各2只，0.3ml/只。同时用对照小鼠2只，分别注射1mld产气荚膜梭菌ε毒素作对照。小鼠观察3日，判定结果。5.5.2免疫攻毒试验：免疫21日后，连同条件相同的对照兔2只，分别耳缘静脉注射1个家1个兔mld的(mld)的d型产气荚膜梭菌毒素。观察1日，记录家兔死亡情况。试验结果如表1所示：5.5.3试验结果：将se/pyl-etxh151a株所表达的重组蛋白与佐剂混合后制成蛋白含量为100μg/ml的疫苗，免疫兔子，0.25ml/只，免疫后21日，进行血清中和试验和攻毒试验，结果各代次免疫组血清中和效价对d型产气荚膜梭菌毒素的效价均达到3(0.1ml免疫动物血清中和3mld毒素)；静脉注射1兔mld的d型产气荚膜梭菌毒素，免疫组均4/4保护，对照全部死亡，结果如表1所示。表1.家兔血清中和效价和攻毒试验结果分组试验动物(只)血清中和效价(mld/0.1ml)攻毒结果免疫组434/4存活对照组200/2存活5.6牛免疫试验5.6.1中和抗体试验：用3～6月龄左右健康犊牛3只，每只肌肉注射疫苗2ml，免疫21天后按照相同途径进行第二次免疫，二免后14日，采血分离血清，取每只动物血清0.4ml分别与0.8ml的d型产气荚膜梭菌毒素(含12个小鼠mld)，置36～37℃作用40分钟，然后静脉注射15～20g的小鼠各2只，0.3ml/只。同时各型用对照小鼠2只，分别注射1mld与毒素血清混合物相同的毒素作对照。小鼠观察1日，判定结果。5.6.2免疫攻毒试验：二免后14日，连同条件相同的对照牛3只，分别静脉注射1个牛最小致死剂量(mld)的d型产气荚膜梭菌毒素。观察3日，记录牛死亡情况。5.6.3牛免疫试验结果：将疫苗免疫牛，间隔21日进行二免，二免后14日进行血清中和试验和攻毒试验，结果显示，重组蛋白100μg/头免疫组血清中和效价对d型产气荚膜梭菌毒素的效价均达到1(0.1ml免疫动物血清中和3mld毒素)。试验结果如表2所示。表2.牛血清中和效价和攻毒试验结果实施例6产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白亚单位疫苗免疫持续期试验：6.1免疫：将产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白亚单位疫苗(100μg/ml，制备方法同实施例5)通过肌肉接种4只健康易感兔子，0.25ml/只(25μg/只)。一免后第14日、28日、60日、90日、120日、160日、190日采血，分离血清，-20℃保存备用。6.2抗体检测：将不同免疫时间血清按照抗体检测试剂盒的检测方法进行检测。6.3攻毒：免疫后180日，所有试验动物均静脉注射1个兔mld的d型产气荚膜梭菌毒素。6.4阻断率计算公式：样品阻断率＝[(阴性血清od值－样品血清od值)/阴性对照od值]×100％。阳性血清阻断率＝[(阴性血清od值－阳性血清od值)/阴性血清od值]×100％。6.5试验成立的标准：阴性血清od值－阳性血清od值>0.7；阳性血清阻断率>30％。6.6免疫持续期结果：6.6.1抗体结果：根据图6结果所示，兔子免疫疫苗(25μg/只)，180日采血，免疫兔血清阻断率在80％以上。6.6.2d型产气荚膜梭菌毒素攻毒结果：180日，用d型产气荚膜梭菌毒素对所有试验动物进行攻击，对照组兔2/2死亡，免疫组4/4存活。实施例7蛋白表达优化：7.1培养基的制备：7.1.1tsa固体培养基：按胰蛋白大豆琼脂粉(trypticsoyagar，tsa)每40g加人940ml注射用水充分混匀后加热至完全溶解，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，待冷却至50℃左右，根据需要可加入终浓度为5μg/ml的红霉素，倒平皿备用。7.1.2tsb液体培养基：按胰蛋白大豆肉汤粉(trypticsoybroth，tsb)每30g加入940ml注射用水充分混匀后加热至完全溶解，121c高压蒸汽灭菌15分钟，使用前根据需要可加入终浓度为5μg/ml的红霉素。7.2菌种复苏：7.2.1一级生产种子制备：取se/pyl-etxh151a菌种，进行表面消毒后打开，加入少许tsb培养基，用接种环在含有红霉素的tsb平板上划线，置于36～38℃恒温培养箱培养12～16小时，从平板上挑取单个菌落转接到10mltsb液体培养基(含5μg/ml红霉素)中，置于36～38℃恒温振荡培养箱，以200r/min振荡培养16～24小时，收集复苏菌液作为一级生产种子。7.2.2二级生产种子制备：将一级生产种子按0.2％(v/v)接种量接种含200mltsb培养基(含5μg/ml红霉素)500ml摇瓶中，置于36～38℃恒温振荡箱，以200r/min振荡培养8～12小时，收集复苏菌液作为二级生产种子。7.2.3发酵罐试验：参考摇瓶培养体条件，采用15l发酵罐进行发酵试验，通过无菌过滤方式装入培养基5l，加入终浓度为5μg/ml的红霉素，加入0.01％的消泡剂。设置发酵参数：培养温度36～37℃，ph值7.0，溶氧20％。打开补料、补碱、补酸三路开关，通过自动添加1mol/l盐酸或30％氨水来控制ph值。手动调节搅拌速度及通气量，维持溶氧。参照7.2.3.1～7.2.3.4的发酵条件发酵，并在最佳条件下进行发酵参数的验证。7.2.3.1补料碳源的选择：用15l发酵罐进行发酵试验，初始上作体积为5l，按1％的接种量接种种子液。采用葡萄糖和甘油作为补料碳源，加入终浓度为400ng/ml的atc进行诱导表达，分别不同时间取样检测菌液密度(od600)和产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白etxh151a的表达量。其结果见下表1，添加甘油组蛋白表达量高。表1补料碳源对retx蛋白表达的影响7.2.3.2诱导剂浓度的选择：用15l发酵罐进行发酵试验,初始体积为5l，按1％接种量接种种子液。采用甘油作为补料碳源，加入终浓度为300、400、700ng/ml的atc进行诱导表达，分别不同时间取样检测产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白etxh151a的表达量。表达结果见表2，400ng/ml浓度诱导剂表达量高。表2诱导剂浓度对retx蛋白表达的影响7.2.3.3诱导时间的选择：用15l发酵罐进行发酵试验，初始体积为5l，按1％接种量接种种子液。采用甘油作为补料碳源，加入终浓度为400ng/ml的atc进行诱导表达，分别不同时间取样检测产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白etxh151a的表达量。结果见表3，在32-36h表达量最高。表3不同诱导时间对retx蛋白表达的影响备注：“—”表示未进行7.2.3.4种子液接种量的选择：用15l发酵罐进行发酵试验，初始体积为5l，按0.2％、0.5％、2％的接种量接种种子液。采甘油作为补料碳源，加入终浓度为400ng/ml的atc进行诱导表达，分别不同时间取样检测产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白etxh151a的表达量。0.5％的接种量比较适合蛋白表达。表4种子接种量对retx表达的影响7.2.3.5发酵工艺的验证：参考优化的条件，用15l发酵罐进行4次分批补料发酵试验，初始体积为5l，按0.5％接种量接种种子液。采甘油作为补料碳源，加入终浓度为400ng/ml的atc进行诱导表达，诱导表达36小时结束发酵，检测产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白etxh151a表达情况和纯度。发酵优化结果：用15l发酵罐进行了4次se/pyl-etxh151a株的发酵表达，补料碳源为甘油、诱导剂浓度为400ng/ml、诱导时间为36h、种子液接种量为0.5％。其目的蛋白为蛋白含量均不低于300μg/ml，蛋白纯度不低于80％。制备得到的产气荚膜梭菌β毒素突变体蛋白的sds-page结果如图7所示，图7中泳道m为蛋白分子量marker，泳道a为1000μg/mlbsa；泳道b为500μg/mlbsa；泳道c为250μg/mlbsa；泳道d为125μg/mlbsa；泳道1～4为采用优化后的发酵参数发酵得到的产气荚膜梭菌毒素ε突变体蛋白。实施例88.1疫苗制备：制备四种不同佐剂疫苗，氢氧化铝胶疫苗、油包水佐剂疫苗(isa61)、水包油包水佐剂疫苗(isa201)、水包油佐剂疫苗(isa35a)，产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白etxh151a含量均为100μg/ml。8.2安全试验：用350～450g的豚鼠8只，分成4组，每组2只，肌肉注射每只2ml，观察豚鼠是否存活，注射部分是否有坏死。四种不同佐剂疫苗免疫后各组豚鼠均健活，注射部位没有坏死。8.3效力试验：用350～450g的兔子18只，分成4组，每组4只，通过肌肉注射4种疫苗，0.25ml/只，另外2只作为空白对照。免疫后21日进行d型产气荚膜梭菌强毒毒素(c60-2)攻毒。攻毒试验结果见表3，水包油佐剂疫苗免疫组4/4保护，效果最好。表3.攻毒试验结果最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。sequencelisting<110>天康生物股份有限公司<120>产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>328<212>prt<213>人工序列<400>1metlyslysasnleuvallysserleualailealaseralavalile151015seriletyrserilevalasnilevalserprothrasnvalileala202530lysgluileserasnthrvalserasnglumetserlyslysalaser354045tyraspasnvalaspthrleuileglulysglyargtyrasnthrlys505560tyrasntyrleulysargmetglulystyrtyrproasnalametala65707580tyrpheasplysvalthrileasnproglnglyasnaspphetyrile859095asnasnprolysvalgluleuaspglygluprosermetasntyrleu100105110gluaspvaltyrvalglylysalaleuleuthrasnaspthrglngln115120125gluglnlysleulysserglnserphethrcyslysasnthraspthr130135140valthralathrthrthralathrvalglythrserileglnalathr145150155160alalysphethrvalpropheasngluthrglyvalserleuthrthr165170175sertyrserphealaasnthrasnthrasnthrasnserlysgluile180185190thrhisasnvalproserglnaspileleuvalproalaasnthrthr195200205valgluvalilealatyrleulyslysvalasnvallysglyasnval210215220lysleuvalglyglnvalserglyserglutrpglygluileproser225230235240tyrleualapheproargaspglytyrlyspheserleuseraspthr245250255valasnlysseraspleuasngluaspglythrileasnileasngly260265270lysglyasntyrseralavalmetglyaspgluleuilevallysval275280285argasnleuasnthrasnasnvalglnglutyrvalileprovalasp290295300lyslysglulysserasnaspserasnilevallystyrargserleu305310315320serilelysalaproglyilelys325<210>2<211>987<212>dna<213>人工序列<400>2atgaaaaaaaatcttgtaaaaagtttagcaatcgcatcagcggtgatatccatctattca60atagttaatattgtttcaccaactaatgtaatagctaaggaaatatctaatacagtatct120aatgaaatgtccaaaaaagcttcttatgataatgtagatacattaattgagaaaggaaga180tataatacaaaatataattacttaaagagaatggaaaaatattatcctaatgctatggca240tattttgataaggttactataaatccacaaggaaatgatttttatattaataatcctaaa300gttgaattagatggagaaccatcaatgaattatcttgaagatgtttatgttggaaaagct360ctcttaactaatgatactcaacaagaacaaaaattaaaatcacaatcattcacttgtaaa420aatactgatacagtaactgcaactactactgctactgtgggaacttcgatacaagcaact480gctaagtttactgttccttttaatgaaacaggagtatcattaactactagttatagtttt540gcaaatacaaatacaaatactaattcaaaagaaattactcataatgtcccttcacaagat600atactagtaccagctaatactactgtagaagtaatagcatatttaaaaaaagttaatgtt660aaaggaaatgtaaagttagtaggacaagtaagtggaagtgaatggggagagatacctagt720tatttagcttttcctagggatggttataaatttagtttatcggatacagtaaataagagt780gatttaaatgaagatggtactattaatattaatggaaaaggaaattatagtgcagttatg840ggagatgagttaatagttaaggttagaaatttaaatacaaataatgtacaagaatatgta900atacctgtagataaaaaagaaaaaagtaatgattcaaatatagtaaaatataggagtctt960tctattaaggcaccaggaataaaataa987<210>3<211>328<212>prt<213>人工序列<400>3metlyslysasnleuvallysserleualailealaseralavalile151015seriletyrserilevalasnilevalserprothrasnvalileala202530lysgluileserasnthrvalserasnglumetserlyslysalaser354045tyraspasnvalaspthrleuileglulysglyargtyrasnthrlys505560tyrasntyrleulysargmetglulystyrtyrproasnalametala65707580tyrpheasplysvalthrileasnproglnglyasnaspphetyrile859095asnasnprolysvalgluleuaspglygluprosermetasntyrleu100105110gluaspvaltyrvalglylysalaleuleuthrasnaspthrglngln115120125gluglnlysleulysserglnserphethrcyslysasnthraspthr130135140valthralathrthrthrhisthrvalglythrserileglnalathr145150155160alalysphethrvalpropheasngluthrglyvalserleuthrthr165170175sertyrserphealaasnthrasnthrasnthrasnserlysgluile180185190thrhisasnvalproserglnaspileleuvalproalaasnthrthr195200205valgluvalilealatyrleulyslysvalasnvallysglyasnval210215220lysleuvalglyglnvalserglyserglutrpglygluileproser225230235240tyrleualapheproargaspglytyrlyspheserleuseraspthr245250255valasnlysseraspleuasngluaspglythrileasnileasngly260265270lysglyasntyrseralavalmetglyaspgluleuilevallysval275280285argasnleuasnthrasnasnvalglnglutyrvalileprovalasp290295300lyslysglulysserasnaspserasnilevallystyrargserleu305310315320serilelysalaproglyilelys325<210>4<211>26<212>dna<213>人工序列<400>4aaactatgaaaaaaaatcttgtaaaa26<210>5<211>31<212>dna<213>人工序列<400>5ttggcgcgccttattttattcctggtgcctt31当前第1页12