用于区分鉴别薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的SSR分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及植物分子标记技术领域，具体涉及用于区分鉴别薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的ssr分子标记及其应用。

背景技术：

薄壳山核桃(caryaillinoinensis)，是胡桃科(juglandaceae)山核桃属(carya)的植物，是具有较高经济价值的干果树种之一。薄壳山核桃果实出仁率高且营养丰富，是理想的营养和保健食品，同时也是重要的油料植物。

山核桃(c.cathayensis)、大别山山核桃(c.dabieshanensis)和湖南山核桃(c.hunanensis)与薄壳山核桃(c.illinoinensis)虽然同属于胡桃科山核桃属植物，但是在营养价值和经济价值方面与薄壳山核桃差距较大。而且，薄壳山核桃不完整的种仁与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的种仁在形态上很难区分，因此，容易造成山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃与薄壳山核桃种仁的混淆。

随着分子生物学的发展，利用分子手段进行植物的种质资源分析和品种鉴定已成为有效的方法，因此，开发能够区分鉴别薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的分子标记对于薄壳山核桃产品的生产和鉴别具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于区分鉴别薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的ssr分子标记及其应用。

为实现上述目的，本发明通过对薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的全基因组序列进行分析，寻找薄壳山核桃特异的且在不同薄壳山核桃品种中高度保守的简单重复序列(simplesequencerepeat，ssr)，开发能够将薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃区分的ssr分子标记。经大量序列分析和薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃样品的验证，最终得到能够将薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃有效区分的ssr分子标记，实现了利用2～4个ssr分子标记即可较为准确地区分薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃。

基于上述发现，本发明提供以下技术方案：

本发明提供用于区分鉴别薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的ssr分子标记，包括ssr-2和选自ssr-1、ssr-3、ssr-4中的一种或多种；其中，ssr-2由引物seqidno.3-4扩增得到，ssr-1由引物seqidno.1-2扩增得到，ssr-3由引物seqidno.5-6扩增得到，ssr-4由引物seqidno.7-8扩增得到。

以上所述的各引物序列如下：

本发明提供的上述4个ssr分子标记中，采用ssr-2以及选自ssr-1、ssr-3、ssr-4中的任一个即可实现薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的区分。

为进一步提高鉴别的准确性，可将ssr-2与选自ssr-1、ssr-3、ssr-4中的两种或三种联合使用进行鉴别。

作为本发明的一种优选方案，所述ssr分子标记包括ssr-2、ssr-1、ssr-3和ssr-4。

基于上述ssr分子标记，本发明进一步提供用于扩增所述ssr分子标记的引物组合，包括seqidno.3-4所示引物对以及选自seqidno.1-2、seqidno.5-6和seqidno.7-8所示引物对中的一对或多对。

对于以上所述的引物组合，以薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的种仁基因组dna为模板时，seqidno.1-2所示引物对的扩增产物长度为163～175bp，seqidno.3-4所示引物的扩增产物长度为264bp，seqidno.5-6所示引物的扩增产物长度为254～261bp，seqidno.7-8所示引物的扩增产物长度为268～280bp。

为便于检测，本发明所述的ssr分子标记的引物组合中的引物可采用荧光标记。可选的荧光标记包括但不限于rox、trama、fam等。

作为本发明的一种实施方式，以上引物组合中，seqidno.1所示引物采用rox标记，seqidno.2所示引物采用trama标记，seqidno.3所示引物采用fam标记，seqidno.4所示引物采用trama标记，seqidno.5所示引物采用trama标记，seqidno.6所示引物采用rox标记，seqidno.7所示引物采用rox标记，seqidno.8所示引物采用fam标记。

本发明还提供包含以上所述的引物组合的试剂盒。该试剂盒可用于区分鉴别薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃。

优选地，所述试剂盒还包括用于pcr扩增的其他成分，包括但不限于pcr反应缓冲液、dntp、dna聚合酶、阴性对照、阳性对照等。

作为本发明的一种优选方案，所述试剂盒包含seqidno.1-8所示引物。

本发明提供所述ssr分子标记或所述引物组合或所述试剂盒在区分鉴别薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃中的应用。

本发明提供所述ssr分子标记或所述引物组合或所述试剂盒在从薄壳山核桃、山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃四种山核桃种仁中鉴别薄壳山核桃种仁中的应用。

本发明还提供所述ssr分子标记或所述引物组合或所述试剂盒在薄壳山核桃种仁产品质量检测中的应用。

以上所述的质量检测包括但不限于薄壳山核桃种仁产品的山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃掺假等。

本发明还提供所述ssr分子标记或所述引物组合或所述试剂盒在薄壳山核桃遗传育种或种质资源鉴定中的应用。

本发明提供一种区分鉴定薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的方法，该方法具体为：以待测核桃的种仁基因组dna为模板，利用所述引物组合或包含所述引物组合的试剂盒进行pcr扩增，根据pcr扩增产物条带类型判断待测核桃是否为薄壳山核桃。

以上所述的pcr扩增的反应程序为：95℃、2～5min；95℃、1～2min，58℃、20～40s，72℃、20～40s，35个循环；72℃延伸3～10min。

优选的pcr扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性2min，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。

以上所述的pcr扩增的15μl反应体系为：2×pcr反应缓冲液7.5μl，正向引物1μl(浓度为10pmol/μl)，反向引物1μl(浓度为10pmol/μl)，dna模板1μl(浓度为50ng/μl)，ddh2o4.5μl。

以上所述的pcr扩增产物条带类型的检测可采用毛细管电泳进行检测。

以上所述的判断待测核桃是否为薄壳山核桃的方法为：若seqidno.3-4所示引物对能够扩增出264bp条带，seqidno.1-2所示引物对、seqidno.5-6所示引物对和seqidno.7-8所示引物对能够分别扩增出163～175bp、254～261bp和268～280bp条带，则待测核桃为薄壳山核桃；若seqidno.3-4所示引物对能够扩增出264bp条带，seqidno.1-2所示引物对、seqidno.5-6所示引物对和seqidno.7-8所示引物对未获得目标扩增条带，则待测核桃为山核桃、大别山山核桃或湖南山核桃。

具体地，本发明提供的区分鉴定薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的方法包括如下步骤：

(1)提取待测种仁样品基因组dna；

(2)使用seqidno.3-4所示引物对、seqidno.1-2所示引物对、seqidno.5-6所示引物对和seqidno.7-8所示引物对，分别对步骤(1)提取的基因组dna进行pcr扩增；

(3)使用琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)的pcr扩增产物；

(4)使用毛细管电泳的方法检测步骤(2)的pcr扩增产物条带大小；

(5)根据扩增产物的条带大小判断待测样品是否为薄壳山核桃种仁。

本发明的有益效果在于：

本发明首次开发了能够区分鉴别薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的4个ssr分子标记，其中1个ssr分子标记在薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃中均能够获得扩增，另外3个ssr分子标记为薄壳山核桃特异性分子标记，能够很好地将薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃区分开来。本发明用于开发和验证ssr分子标记有效性的薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃材料覆盖了目前已有的绝大部分薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃品种，因此，该ssr分子标记具有可靠性和重复性。

利用本发明提供的ssr分子标记进行薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的区分鉴别具有操作简单、重复性好、准确度高的优势，有效解决了利用形态等鉴别较难将薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的种仁进行区分的问题。

附图说明

图1为本发明实施例2中提取种仁基因组dna的电泳图，其中，泳道1～6为薄壳山核桃种仁样品，泳道7～11为山核桃种仁样品，泳道12～16为大别山山核桃种仁样品，泳道17～21为湖南山核桃种仁样品。

图2为本发明实施例2中引物组p3-1和p3-2对部分薄壳山核桃、山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃样品的pcr扩增产物电泳图，其中m为dnamarker，泳道1为薄壳山核桃种仁样品，泳道2～3为山核桃种仁样品，泳道4～5为大别山山核桃种仁样品，泳道6～7为湖南山核桃种仁样品。

图3a和图3b为本发明实施例2中引物组p1-1和p1-2对部分薄壳山核桃主栽品种(波尼和马罕)、山核桃良种(亚优xk89)、大别山山核桃和湖南山核桃样品的pcr扩增产物的毛细管电泳检测图，其中，薄壳山核桃品种波尼和马罕能够检测到目标产物(箭头指示)，山核桃、湖南山核桃、大别山山核桃不能检测到目标产物。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1用于区分鉴定薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的ssr分子标记的开发

本发明的用于区分鉴定薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的ssr分子标记开发的基本流程如下：

(1)对薄壳山核桃、山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的全基因组序列进行分析，寻找薄壳山核桃特异性的ssr分子标记，根据薄壳山核桃的全基因组序列设计、合成用于扩增ssr分子标记的引物。

(2)在中国主产区采集不同品种的薄壳山核桃(10个良种)、山核桃(2个良种和8个优良无性系)、大别山山核桃(不同区域的5个实生单株)和湖南山核桃(不同区域的5个实生单株)的完全成熟种仁。

(3)使用试剂盒法提取上述四种山核桃属植物不同材料的种仁基因组dna，使用0.8％～1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测提取dna的质量，使用核酸测定仪检测dna浓度。

(4)利用(1)中设计的ssr分子标记的引物对(3)中不同薄壳山核桃、山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃材料的基因组dna进行pcr扩增，pcr产物使用毛细管电泳进行检测。经对大量的ssr分子标记及其组合进行筛选，最终得到4个ssr分子标记，分别为ssr-1、ssr-2、ssr-3和ssr-4，依次由引物p1-1、p1-2(seqidno.1-2)、p2-1、p2-2(seqidno.3-4)、p3-1、p3-2(seqidno.5-6)和p4-1、p4-2(seqidno.7-8)扩增得到。

对于不同的薄壳山核桃、山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃材料，seqidno.3-4所示引物在薄壳山核桃、山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的种仁中均能够获得扩增产物，扩增产物长度为264bp，seqidno.1-2、seqidno.5-6和seqidno.7-8所示引物为薄壳山核桃特异性ssr分子标记，仅能够在薄壳山核桃中获得扩增产物，其中，seqidno.1-2所示引物的扩增产物长度为163～175bp，seqidno.5-6所示引物的扩增产物长度为254～261bp，seqidno.7-8所示引物的扩增产物长度为268～280bp。

合成经荧光标记的以上引物，具体地，seqidno.1所示引物采用rox标记，seqidno.2所示引物采用trama标记，seqidno.3所示引物采用fam标记，seqidno.4所示引物采用trama标记，seqidno.5所示引物采用trama标记，seqidno.6所示引物采用rox标记，seqidno.7所示引物采用rox标记，seqidno.8所示引物采用fam标记。

实施例2用于区分鉴定薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的ssr分子标记的应用

在中国的薄壳山核桃、山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃主产区采集完全薄壳山核桃、山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的成熟种仁，其中包括薄壳山核桃和山核桃各10个样品，大别山山核桃和湖南山核桃各5个样品，作为待测样品。

(一)ssr分子标记目标片段的扩增

1、种仁基因组dna的提取和检测：

使用tsingke植物dna提取试剂盒(通用型)提取种仁基因组dna，具体步骤如下：

(1)将吸附柱置于收集管中，加入250μlbufferbl，12000rpm离心1min以活化硅胶膜；

(2)取待测样品的种仁干燥组织(不大于20mg)，加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5ml离心管中，加入400μlbuffergp1，涡旋振荡1min，65℃水浴10-30min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；

(3)加入150μlbuffergp2，涡旋振荡1min，冰浴5min；

(4)12000rpm离心5min，将上清转移至新的离心管中；

(5)加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入吸附柱中，12000rpm离心30s，弃废液；

(6)向吸附柱中加入500μlbufferpw(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液；

(7)向吸附柱中加入500μlwashbuffer(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液；

(8)重复操作步骤7；

(9)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，开盖晾干1min；

(10)取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加50～100μltebuffer(65℃预热tebuffer)，20～25℃放置2min，12,000rpm离心2min。

(11)使用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna质量，使用紫外分光光度计检测基因组dna浓度(图1)。

2、ssr片段的pcr扩增

以提取的不同样本种仁基因组dna为模板，分别使用引物组1(p1-1和p1-2)、引物组2(p2-1和p2-2)、引物组3(p3-1和p3-2)和引物组4(p4-1和p4-2)对不同样本进行pcr扩增，pcr反应体系如下：

pcr反应条件如下：

(二)ssr分子标记的目标片段检测

1、琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物

(1)配制1％的琼脂糖凝胶，吸取2μl上述(一)中得到的扩增产物混合0.5μl溴酚蓝上样，300v电压下12分钟。

(2)在紫外灯下观察电泳结果并拍照(图2)。

2、毛细管电泳检测条带大小

(1)将abihidiformamide与abigenescan500lizsizestandard的内标按130：1混合，配成混合液。

(2)用国产96孔反应板分装mix，每个孔中加入10μl混合液。

(3)在96孔板中对应加入0.5μlpcr样品，离心到4000rpm即停。

(4)用金属浴加热器将混合板95℃加热预变性5分钟，取出后立即放入-20℃。

(5)冷却后取出，4000rpm离心，解冻、混匀。

(6)上样至3730测序仪进行毛细管电泳。

(7)使用软件genemapper4.1分析ssr分子标记扩增产物位点信息(图3a和图3b)。

四种不同山核桃种仁样品获得的扩增产物条带大小的检测结果如表1所示。

表1四对引物扩增四种不同山核桃种仁获得的条带大小

表1中“.”代表未扩增出片段。

(三)根据ssr分子标记分型结果判断待测样品是否为薄壳山核桃种仁

1、ssr目标条带的判读

(1)引物组p1-1和p1-2

引物组p1-1和p1-2在薄壳山核桃种仁基因组dna中获得的目标条带大小为163bp～175bp，在浙江山核桃、湖南山核桃和大别山山核桃种仁基因组dna中不能扩增出目标条带(表1，图3a和图3b)。

(2)引物组p2-1和p2-2

引物组p21-1和p21-2在四种山核桃种仁基因组dna均能扩增获得264bp的目标条带(表1)。

(3)引物组p3-1和p3-2

引物组p3-1和p3-2在薄壳山核桃种仁基因组dna中获得的目标条带大小为254bp～261bp，在浙江山核桃、湖南山核桃和大别山山核桃种仁基因组dna中不能扩增出目标条带(表1)。

(4)引物组p4-1和p4-2

引物组p4-1和p4-2在薄壳山核桃种仁基因组dna中获得的目标条带大小为270bp～280bp，在浙江山核桃、湖南山核桃和大别山山核桃种仁基因组dna中不能扩增出目标条带(表1)。

2、样品是否为薄壳山核桃种仁的判定

(1)判定为薄壳山核桃种仁

若引物组p1-1和p1-2，引物组p2-1和p2-2，引物组p3-1和p3-2，引物组p4-1和p4-2均能在待测样品基因组dna中扩增获得目标条带，则判定该样品为薄壳山核桃种仁(表2)。

(2)判定为非薄壳山核桃种仁

若引物组p2-1和p2-2能够在待测样品基因组dna中扩增得到目标条带，而引物组p1-1和p1-2，引物组p2-1和p2-2，引物组p3-1和p3-2无法扩增得到目标条带，则判定该样品非薄壳山核桃种仁(表2)。

表2待测种仁样品是否是薄壳山核桃种仁的判定标准

对比例1

使用与ssr-1、ssr-2、ssr-3和ssr-4均不同的另外四个ssr分子标记(扩增引物如seqidno.9-16)的组合对薄壳山核桃样品与山核桃、湖南山核桃和大别山山核桃进行区分鉴别，具体方法和结果如下：

使用引物组p5-1(gttgcaagcataacttgtaacca)和p5-2(tcaaaccaaaccaacaagca)，引物组p6-1(tgtgtcgtgcaacgtttgt)和p6-2(tcttcgtagaatgacgcttcc)，引物组p7-1(tgccgtcataggaagaaagg)和p7-2(aaagccatttggcacgttag)，引物组p8-1(gcgccgttatggatttaaga)和p8-2(gcatcttcttaccgagcgag)，对薄壳山核桃样品以及山核桃、湖南山核桃和大别山山核桃样品进行pcr扩增。

结果如表3所示，结果表明，采用上述ssr分子标记组合不能实现薄壳山核桃样品与山核桃、湖南山核桃和大别山山核桃的有效区分。

表3另外4对引物对不同山核桃样品的扩增结果

表3中“.”代表未扩增出片段。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国林业科学研究院亚热带林业研究所

<120>用于区分鉴别薄壳山核桃与山核桃、大别山山核桃和湖南山核桃的ssr分子标记及其应用

<130>khp201114970.5

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tctgtagtggatgctaaatgcaa23

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcattggcattggtttctct20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

agccttggagcacagaccta20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

accattagacgattccgtgg20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

catgagtggcagatgaatgg20

<210>6

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<212>dna

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<400>6

ggcgagtgcaaagaagaaga20

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<212>dna

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<400>7

tgcttcccagccaatactct20

<210>8

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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ccgtgggatttagtgaatgg20

<210>9

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gttgcaagcataacttgtaacca23

<210>10

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

gttgcaagcataacttgtaacca23

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tgtgtcgtgcaacgtttgt19

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tgccgtcataggaagaaagg20

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gcgccgttatggatttaaga20

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

gcatcttcttaccgagcgag20