一组检测不同基因型猪圆环病毒的引物探针组及试剂盒的制作方法

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一组检测不同基因型猪圆环病毒的引物探针组及试剂盒。

背景技术：

猪圆环病毒(pcv)是一种基因组为环状、单链的dna病毒，根据基因组特征，目前已发现pcv1、pcv2、pcv3和pcv4四种基因型。其中，pcv1可在猪群中检出，但不致病；pcv2是引起猪断奶后衰竭综合症的主要病原；pcv3是一种与母猪皮炎综合征和繁殖障碍相关的病毒；最新报道的基因型pcv4可能与呼吸道症状、肠道症状以及猪皮炎与肾病综合征相关。在生产实际中，pcv2、pcv3、pcv4的鉴别诊断具有重要的临床意义，因此，利用新型病原学检测技术，建立快速鉴别检测方法用于pcv病原快速鉴定是有效、精准防控疫情的技术关键。但目前，尚未有同时检测pcv2、pcv3和pcv4的实时荧光pcr方法报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一组检测不同基因型猪圆环病毒的引物探针组及试剂盒。本发明所述引物探针组能够快速鉴别pcv相关病毒感染，可通过一个反应鉴别pcv2、pcv3和pcv4，具有重要的临床使用价值。

本发明提供了一组检测不同基因型猪圆环病毒的引物探针组，所述不同基因型猪圆环病毒包括猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型，检测猪圆环病毒2型的引物探针包括：核苷酸序列如seqidno.1所示的pcv2上游引物、核苷酸序列如seqidno.2所示的pcv2下游引物和核苷酸序列如seqidno.3所示的pcv2荧光素标记探针；检测猪圆环病毒3型的引物探针包括：核苷酸序列如seqidno.4所示的pcv3上游引物、核苷酸序列如seqidno.5所示的pcv3下游引物和核苷酸序列如seqidno.6所示的pcv3荧光素标记探针；检测猪圆环病毒4型的引物探针包括：核苷酸序列如seqidno.7所示的pcv4上游引物、核苷酸序列如seqidno.8所示的pcv4下游引物和核苷酸序列如seqidno.9所示的pcv4荧光素标记探针；不同基因型猪圆环病毒的荧光素标记探针的荧光报告基团属于不同检测通道。

优选的是，所述荧光报告基团包括fam、vic、hex、joe、ned、tamra、cy3、rox和cy5。

优选的是，所述不同基因型猪圆环病毒的荧光素标记探针的猝灭基团包括bhq。

本发明还提供了基于上述技术方案所述引物探针组的检测不同基因型猪圆环病毒的试剂盒，所述试剂盒包括：酶混合液和含上述技术方案所述引物探针组的pcr反应液；所述酶混合液包括0.5u/μl的taqdna聚合酶、20mm的tris-hcl、0.05mm的edta、0.05mm的dtt、体积百分含量为40％的甘油和体积百分含量为0.2％的tween-20；所述pcr反应液包括：10μm的各上游引物、10μm的各下游引物、5μm的各探针、反应缓冲液10mm的tris-hcl、1.5mm的dntps和ddh2o。

优选的是，所述试剂盒为多重实时荧光pcr试剂盒。

优选的是，每20μl所述试剂盒的反应体系包括10μl的酶混合液、8μl的pcr反应液和2μl的待测样品。

优选的是，所述待测样品包括血清、组织、粪便和环境拭子。

优选的是，所述试剂盒的反应条件为：95℃30sec；40个循环，每个循环为95℃5sec，62℃30sec；每个循环的第二步收集荧光信号。

本发明提供了一组检测不同基因型猪圆环病毒的引物探针组。本发明分别以pcv2、pcv3、pcv4rep基因为靶标，设计引物与探针，建立三重实时荧光pcr方法，优化pcr反应体系与反应条件，开发的试剂和具有灵敏度高、特异性好，稳定性强等技术优势，同时使用方便，可大幅缩短反应时间，具有良好的临床应用价值。本发明所述引物探针组及其试剂盒能够同时检测临床中不同基因型的猪圆环病毒，克服传统单一pcr反应时间长、敏感度低等技术缺陷，实现在短时间内一次检测多种猪圆环病毒，具有重要的临床实用价值和广阔的市场应用前景。

附图说明

图1为本发明提供的pcv2、pcv3和pcv4特异性荧光扩增曲线。

具体实施方式

本发明提供了一组检测不同基因型猪圆环病毒的引物探针组，所述不同基因型猪圆环病毒包括猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪圆环病毒4型，检测猪圆环病毒2型的引物探针包括：核苷酸序列如seqidno.1所示的pcv2上游引物、核苷酸序列如seqidno.2所示的pcv2下游引物和核苷酸序列如seqidno.3所示的pcv2荧光素标记探针；检测猪圆环病毒3型的引物探针包括：核苷酸序列如seqidno.4所示的pcv3上游引物、核苷酸序列如seqidno.5所示的pcv3下游引物和核苷酸序列如seqidno.6所示的pcv3荧光素标记探针；检测猪圆环病毒4型的引物探针包括：核苷酸序列如seqidno.7所示的pcv4上游引物、核苷酸序列如seqidno.8所示的pcv4下游引物和核苷酸序列如seqidno.9所示的pcv4荧光素标记探针；不同基因型猪圆环病毒的荧光素标记探针的荧光报告基团属于不同检测通道。具体引物探针组的序列详见表1。

表1引物探针组的序列

在本发明中，所述荧光报告基团包括fam、vic、hex、joe、ned、tamra、cy3、rox和cy5。在本发明具体实施例中，pcv2荧光素标记探针优选使用rox标记，pcv3荧光素标记探针优选使用hex标记，pcv4荧光素标记探针优选使用fam标记。在本发明中，所述不同基因型猪圆环病毒的荧光素标记探针的猝灭基团包括bhq。

本发明还提供了基于上述技术方案所述引物探针组的检测不同基因型猪圆环病毒的试剂盒，所述试剂盒包括：酶混合液和含上述技术方案所述引物探针组的pcr反应液；所述酶混合液包括0.5u/μl的taqdna聚合酶、20mm的tris-hcl、0.05mm的edta、0.05mm的dtt、体积百分含量为40％的甘油和体积百分含量为0.2％的tween-20；所述pcr反应液包括：10μm的各上游引物、10μm的各下游引物、5μm的各探针、反应缓冲液10mm的tris-hcl、1.5mm的dntps和ddh2o。含本发明所述引物探针组的试剂盒灵敏、便捷、特异性强、敏感性高、可靠性好，只需一次检测便能判定样本是否含有不同基因型的猪圆环病毒，可以同时进行大批量的样本分析，为猪圆环病毒疫情的监测、防控提供有力的技术支持，有很好的应用前景。本发明通过建立多组分微量组合工艺技术，即将试剂盒原有多种化学试剂成分组配成2类(酶混合液和pcr反应液)：合并酶反应试剂，优化各组分比例；合并pcr反应液，优化各组分比例；提高了试剂盒的便捷性与灵敏度。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括阳性对照和阴性对照。本发明所述阴性对照优选为水，无ct值并且无特异性扩增曲线；本发明所述阳性对照优选为采用常规质粒合成方法合成的质粒(本发明对所述质粒的类型没有特殊限定)，所述质粒优选分别包括pcv2sz毒株(genbank:kx845694.1)、pcv329160毒株(genbank:nc_031753.1)、pcv4hnu-ahg1-2019毒株(genbank:mk986820.1)的rep基因部分序列。阳性对照各通道荧光ct值均应≤35，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。

pcv2rep部分序列：

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本发明试剂盒可针对不同类型血清样本如血清、组织、粪便、环境拭子进行检测。

在本发明中，所述试剂盒为多重实时荧光pcr试剂盒。多重pcr检测方法对引物和探针的特异性要求较高，存在非特异假阳性结果。本发明所述特异性引物、探针特异性好，与其它猪病病原无非特异性扩增。

在本发明中，每20μl所述试剂盒的反应体系包括10μl的酶混合液、8μl的pcr反应液和2μl的待测样品。本发明具体优化了反应体系至20μl，反应时间缩短至40分钟，更便于临床样品中针对上述三种圆环病毒快速、精准地检测

在本发明中，所述试剂盒的反应条件为：95℃30sec；40个循环，每个循环为95℃5sec，62℃30sec；每个循环的第二步收集荧光信号。

在本发明中，所述试剂盒的结果判定方法优选包括以下步骤：

阴性样品无ct值并且无特异性扩增曲线，表示阴性样本中无猪圆环病毒；

阳性样本ct值≤35，且出现特异性扩增曲线，表示阳性样本中有相应的猪圆环病毒；

有效原则：样本ct值在35＜ct＜37之间时需要进行重复试验。重复试验结果ct＜37时样品为阳性，否则为阴性。

下面结合具体实施例对本发明所述的一组检测不同基因型猪圆环病毒的引物探针组及试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

引物、探针组合的设计与筛选

1、引物设计

根据pcv2sz毒株(genbank:kx845694.1)、pcv329160毒株(genbank:nc_031753.1)、pcv4hnu-ahg1-2019毒株(genbank:mk986820.1)分别设计引物和探针，如表2。

表2引物/探针设计

2、实时荧光pcr方法的反应体系优化

优化原则是：通过优化以下各个条件使同一样本获得最大的扩增效率和最小的ct值。优化后的反应体系如表3。

表3优化后的反应体系组成

3、多重实时荧光pcr方法的反应条件，如表4

表4多重实时荧光pcr方法的反应条件

4、结果

(1)结果分析条件设定

读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。

(2)质控标准

阴性对照为水，无ct值并且无特异性扩增曲线；

阳性对照为合成质粒，该质粒包括pcv2sz毒株(genbank:kx845694.1)、pcv329160毒株(genbank:nc_031753.1)、pcv4hnu-ahg1-2019毒株(genbank:mk986820.1)rep基因部分序列。阳性对照各通道荧光ct值均应≤35，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。

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pcv4rep部分序列：

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(3)结果描述及判定

阴性样品无ct值并且无特异性扩增曲线，表示阴性样本中无猪圆环病毒。

阳性样本ct值≤35，且出现特异性扩增曲线，表示阳性样本中有相应的猪圆环病毒。

有效原则：样本ct值在35＜ct＜37之间时需要进行重复试验。重复试验结果ct＜37时样品为阳性，否则为阴性。

实施例2

实时荧光pcr方法特异性验证

试验对猪瘟病毒(csfv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、日本乙型脑炎病毒(jev)、猪伪狂犬病毒(prv)和猪细小病毒(ppv)进行扩增，结果均为阴性。只有pcv2、pcv3和pcv4得到特异性的荧光扩增曲线(如图1所示)，分别为红色(最上边两条)、蓝色(中间两条)和灰色曲线(最下边两条)，ct值分别为23.58、23.61(pcv2)、30.05、30.82(pcv3)和34.17、34.25(pcv4)。

结果表明：本发明试剂盒建立的实时荧光pcr方法具有良好的特异性，不与其他猪病病原发生交叉反应。

实施例3

实时荧光pcr方法敏感性验证

将pcv2、pcv3和pcv4质粒作为模板连续10倍稀释后用于pcr检测，pcv2、pcv3和pcv4的检测下限分别为10拷贝、15拷贝和25拷贝。

结果表明：本发明试剂盒建立的实时荧光pcr方法具有良好的敏感性。

实施例4

不同样品类型的检测

取临床pcv疑似阳性组织样品，包括猪血清、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑、淋巴、小肠进行检测，结果表明pcv2在上述所有类型样品均可以检测到；pcv3在除小肠样品以外所有样品均有检测到；而pcv4在上述所有类型样品均可以检测到，检测结果见表5。结果显示pcv2、pcv3、pcv4对猪不同器官具有泛嗜性。

表5临床疑似pcv感染样品的检测

实施例5

试剂盒的临床应用，检测结果如表6所示。

表6临床检测结果

结果表明，在上述48份样品中，pcv2阳性率最高，检出率为93.75％；pcv3阳性率较高，检出率为37.50％；pcv4检出率为25.00％。根据本发明的检测结果可知，pcv2广泛流行，pcv3和pcv4作为新型圆环病毒，开始在我国流行，可见，本发明试剂盒在pcv2、pcv3和pcv4的临床检测方面有着很好的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>扬州大学

<120>一组检测不同基因型猪圆环病毒的引物探针组及试剂盒

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