一种基于干种子膜高透性的小麦转基因方法与流程

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本发明属于小麦种子转基因领域，具体地说是一种基于干种子膜高透性的 小麦转基因方法。


背景技术：

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目前，科学研究用的小麦转基因方法主要有以下方式，第一大类是基于组 织培养再生体系的小麦转基因方法，2000年安海龙等报道高频幼胚高效再生系 统，未成熟胚成功转化的报道也较多，目前研究人员在小麦再生培养转化过程 中，找到了cb037品系，比较适合于做转化，成功概率高于其他品系，卢杰报 道超低温保存小麦茎尖的可以直接转化dna，但是成功效率较低。雷代丽等通过 基因枪介导转化长武134及郑引1号的幼胚愈伤组织获得了转基因植株，闫栋 2018年通过成熟胚切割再生方式获得永春2460小麦转基因株系。1991年 p.alazzeri等报道了通过大麦peg介导原生质体转化法，1998年f.barro研究 报道了小麦通过改进生长素类激素再生方法获得转化外植体；altpeter f等通 过再生方式获得了小麦转基因植株。小麦的转基因技术虽然能够获得成功，但 是整体上技术要求较高，基于再生体系的转基因方法受品种基因型的影响较大。 苗端转化和茎尖转化难度略高，方法较为简单，但转化受苗大小及操作技术的 影响较大。
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小麦转基因常用的组织培养途径技术门槛较高，导致失败的因素很多，列 举如下：
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第一，要用小麦成熟或未成熟胚进行愈伤组织的诱导，成熟胚诱导前处理 不好会直接成苗；未成熟胚做材料受种子发育时期短的限制，时期很容易错过。
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第二，把胚切割后诱导愈伤组织，胚材料快很小，经常因为消毒等问题愈 伤组织生长不是很好，再生植株是从愈伤组织的单个细胞分化出的植株或芽， 分化成苗的概率一般都比较低；
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第三，系统稳定问题，即使芽分化条件筛选好了，还存在激素等敏感试剂 每批药品的批次影响问题，浓度变化一点都会影响分化成苗的概率。
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第四，分化成的苗必须是在愈伤组织侵染时被农杆菌感染发生转化了的细 胞，没有转化的细胞分化成了苗也不能用，这是最核心的问题。受农杆菌侵染 成功的细胞比例本就不高，且侵染后生长是受影响了的，再分化成苗的概率还 会降低。
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第五，转化后还要进行农杆菌的抑制，持续的用抗生素筛选，防止污染， 农杆菌抑制不住会导致组织死亡；抑制浓度过高对植株生长不利。
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第六，组织培养的杂菌污染是非常常见的问题，即使再成熟的技术能手， 也有个别瓶的污染，初学者，污染比例常常非常高，污染也常常导致培养材料 不得不丢弃。
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第七，转基因芽还要诱导出根，并且能够成功定植到田间才能收获种子， 从培养瓶到田间的过程也存在比较大的死亡风险，管理上要非常细心，技术合 理。
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第七，有些品种很难诱导出再生芽，难于通过这条途径做转基因成功。
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由于以上问题，转基因操作一般都要进行相当长的时间，经过不止一批的 实验才
能获得满足要求的转化成活植株。
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其他方法如苗端转化法，利用农杆菌侵染小麦幼苗被切割的苗端，如果苗 端生长点被完全切割就很难再长出来，切割时若保留一段长度，就达不到生长 点分化的部位，切割后菌液侵染叶片的可能性较大，但分化部位的细胞本身是 良好的细胞，没有伤口就很难进入，要切割到刚好是生长点细胞层的部位，还 要对细胞造成伤害才能使农杆菌入侵生长点细胞，伤口过大还会导致细胞死亡， 因此，苗端法比较容易得到嵌合体，得到转化的种子就比较难了。尽管如此， 研究者还是愿意避开组织培养采用这类转化方法。


技术实现要素：

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本发明提供一种基于干种子膜高透性的小麦转基因方法，用以解决现有技 术中的缺陷。
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本发明通过以下技术方案予以实现：
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一种基于干种子膜高透性的小麦转基因方法，包括如下步骤：
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步骤一：种子处理，选取新收获的小麦种子或发芽率大于95％的高活力小 麦种子，通过干燥器贮藏10d及10d以上备用，转化前2d，用锋利的小刀在小 麦种子胚外削去胚外种皮，露出淡黄色的胚，取28号采血针在胚的生长点部位 轻轻刺伤，处理后及时放回干燥器内；
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步骤二：侵染用菌液的制备及种子侵染处理，采用含植物表达双元载体的 土壤农杆菌lba4404作为侵染用菌，先用含kan50μg/ml，rif25μg/ml的yep 培养基对单菌落进行扩大培养至菌液浑浊，提取1ml菌液转移至50ml的yep培 养基中进行接种培养，28℃黑暗震荡培养约8h，低温离心收集菌体，并用1/2ms 培养液清洗菌液，再次低温离心收集，最后加入含终浓度0.02％的silwet和200 μmol/l的乙酰丁香酮的1/2ms稀释菌液，调成600nm吸光度在0.8～1.2范围内， 在50ml离心管里制备好后，加入干燥器刚取出的刺伤过的种子，菌液要没过种 子，浸泡50-60min；浸泡过程可以间歇地颠倒离心管混匀；
[0019]
步骤三：发芽及筛选管理，取一张灭菌处理过的滤纸，无菌水润湿将浸泡 过的种子沿着中间胚向下摆放成一行，间距0.5cm，摆好后上盖一层灭菌卫生纸， 卷成纸卷放入发芽盒中。25℃黑暗培养1.5-2.0d，打开发芽盒盖，喷施抗生素， 要求载体对应的抗生素，本实验是潮霉素抗性，因为纸卷内原来有水，首次潮 霉素浓度150ug/ml，后续的75ug/ml潮霉素筛选培养，把卫生纸折回，让芽见 光，并保持低于15℃的温度生长，连续喷施潮霉素约3次，至定植；
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步骤四：栽培及转基因苗的筛选，筛选后的幼苗定植到田间，正常管理， 第二年夏季收获种子，对种子进行抗性筛选，本实施例是潮霉素抗性的载体， 用潮霉素筛选，萌发后的种子放于较低的温度下培养，加上潮霉素，根发黄或 变褐色的弃掉，根白嫩的保留，对保留的幼苗进行pcr检测和标记荧光检测鉴 定，阳性的幼苗保留至收获种子。
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如上所述的一种基于干种子膜高透性的小麦转基因方法，所述的步骤一的 操作中不能有水介入，器具使用前均要消毒。
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如上所述的一种基于干种子膜高透性的小麦转基因方法，所述的步骤二中 的菌液中含有土壤农杆菌和对应于农杆菌的植物表达载体。
[0023]
如上所述的一种基于干种子膜高透性的小麦转基因方法，所述的步骤二中 的菌
液中含有筛选标记和报告基因。
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如上所述的一种基于干种子膜高透性的小麦转基因方法，所述的农杆菌为 土壤农杆菌lba4404的两个载体报告基因分别含有gfp和cherry。
[0025]
如上所述的一种基于干种子膜高透性的小麦转基因方法，所述的土壤农杆 菌lba4404。
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如上所述的一种基于干种子膜高透性的小麦转基因方法，所述的步骤二中 的1/2ms大量元素培养基，1/2ms大量元素培养基使用前加入至终浓度0.02％的 silwet和200μmol/l的乙酰丁香酮。
[0027]
如上所述的一种基于干种子膜高透性的小麦转基因方法，所述的乙酰丁香 酮需用甲醇溶解后添加。
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如上所述的一种基于干种子膜高透性的小麦转基因方法，所述的步骤三中 的发芽材料处理为大张滤纸裁成6-8cm宽的长条，卫生纸整卷裁成4-6cm宽， 发芽用的发芽盒用70％酒精擦拭消毒，所有用具均用酒精擦拭过，晾干后方可使 用。
[0029]
本发明的优点是：本发明采用直接对种子进行转基因培养，方法简便，无 论会不会组织培养都能做，便于操作，成功率高，得到转化的种子收获率高。 干种子细胞膜通透性较高，膜系统存在一定的渗透性，小麦干种子的正常含水 量12％-13％，干燥器存放的种子一般可以达到8％左右的含水量，渗透性进一步 加大，种子含水量过低对细胞膜的影响更大，由于过分干燥的种子膜系统对修 复要求高，在缓慢吸湿过程中才可以得到修复，直接吸胀萌发会导致一定的伤 害，活力越低的种子伤害越大，高活力的种子仍然可以萌发。利用干燥种子细 胞膜透性升高，辅助以一定的外伤促进农杆菌进入胚目标部位的细胞内，实现 侵染，通过抗生素等筛选试剂筛选可以获得含转化细胞的嵌合体，继续分裂的 转化细胞最终有机会形成新的种子，从而获得转基因后代。种子一般常放入干 燥器保存，种子处理简便，在筛选管理的10d左右时间需要花功夫，其他时间 基本同正常田间管理。药品试剂为一般转基因常用试剂，不受品种基因型的限 制，任何品种都可以做，只要种子活力较好即可。一次可以做多个载体，操作 简单，幼苗定植前筛选足够长的时间能获得更高的转化率。育种者创新种质资 源批量做也不难实现。
附图说明
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为了更清楚地说明本发明实施现有技术中的技术方案，下面将对实施例或 现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，使过程更显而易见，下面 描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得有参考的信息。
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图1是本发明的小麦种子胚的活体切片染色示意图；
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图2是本发明的潮霉浓度处理后的小麦生长状态示意图；
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图3是本发明的转基因过程中萌发后抗生素筛选后的小麦苗示意图；
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图4是本发明的基因过程中幼苗定植前的培养状态示意图；
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图5是本发明的获得的种子经过潮霉素筛选后的幼苗展开观察和挑选过程 示意图；
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图6是本发明的转基因pcr检测结果示意图。
具体实施方式
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为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明 实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然， 所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中 的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。
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实施例
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(1)种子处理
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本研究采用高活力的种子(如新收获的种子或发芽率大于95％的高活力种 子)，通过干燥器贮藏10d以上，取一部分通过烘干法测定的种子含水量约8％， 这种干燥度的种子可以用于做转化的材料。转化前2d，用锋利的小刀在小麦种 子胚外削去胚外种皮，露出淡黄色的胚，取28号采血针在胚的生长点部位轻轻 刺伤。以上步骤不可以沾水，除了种子外，材料用具要消毒，削皮刺伤处理后 的种子放入牛皮纸袋，继续放在干燥器内。
[0041]
(2)侵染用菌液的制备及种子侵染处理
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采用含植物表达载体的土壤农杆菌lba4404作为侵染用菌，先用含kan50 μg/ml，rif25μg/ml的yep培养基对单菌落进行扩大培养至菌液浑浊，培养 后向含有约50mlyep的150ml锥形瓶接种1ml菌种，28℃黑暗震荡培养约8h， 在600nm下测定菌液吸光度约0.6-0.8时可以准备接种液。预先制备1/2ms大 量元素灭菌备用，使用前，加入至终浓度0.02％的silwet(每100ml加入20μl) 和200μmol/l的乙酰丁香酮(需甲醇溶解粉末)，菌液低温离心收集，制备后 的菌液浓度od600＝0.8-1.2。菌液制备好后在50ml离心管里，加入干燥器取出 的种子，菌液没过种子即可，浸泡50min～1h。
[0043]
本发明所用两个载体报告基因分别含有gfp和cherry。
[0044]
(3)发芽材料的准备
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大张滤纸裁成6-8cm宽的长条，卫生纸整卷裁成4-6cm宽，将上述纸预先 用报纸包好高压灭菌，蒸馏水装入锥形瓶中-高压灭菌。发芽用的发芽盒或白瓷 盘用70％酒精消毒。所有用具均用酒精擦拭过，晾干可用。
[0046]
(4)发芽及筛选管理
[0047]
取一张滤纸，无菌水润湿将浸泡过的种子沿着中间胚向下摆放成一行，间 距0.5cm左右，摆好后上盖一层卫生纸，卷成纸卷放入发芽盒中。胚侧的纸在 下方，25℃黑暗培养1.5d-2.0d，打开发芽盒盖，喷施抗生素，首次潮霉素浓度 150ug/ml，后续的75ug/ml潮霉素筛选培养，把上面盖住种子的卫生纸折回， 让芽可以见光，并保持低于15℃的温度生长，连续喷施潮霉素3次，至定植。 本研究筛选了7d，延长筛选时间效果更好，定植前去掉发芽的滤纸，最后喷施 一次潮霉素。
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(5)栽培及转基因苗的筛选
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田间同一般小麦管理，第二年夏季收获种子，对种子进行发芽及潮霉素筛 选，萌发后的种子放于较低的温度下培养，加上潮霉素，凡是根发黄的弃掉， 根比较白嫩的保留，对保留的幼苗进行pcr检测和标记荧光检测鉴定，只有根 可以检测红色荧光，绿色荧光只能检测原生质体，阳性的幼苗保留至收获种子。
[0050]
注意事项：
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1.由于干种子细胞膜透性高，所以整个发芽过程消毒工作做好很重要，以 防止杂
菌污染，种子萌发初期没有足够的抗性，外渗有机质较多，预防杂菌滋 生很重要。
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2、要用干燥和活力高的种子，提高发芽率和筛选的耐受性。
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3、抗生素筛选液或除草剂筛选液要浸润整张发芽纸，保持幼苗与抗生素筛 选液有充分的接触。
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计算转基因实验的消耗及效率
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转化一次需要干种子15-25g，约400-600粒左右，筛选用1-2个发芽盒， 定植晚的后期用约长60cm宽40cm的塑料盘就可以满足幼苗培育的需要，田间 一个材料用地约1.5-2平方米。本次实验收获了较多的种子，筛选所用的种子 量为250g，6250粒左右，抗生素筛选后选择约45株，田间定植后共41株成活 并结出种子，对其进行pcr检测，有与阳性对照(转化用的质粒，用ck+表示) 同一位置-扩增带的为转化植株，与阴性对照(未转基因小麦，用ck-表示)同一 位置有模糊条带的是扩增正常的株系，两条带都没有的是扩增不成功的。通过 图6的检测结果可以得知6、15、32、33、41为阴性，其他号均扩增出过阳性 条带，pcr检测这41株共有87.8％的有阳性扩增带，12.2％阴性，获取的36株 转基因株系可以满足表达筛选，基因功能研究的需要。
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最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限 制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员 应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其 中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的 本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。