干扰柑橘木虱卵黄蛋白原基因表达的转基因生防真菌及其制备方法和应用与流程

文档序号:23223795发布日期:2020-12-08 15:07阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种柑橘木虱卵黄蛋白原基因rnai载体,包括骨架载体和发夹结构,其特征在于:所述发夹结构为ihprna表达盒,所述ihprna表达盒的结构为ptrpc启动子+正向目的基因片段+intron+反向目的基因片段+ttrpc终止子结构,所述目的基因片段为柑橘木虱卵黄蛋白原基因保守序列dcvg1a或dcvg1b;所述骨架载体为丝状真菌表达载体。

2.如权利要求1所述的柑橘木虱卵黄蛋白原基因rnai载体,其特征在于:所述丝状真菌表达载体是利用pdmⅰ或者xmnⅰ、和pstⅰ2种酶对prcy1载体进行酶切,获得含有hygr、intron片段的线性载体,再利用重组位点将ptrpc启动子+egfp片段连入prcy1线性载体中得到的。

3.如权利要求2所述的柑橘木虱卵黄蛋白原基因rnai载体的构建方法,其特征在于:采用一步克隆法将ptrpc启动子+egfp基因片段连接到丝状真菌表达载体prcy1中获得prcy3,用一步克隆法将目的基因的正向片段转入prcy3载体启动子和intron之间,然后用一步克隆法转入反向片段,即得。

4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述ptrpc启动子+egfp基因片段是以prcy2a为模板,设计含有xmnⅰ和pstⅰ酶酶切位点的引物,进行pcr扩增得到;

利用pdmⅰ或者xmnⅰ、和pstⅰ2种酶对prcy1载体进行酶切获得线性载体,利用重组位点用一步克隆法将得到的ptrpc启动子+egfp片段连入prcy1线性载体中,构建成含有egfp、intron结构的丝状真菌双元载体prcy3;

先将prcy3载体进行xhoⅰ和smiⅰ双酶切,然后将目的基因的正向片段连入双酶切后的prcy3,然后将连接有正向片段的载体用xbai和bamhi进行酶切后连入对应的反向目的片段。

5.权利要求1或2所述的rnai载体在防治柑橘木虱中的应用、在制备防治柑橘木虱的产品中的应用、在制备转基因生防真菌中的应用;

优选所述生防真菌为渐狭蜡蚧菌。

6.一种转基因生防真菌,其特征在于:是采用权利要求1或2所述的rnai载体转化生防真菌得到。

7.如权利要求6所述的转基因生防真菌,其特征在于:所述生防真菌为渐狭蜡蚧菌,所述转化是由农杆菌介导;

优选所述农杆菌为agl1。

8.权利要求6或7所述的转基因渐狭蜡蚧菌的制备方法,其特征在于:采用权利要求1或2所述的rnai载体转化农杆菌,随后利用诱导培养法将农杆菌诱导培养后与生防真菌孢子悬浮液共培养,分离、检测验证,得到转基因成功的生防真菌菌株。

9.权利要求6或7所述的转基因生防真菌在防治柑橘木虱中的应用、在制备防治柑橘木虱的产品中的应用。

10.一种柑橘木虱防治制剂,其特征在于:包含权利要求1或2所述的rnai载体,或者权利要求6或7所述的转基因生防真菌。


技术总结
本发明公开了一种柑橘木虱卵黄蛋白原基因RNAi载体及其制备方法和应用,所述RNAi载体包括骨架载体和发夹结构,所述发夹结构为ihpRNA表达盒,所述ihpRNA表达盒的结构为PtrpC启动子+正向目的基因片段+intron+反向目的基因片段+TtrpC终止子结构,所述目的基因片段为柑橘木虱卵黄蛋白原基因保守序列DcVg1a或DcVg1b;所述骨架载体为丝状真菌表达载体。还公开一种转基因生防真菌及其制备方法和应用,所述转基因生防真菌是采用所述的RNAi载体转化生防真菌得到。得到的转基因渐狭蜡蚧菌经实验证实可有效提高其对柑橘木虱毒力的毒力,缩短对木虱的浸染时间。

技术研发人员:冉春;杨娟生;于士将;丛林;刘浩强;李鸿筠
受保护的技术使用者:西南大学
技术研发日:2020.09.04
技术公布日:2020.12.08
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