一种盐单胞菌YFX-6及其应用的制作方法

本发明是关于盐单胞菌及其应用，具体地说，是关处理高盐度废水中含氮化合物的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6的其相关应用。

背景技术：

根据好氧反硝化菌的反硝化作用，避免了传统工艺中好氧硝化和缺氧反硝化分离投入大等缺点，在城市污水处理应用中具有生长快速、耐有机负荷、脱氮效率高等特点。然而，印染、农药、煤化工、造纸、炼油、海水利用、粮果、制药等都是高盐废水等行业废水不同于传统的城市污水，其产生的含氮废水的盐度偏高，导致菌的生长代谢受到抑制，脱氢酶活性降低，甚至会导致细菌细胞质壁分离和破裂死亡，显著影响脱氮效率。近年来，国内外开展了大量针对特殊环境脱氮菌株的筛选研究，为耐盐菌的筛选奠定了重要基础。已有研究筛选出耐盐耐冷氨氧化细菌，能够在高盐低温发挥较好的脱氮效能，也陆续筛选出一些具有耐高氨氮和耐低温特性的菌株。然而，目前所筛选出的菌少具耐盐特性，导致其在高盐废水中的应用中难以发挥优势，因此筛选能够耐高盐的菌具有十分重要的意义。^[1]

技术实现要素：

为解决上述的问题，本发明提出一种盐单胞菌yfx-6菌制剂，盐单胞菌，用于降解高盐污水处理厂出水氮化合物，优选用于降解印染、农药、煤化工、造纸、炼油、海水利用、粮果、制药废水中的氮化合物。本发明还提该菌制剂应用及筛选方法。本发明提供一种如下的技术方案：

本发明的目的之一在于提供一种盐单胞菌(halomonassp)yfx-6，分类命名：盐单胞菌(halomonassp)。

本发明的第二目的是提供上述的盐单胞菌yfx-6的应用，所述的盐单胞菌yfx-6用于降解高盐度工业废水氮化合物，优选用于降解皮革废水、养殖废水、制药废水、石化废水、化肥废水、景观水、食品废水、大豆蛋白废水中的氮化合物。

本发明提供的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6可以以氮化合物作为唯一氮源进行生长繁殖。

优选的，所述的氮化合物为硝态氮以及亚硝态氮。

优选的，应用盐单胞菌yfx-6降解氮化合物可以是在好氧环境下进行。也可以在兼氧条件下降解硝态氮化合物。

本发明提供的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6可以以氮化合物作为唯一氮源进行生长繁殖。

一种菌制剂，所述的菌制剂采用上述的盐单胞菌yfx-6制备而成，该菌制剂也用于降解氮化合物，同时所述的菌制剂还包括有营养培养基。营养培养基选自牛肉膏蛋白胨培养基、lb营养培养基、以及添加有碳源的无机盐培养基中的任意一种，其中，碳源优选为乙酸钠。

牛肉膏蛋白胨培养基的成分及含量为：牛肉膏3g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l，ph＝7.0-8.0，优选ph＝7.2-7.6。

lb营养培养基的成分及含量为：酵母粉5.0g/l、氯化钠10.0g/l、蛋白胨10.0g/l，ph＝7.2～7.6。

无机盐培养基的成分及含量为：乙酸钠8.5g/l、硝酸钾:1.0g/l、磷酸二氢钾1.0g/l、硫酸亚铁0.05g/l、氯化钙10g/l、氯化钠20g/l～100g/l，硫酸镁1.0g/l，ph＝7.2-7.6。

本发明提供了所述的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6或菌制剂在降解高盐度污水中的应用，其应用步骤如下：

a)、将所述的盐单胞菌或菌制剂与待处理高盐度污水混合；盐单胞菌添加量为添加量占废水处理体系总体积的1.5％-30％，废水处理体系中的碳氮比为4-12。优选的，添加量为废水体积的15％-30％，废水处理体系中的碳氮比为7-10。

盐单胞菌或菌制剂与待处理高盐度污水混合后，混合体系中活菌数为1×10⁵～1×10⁸cell/ml。

b)、混合后投加三水合乙酸钠1.12～1.92g/l作为碳源，然后放置于15-35℃，优选30℃，180rpm的水浴摇床中反应，反应一定时间后取样；

ph值为7-10，优选为7.5-8.5，更优选为8，有利于盐单胞菌(halomonassp)yfx-6在高盐度废水中生长繁殖，从而加快对高盐度废水中的硝态氮化合物的降解。

优选的，高盐度废水的硝态氮浓度为100-110mg/l。

本发明的有益效果在于，对高盐度废水中硝态氮有很好的去除效果，对环境无污染，是优选的除氮选择。

附图说明

图1为本发明实施例2中盐单胞菌(halomonassp)yfx-6的菌落形态图；

图2为本发明实施例3中盐单胞菌(halomonassp)yfx-6及同时筛选得到的yfx-4、yfx-5和yfx-6分别对高盐度废水的硝态氮去除情况；

图3为本发明实施例4中盐单胞菌(halomonassp)yfx-6处理高盐度粮果废水不同反应时间的硝态氮去除情况；

图4为本发明实施例5提供yfx-6菌株的不同碳氮比处理高盐度粮果废水的硝态氮去除情况；

图5为本发明实施例6提供yfx-6菌株的不同添加量处理高盐度粮果废水的硝态氮去除情况。

图6为本发明实施例6提供yfx-6菌株的不同转速处理高盐度粮果废水的硝态氮去除情况。

具体实施方式

为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图与实施例对本发明作进一步地详细描述。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂，均可通过商购获得。

实施例1

筛选获取盐单胞菌(halomonassp)yfx-6，其筛选过程如下：

步骤1)、从皮革废水处理厂a/a/o处理工艺a池出口取活性污泥；

步骤2)、将5g的活性污泥接种至硝态氮体积分数为0.5％以及盐度为10％的无机盐培养基中，在温度为30℃、盐度为10％、转速为180转/分钟的摇床上培养1天，得到第一菌液；

步骤3)、吸取步骤2)中的第一菌液转接至硝态氮体积分数为1.5％以及盐度为10％的无机盐培养基中，在温度为30℃、转速为180转/分钟的摇床上培养3天，得到第二菌液；

步骤4)、吸取步骤3)中的第二菌液转接至硝态氮体积分数为2％以及盐度为10％的无机盐培养基中，在温度为30℃、转速为180转/分钟的摇床上培养3天，得到第三菌液；

步骤5)、吸取步骤4)中的第三菌液涂布于硝态氮体积分数为2％以及盐度10％的无机盐固体培养基中，在温度为30℃、转速为180转/分钟的摇床上培养3天，获得单菌落；

步骤6)、挑取步骤5)中的单菌落置于离心管中，与甘油(体积分数30％)1:1体积混合，制成菌液，并于-80℃超低温冰箱中保存。

实施例2

对实施例1筛选的菌种进行鉴定。

本发明的实施例1中，筛选到三株菌，本发明中分别命名为hx-1、il-3、yfx-6。其中，经鉴定，yfx-6为盐单胞菌(halomonassp)。

盐单胞菌(halomonassp)yfx-6在琼脂平板培养基上生长良好，如图1所示，菌落呈规则形状，圆凸透明，大小统一，直径2～4mm，表面湿润，边缘平整，革兰氏染色为阴性，具有运动性，兼氧生长。菌株生长温度为20～35℃，ph6～9，最适生长条件：生长温度为30℃，ph7.5。

对实施例1中的步骤5)获得的单菌落提取dna，并对菌种进行dna测序，其16srrna基因序列如seqidno.1所示。本发明中亦称该菌为盐单胞菌(halomonassp)fx-6。

实施例3

对实施例1获得的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6菌的氮化合物物降解能力进行测定。具体步骤如下：

步骤1)、取实施例1获得的盐单胞菌(halomonassp)hx-1及同时筛选得到的il-3、yfx-6的菌液，于3000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入实际水重新悬浮，得到盐单胞菌(halomonassp)yfx-6；

步骤2)、将分别取20ml的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6以及同时筛选到的hx-1、il-3按照步骤1离心后分别加入到编号2,3,4的测试瓶中，编号1为不加菌的对照组。并向每个测试瓶中加入硝态氮为117.42mg/l的粮果高盐(2％nacl)处理水及三水合乙酸钠(碳氮比为8)至总体积均为100ml，其中粮果废水中的盐度nacl补充到盐度10％，即再加入80g/l的nacl浓度。补充编号1(对照)、2、3、4中的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6以及同时筛选到hx-1、il-3原菌液的菌浓在8.1×10⁷～6.6×10⁸cell/ml，体积分数分别为0、20％、20％、20％；

步骤3)、将步骤2)中的测量系统置于摇床中，于30℃下，180转/分钟培养16h，测得16h处理后的硝态氮，并计算处理后的粮果处理水的硝态氮的去除率。

结果详见表1和图2。

表1不同菌株处理粮果高盐(10％nacl)处理水的硝态氮浓度及去除率

如表1所示，3株脱氮菌选择添加量为20％，处理时间为16h时，fx-6菌以在好氧环境中，对粮果高盐(10％nacl)废水处理16h时的硝态氮脱除效率达到98.54％，此时硝态氮浓度为1.68mg/l。而hx-1菌与il-3菌反硝化性能显著低于yfx-6菌，硝态氮处理效率分别为75.69％和85.33％。因此，yfx-6菌的脱氮效果更优，选择yfx-6菌做后续的研究。从图2中可以看出，yfx-6菌的脱氮效果和hx-1菌与il-3菌相比，其效果远远要好于hx-1菌与il-3菌。

实施例4

对实施例1获得的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6菌的不同反应时间的氮化合物物降解能力进行测定。具体步骤如下：

步骤1)、取实施例1获得的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6，于3000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入实际水重新悬浮，得到盐单胞菌(halomonassp)yfx-6；

步骤2)、将0ml、20.00ml的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6分别加入编号为0、1、2、3、4、5的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入硝态氮为108.55mg/l的粮果处理水(盐度2％)及三水合乙酸钠(碳氮比为8.0)至总体积均为100ml，其中粮果废水中的盐度nacl补充到盐度10％，即再加入80g/l的nacl浓度。编号0(对照)、1、2、3、4、5中的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6原菌液的菌浓在8.1x10⁷～6.4x10⁸cell/ml，体积分数分别为0、20％、20％、20％、20％、20％；

步骤3)、将步骤2)中的测量系统置于摇床中，于30℃下，180转/分钟培养0h，5h，10h，13h，16h，19h、23h，测得每个时间点处理后的硝态氮的去除率。

结果详见表2和图3。

表2yfx-6菌株不同反应时间处理高盐度废水的硝态氮的浓度

如表2所示，在yfx-6菌株添加量为20％条件下分别对0h，5h，10h，13h，16h，19h、23h的硝态氮变化考察，结果表明随着处理时间的增加，硝态氮去除率有增加的趋势。其中，处理时间为16h时，yfx-6菌脱氮效率最高，且为98.69％。从性价比综合考虑，处理时间为16h时为最佳的反应时间。

实施例5

对实施例1获得的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6菌的不同碳氮比条件下的氮化合物物降解能力进行测定。具体步骤如下：

步骤1)、取实施例1获得的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6，于3000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入实际水重新悬浮，得到盐单胞菌(halomonassp)yfx-6；

步骤2)、将0ml、20.00ml的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6分别加入编号为1、2的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入总氮为硝态氮为110.50mg/l的粮果(2％盐度)处理水和三水合乙酸钠(碳氮比为2)至总体积均为100ml，其中粮果废水中的盐度nacl补充到盐度10％，即再加入80g/l的nacl浓度。编号1(对照)、2中的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6原菌液的菌浓在8.1×10⁷～6.4×10⁸cell/ml，体积分数分别为0、20％；

步骤3)、将0ml、20.00ml的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6分别加入编号为3、4的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入硝态氮为110.50mg/l的粮果废水(2％盐度)处理水和三水合乙酸钠(碳氮比为4)至总体积均为100ml，其中粮果废水中的盐度nacl补充到盐度10％，即再加入80g/l的nacl浓度。编号3(对照)、4中的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6原菌液的菌浓在8.1x10⁷～6.4x10⁸cell/ml，体积分数分别为0、20％；

步骤4)、将0ml、20.00ml的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6分别加入编号为5、6的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入硝态氮为110.50mg/l的粮果废水(2％盐度)处理水和三水合乙酸钠(碳氮比为6)至总体积均为100ml，其中粮果废水中的盐度nacl补充到盐度10％，即再加入80g/l的nacl浓度。编号5(对照)、6中的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6原菌液的菌浓在8.1x10⁷～6.4x10⁸cell/ml，体积分数分别为0、20％；

步骤5)、将0ml、20.00ml的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6分别加入编号为7、8的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入硝态氮为110.50mg/l的粮果废水(2％盐度)处理水和三水合乙酸钠(碳氮比为8)至总体积均为100ml，其中粮果废水中的盐度nacl补充到盐度10％，即再加入80g/l的nacl浓度。编号7(对照)、8中的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6原菌液的菌浓在8.1x10⁷～6.4x10⁸cell/ml，体积分数分别为0、20％；

步骤6)、将0ml、20.00ml的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6分别加入编号为9、10的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入硝态氮为110.50mg/l的粮果废水(2％盐度)处理水和三水合乙酸钠(碳氮比为10)至总体积均为100ml，其中粮果废水中的盐度nacl补充到盐度10％，即再加入80g/l的nacl浓度。编号9(对照)、10中的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6原菌液的菌浓在8.1×10⁷～6.4×10⁸cell/ml，体积分数分别为0、20％；

步骤7)、将步骤2)，步骤3)，步骤4)，步骤5)，步骤6)，步骤7)中的测量系统置于摇床中，于30℃,下，180转/分钟培养16h，测得16h处理后的硝态氮，并计算处理后的粮果废水(10％盐度)处理水的硝态氮的去除率。

结果详见表3和图4。

表3yfx-6处理粮果废水(8％盐度)废水不同碳氮比硝态氮去除效果

如表3所示，在yfx-6菌株添加量为20％，反应时间为16h条件下，分别对碳氮比为2,4,6,8,10的硝态氮的去除效果进行考察，结果碳氮比越高，硝态氮浓度越低，硝态氮脱除速率越大。碳氮比为2,4，6,8,10处理后的硝态氮浓度分别为：58.52mg/l，33.08mg/l，14.23mg/l，3.87mg/l，10.40mg/l。yfx-6菌利用no2^-和no3^-为呼吸作用的最终电子受体，把硝酸还原成氮(n2)，其脱氮作用过程为：no3^-→no2^-→n2↑。反硝化细菌多为异养型细菌，异养反硝化细菌可以以有机物为碳源，硝态氮为能源进行反硝化作用，其生化过程为：5ch3cooh+8no3^—→6h2o+10co2↑+4n2↑+8oh^—+能量。碳源浓度的高低影响着反硝化作用的进程。碳氮比为2，4和6时，碳源相对不足，硝态氮浓度相对较高，硝态氮脱除效率分别为47.04％，70.06％。碳氮比为8时，碳源浓度适宜，此时硝态氮脱除效率达到96.49％，碳氮比为10时，碳源较为充足，硝态氮脱除效率达90.58％。

实施例6

对实施例1获得的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6的不同添加量的含氮化合物降解能力进行测定。具体步骤如下：

步骤1)、取实施例1获得的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6菌液，分别取5ml、10ml、15ml、20ml、25ml和30ml的菌液，于3000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入实际水重新悬浮，得到盐单胞菌(halomonassp)yfx-6；

步骤2)、将5ml、10ml、15ml、20ml、25ml和30ml的菌液的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6菌体分别加入编号为1、2、3、4、5、6的测试瓶中，并向每个测试瓶中加入硝态氮为110.95mg/l粮果废水和对应的三水合乙酸钠(配成碳氮比为8:1)至总体积均为100ml，编号1(对照)、2中的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6原菌液的菌浓在8.1x10⁷～6.4x10⁸cell/ml，体积分数分别为0、5％、10％、15％，20％，25％和30％；

步骤3)、将步骤2)中的测量系统置于摇床中，于30℃下，180转/分钟培养16h，测得16h处理后的硝态氮，并计算处理后的粮果废水的硝态氮的去除率。

结果详见表4和图5。

表4yfx-6处理粮果不同添加量硝态氮浓度及去除率

如表4所示，碳氮比为8，以体积比分别投加菌液0、5％、10％、15％，20％，25％和30％对粮果处理16h。结果表明，当菌株添加量为5％-15％时，菌株投加量越大，硝态氮脱除效率越高；当菌株添加量为20％时，yfx-6菌脱氮效率最高为97.09％，此时硝态氮浓度为3.23mg/l；继续增加菌体浓度为25％和30％，硝态氮去除率不再升高，为97.12％和97.33％。

实施例7

对实施例1获得的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6菌的不同转速(溶解氧)条件下的含氮化合物降解能力进行测定。具体步骤如下：

步骤1)、取实施例1获得的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6菌液，分别取20ml、20ml、20ml、20ml和20ml的菌液，于3000转/分钟离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入实际水重新悬浮，得到盐单胞菌(halomonassp)yfx-6；

步骤2)、将0ml、20ml、20ml、20ml、20ml和20ml的菌液的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6菌体1分别加入编号为1、2、3、4、5、6的测试瓶中，测试瓶用透气的封口膜封住瓶口，并向每个测试瓶中加入硝态氮为110.24mg/l的粮果处理水(2％盐度)和对应的三水合乙酸钠(配成碳氮比为8:1)至总体积均为50ml，其中粮果废水中的盐度nacl补充到盐度10％，即再加入80g/l的nacl浓度。编号1(对照)、2中的盐单胞菌(halomonassp)yfx-6原菌液的菌浓在8.8×10⁷～6.5×10⁸cell/ml，菌种添加体积为20％；

步骤3)、将步骤2)中的测量系统置于摇床中，于80转/分钟、120转/分钟、150转/分钟、180转/分钟和230转/分钟培养16h，测得16h处理后的硝态氮，并计算处理后粮果处理水的硝态氮的去除率。

结果详见表5和图6。

表5fx-6处理粮果处理水不同转速条件下硝态氮浓度及亚硝态氮的去除率

从评价结果来看：对比80rad/min、120rad/min、150rad/min、180rad/min及230rad/min四个处理组可以看出，随着摇床转速的增加，硝态氮的去除率逐渐提高，当转速为180rad/min，硝态氮的去除率为97.28％，处理后的硝态氮浓度为2.99mg/l,；摇床转速继续提升到230rad/min，硝态氮的去除率为97.88％，处理后的硝态氮浓度为2.33mg/l。综合考虑，性价比最高的为摇床转速为180rad/min。

上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

[1]白洁,陈琳,黄潇,etal.1株耐盐异养硝化-好氧反硝化菌zobellellasp.b307的分离及脱氮特性[j].环境科学,2018,39(10):403-411。