一种唐古特白刺NtSOS2基因及其表达蛋白和应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种唐古特白刺ntsos2基因及其表达蛋白和应用。

背景技术：

唐古特白刺(nitrariatangutorum)属于蒺藜科白刺属，主要分布于陕甘西北，内蒙古西部，青海及新疆东北部的沙地上，是一种典型的抗干旱耐盐碱抗风沙植物，能在沙漠盐碱等恶劣环境下生存。此外，唐古特白刺果实富含多种黄酮，生物碱，维生素等成分，具有健体保健等多种功效。目前唐古特白刺研究主要集中在繁殖育种，生理生化测定，果实成分分析等方面，对于唐古特白刺的开发利用和抗逆响应机制研究奠定基础。

sos家族是朱健康等发现的一类重要的植物盐胁迫响应基因，在植物调节离子平衡和提高耐盐性方面发挥重要的作用。sos2基因编码一个丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，sos2蛋白的n端大约有270氨基酸，构成激酶的催化区域；c端构成它的调控区域，它含有非常保守的fisl基元，具有自我抑制功能。正常条件下其在植物体内的含量很低，它在植株的根和茎中都能表达，但盐胁迫下它在根中的表达明显受到促进。sos2的功能主要体现维持在na⁺和k⁺平衡和耐盐方面，其活性受到ca⁺的调控。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种唐古特白刺ntsos2基因。本发明另外所要解决的技术问题是提供唐古特白刺ntsos2基因在植物抗盐碱方面的作用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种唐古特白刺ntsos2基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

所述的唐古特白刺ntsos2基因的表达蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

含有所述的唐古特白刺ntsos2基因的载体。

进一步地，所述的含有唐古特白刺ntsos2基因的载体是植物表达载体。

进一步地，所述的植物表达载体是pbi121-ntsos2。

含有所述的唐古特白刺ntsos2基因的宿主细胞。

所述的唐古特白刺ntsos2基因在提高植物耐盐性中的应用。

所述的唐古特白刺ntsos2基因在提高植物耐盐性中的应用包括以下步骤：

1)构建所述的唐古特白刺ntsos2基因的载体；

2)将所构建的唐古特白刺ntsos2基因的载体转化到植物或植物细胞中；

3)培育筛选得到耐盐性提高的转基因植物。

进一步地，所述的应用中，所述的植物为拟南芥。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

与现有的技术相比，本发明利用唐古特白刺幼苗为材料，以转录组和blast同源比对结果克隆了唐古特白刺抗盐相关sos2基因编码区，并根据同源命名为ntsos2基因。在正常的培养条件下，过表达ntsos2基因的拟南芥植株和野生型拟南芥并无明显差异。在nacl模拟盐胁迫中，转基因的拟南芥植株抗盐性大于野生型拟南芥。通过模拟耐盐性实验，我们证明了唐古特白刺ntsos2基因在提高植物耐盐碱方面的作用，为植物抗逆改良提供了重要基因资源。

附图说明

图1是唐古特白刺总rna提取电泳图；

图2是唐古特白刺ntsos2目的片段的克隆pcr结果；

图3是唐古特亚细胞定位载体示意图；

图4是基因枪介导洋葱细胞瞬时表达ntsos2基因图；

图5是ntsos2基因的表达载体图；

图6是转基因t1代植株筛选pcr电泳图；

图7是转基因拟南芥t2代盐处理表型观察图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

材料准备：选择颗粒饱满的唐古特白刺种子于4℃下沙藏春化8周，将春化完的种子洗净并置于塑料萌发盒中萌发，待种子长出幼根时，取下幼根并固定。其余一部分种子继续让其发芽，待其长到适宜大小后种植到培养基质中(培养基质为河沙∶泥炭土∶蛭石＝5∶1∶0.5)，塑料花盆大小为7×7cm，每盆定植4棵。培养条件：温度25℃，16h光照/8h黑暗，相对湿度70％，幼苗生长3个月备用。

实施例1：唐古特白刺ntsos2基因的获取

1、唐古特白刺总rna的提取

取新鲜的唐古特白刺植株迅速置于液氮预冷的研钵中，加入少许液氮研磨充分后加入2ml裂解液继续研磨至粉末状，室温条件下匀浆15分钟。12000rpm，4℃离心10min，吸取上清液转入新的离心管中。随后加入0.4ml氯仿，盖紧离心管盖，剧烈振荡后室温下孵育3分钟。4℃，12000rpm离心10分钟，吸取上清液至新离心管待用。加入一倍体积的70％乙醇，颠倒混匀后转入吸附柱中待离心(体积过大可分次过柱)。10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管，加500μl去蛋白液re，12,000rpm离心45秒，弃掉废液。加700μl的漂洗液rd，10,000rpm离心15秒，弃掉废液。加入700μl漂洗液rw，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。将吸附柱ra放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，重复2次，尽量除去漂洗液，以免残留乙醇抑制下游反应，取出吸附柱ra，放入一个rnasefree离心管中，在吸附膜的中间部位加50rnasefreewater，放置于恒温混匀器中静置2分钟，12,000rpm离心1min，将离心得到的溶液重新吸入吸附柱中重复上述操作。得到的溶液即为总rna，取少量进行浓度检测及凝胶电泳，结果如图1所示，rna条带清晰可见，无明显降解。结合nanodrop的检测结果，可以认为此次rna样品无明显降解和dna蛋白质等污染可用于下步实验。样品合格后放置于超低温冰箱中待用。

2、cdna的合成

以提取的rna样品为模板，利用诺唯赞iii1ststrandcdnasynthesiskit进行合成，具体操作步骤如下：

在rnase-free离心管中配制混合液，totalrna2μl，rnase-freeddh2oto8μl。65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。将上述混合液加入cdna合成反应液(10×rtmix2μl，hiscriptiiienzymemix2μl，randomhexamers1μl，rnase-freeddh2o5μl)，使用移液枪轻轻吹打混匀(pcr反应程序为：25℃，5min；50℃，45min；85℃，5min)，反应得到的cdna存于-80℃备用

3、目的基因克隆

由已有的转录组数据和ncbiblast比较，利用oligo7设计引物，克隆得到ntsos2，对pcr产物切胶并回收目的条带(图2)，与pmd19-t连接后转入大肠杆菌，经过测序分析，确定ntsos2基因的orf是完整的。唐古特白刺的ntsos2基因cds为1332bp，具体序列如seqidno.1所示，所表达的蛋白序列如seqidno.2所示，包括443个氨基酸。

ntsos2片段克隆引物为：

ntsos2-f：5′-tgaggaaccatgaagaagaagacgaagag-3′

ntsos2-r：5′-ataacgcaggaggatcagcaggtcattgt-3′

pcr程序为：94℃预变性2min一个循环，98℃变性10s，61℃退火30s，68℃延伸3.5min，共计35个循环，68℃彻底延伸，4℃+∞。反应体系为(50μl)：2×kodbuffer，25μl，cdna1μl，ntsos2-f1.5μl，ntsos2-r1.5μl，ddh2o10μl，kod(fx)1μl。

实施例2：唐古特白刺ntsos2基因亚细胞定位

构建亚细胞定位表达载体2×35s：ntsos2，通过基因枪介导法转入洋葱内表皮细胞，使用荧光显微镜观察该基因在洋葱内细胞中的表达模式。

1、载体的构建：

本发明所用的大肠杆菌为dh5α(天根)，表达载体为pjit-166。

通过pcr向ntsos2基因片段上下游分别添加同源重组区段。以测定正确含有ntsos2基因克隆片段的pmd-19t为模板，使用带末端同源序列的引物进行pcr链式反应，pcr体系：2×phantamaxbuffer25μl，dntp1μl，ntsos2-166-f2μl，ntsos2-166-r2μl，含有ntsos2的pmd-19t1μl，dnapolymerase1μl，ddh2o18μl。pcr反应条件：95℃30s；95℃15s，60℃15s，72℃3min30s，35个循环；72℃5min；4℃∞。

带末端同源序列的引物如下所示：

ntsos2-166-f：

5′-ctcctcgcccttgctcaccatggatccgcaggtcattgttctgatcagactgg-3′，

ntsos2-166-r：

5′-catggcgtgcaggtcgactctagaatgaagaagaagacgaagagggttgg-3′。

将pcr产物于紫外光下切胶回收备用。

使用xbai和bamhi限制性内切酶酶切pjit-166。酶切反应体系为(50μl)：pjit166质粒3μl，10×cutsmartbuffer5μl，bamhi1μl，xbai1μl，ddh2o40μl。反应条件：37℃酶切1h，酶切结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离。用切胶回收试剂盒进行回收并纯化酶切产物，溶于30μl的ddh2o中。

将切胶回收产物与酶切产物相连，具体反应体系如下(20μl)：gibsonmix10μl，pjit-166酶切纯化产物4μl，ntsos21μl，ddh2o5μl。反应条件：50℃，1h，连接产物放于4℃冰箱备用。

连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取单菌落接种到lb液体培养基中，37℃震荡培养过夜；使用全长引物进行菌液pcr，以筛选阳性克隆同时测序检测载体构建过程中是否发生突变或者缺失现象。构建表达载体如图3所示。

2、基因枪介导洋葱内表皮：

利用基因枪介导法将构建好的瞬时表达载体导入到新鲜洋葱内表皮细胞中，暗培养24h，使用荧光显微镜观察其在洋葱内表皮细胞上的表达。具体操作如下：

1)取新鲜洋葱内表皮，用锋利刀片切割制备成1cm×1cm的小块，用镊子轻轻撕下贴于1/2ms培养基上，23℃培养数小时。

2)取50μl金粉重悬液于灭菌1.5ml离心管中，取5μgpjit-ntsos2-gfp于管盖的一边，取50μlcacl2(2.5m)和20μl亚精胺(0.1m)于离心管盖的另外一侧，盖上盖子后迅速涡旋混匀10min，静置1min。

3)瞬离5s，弃去上清，重新加入150μl无水乙醇涡旋5min弃去上清，加入80μl无水乙醇并重悬液体，置于冰上待用。

4)取10μl金弹于载物膜上待其吹干后放置于金属盖子上并用模具压紧，将可裂膜，终止屏等按要求安装完毕将制备好的洋葱表皮放置于基因抢轰击仓正中心，关闭仓门。

5)打开基因枪电源，气阀等将金弹导入到洋葱表皮细胞，完成介导转化过程。

荧光显微镜观察其在洋葱内表皮细胞上的表达，结果如图4所示，ntsos2主要在细胞质和细胞核中表达。

实施例3：唐古特白刺ntsos2基因功能验证

构建唐古特白刺ntsos2过表达载体，并将其转入农杆菌菌株，通过农杆菌介导法转化拟南芥花序，获得过表达ntsos2基因的阳性转基因植株，观察表型，推测ntsos2功能。

1、载体的构建

本发明所用大肠杆菌菌株为e.colidh5α；表达载体为pbi121(biovectorco.ltd公司购入)。具体过程如下：

(1)通过pcr在ntsos2基因上下游分别添加同源序列，pcr体系为：2×phantamaxbuffer25μl，dntp1μl，ntsos2-121-f2μl，ntsos2-121-r2μl，含有ntsos2的pmd-19t1μl，dnapolymerase1μl，ddh2o18μl。pcr反应条件：95℃30s；95℃15s，60℃15s，72℃3min30s，35个循环；72℃5min；4℃∞。

引物分别是：

nts2-121-f：

5′-

tttggagagaacacgggggactctagaatgaagaagaagacgaagagggttg-3′，

nts2-121-r：

5′-

cataagggactgaccacccggggatccgcaggtcattgttctgatcagactg-3′。

pcr产物1％琼脂糖凝胶电泳分离后，用天根凝胶回收试剂盒回收纯化。

(2)使用smai和xbai内切酶对pbi121酶切。

酶切的反应体系(20μl)：10×cutbuffer5μl，smai1μl，xbai1μl，pbi1212μl，用ddh2o补足至50μl。

37℃水浴，酶切2h。1％琼脂糖凝胶电泳进行分离。用天根凝胶纯化回收试剂盒进行回收并纯化酶切产物，溶于20μl的ddh2o中。

(3)dna重组反应

按照同源重组的连接体系依次加入各试剂及片段，反应体系：10×gibsonassemblymasterbuffer5μl，酶切的表达载体2μl，添加同源片段pcr产物1μl，水补足至20μl。

(4)连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取单菌落接种到lb液体培养基中，37℃震荡培养过夜；使用引物进行菌液pcr，以筛选阳性克隆同时测序检测载体构建过程中是否发生突变或者缺失现象。构建表达载体如图5所示。

2、农杆菌的转化

(1)使用的农杆菌菌株为eha105(唯地，中国)。采用的是液氮冻融法将构建好pbi121-ntsos2表达载体转入农杆菌。

具体操作如下：

1)取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

2)每100μl感受态加入0.01-1μg质粒dna(转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量)，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。

3)加入700μl无抗生素的lb或yeb液体培养基，于28℃振荡培养2～3小时。

4)6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的lb或yeb平板上，倒置放于28℃培养箱培养48h。

5)pcr检测阳性克隆，4℃保存备用。

(2)待种植的健康状态的拟南芥生长至开花。将pcr检测的阳性克隆农杆菌，摇菌至od6000.8时，进行拟南芥花器官浸泡转化。具体过程如下：

1)将菌液5000rpm，5min离心，收集菌体，用5％蔗糖溶液悬浮；

2)在浸泡前，加入silwetl-77，浓度为0.05％(500μl/l)，晃出泡沫；

3)将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡15～30sec，期间轻轻晃动；

4)将浸过的拟南芥平躺在托盘里，用保鲜膜覆盖保湿，锡箔纸密封避光24h；

5)揭开锡箔纸，正常条件下培养，当种子成熟时停止浇水。

(3)收获干燥的种子，将t1代种子进行筛选，筛选培养基：1/2ms+卡那霉素100mg/l。对于抗性筛选结果过的转基因植株做pcr阳性检测结果如图6所示。

收取t1代拟南芥种子后，将种子继续进行筛选获得t2代植株。然后，收取t2代拟南芥植株后，将种子继续进行筛选，获得纯合筛选出t3代纯合株系。

3、t2代ntsos2转基因拟南芥抗盐实验

t2阳性植株经抗生素培养基筛选后经pcr鉴定正确后，待植株长至适合大小后对野生型拟南芥和转基因拟南芥做抗盐性实验，结果如图7所示，可以发现在200mmnacl盐溶液胁迫下，随着时间推移非转基因的拟南芥叶片出现萎蔫白化程度更高，表现为更强的失水现象，而过表达ntsos2的拟南芥植株萎蔫失水相较于野生型拟南芥相对较少，由此可以看出ntsos2可以增强拟南芥植株对盐的耐受性。

序列表

<110>南京林业大学

<120>一种唐古特白刺ntsos2基因及其表达蛋白和应用

<130>100

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1332

<212>dna

<213>nitrariatangutorum

<400>1

atgaagaagaagacgaagagggttgggaagtatgaggttggacgaaccattggtgaagga60

acctttgccaaggttaagtttgcacgaaatacaaatacaggagagagtgtagccatgaaa120

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tctattatgaagattgtcaggcatcccaatatagtcaggctgcatgaggttttggcaagt240

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aagataaatgctgcagaattttgttgtccattttggttttctgctggcgcaaagtcattg720

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atgaatctgaaggtccatactcgaaattttaagacaagacttgaaggaacatcttcaaat1140

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<210>2

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<213>nitrariatangutorum

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151015

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202530

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<210>3

<211>29

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<400>3

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<400>7

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<210>8

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<213>nts2-121-r(artificial)

<400>8

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