一种用于治疗胶质瘤的siRNA及其制备方法和应用与流程

本发明属于基因药物
技术领域：
，具体涉及一种用于治疗胶质瘤的sirna及其制备方法和应用。
背景技术：
：胶质瘤属于原发性脑部肿瘤，在整个颅脑肿瘤发生率中占40％～50％。胶质瘤生长呈现恶性浸润，且生长在脑部，这就对临床治疗增加了一定的难度，且治疗后容易复发。在手术的基础上进行化疗、放疗是临床治疗恶性脑胶质瘤的标准方法，但是大部分患者的预后效果较差，且生存时间较短。胶质瘤的药物研发已经成为世界性的难题。目前的治疗方法效率低下，疗效有限，所以在迫切需要开发新的药物来治疗胶质瘤。小分子干扰rna(smallinterferingribonucleicacid，sirna)是一类双链rna分子，能够在转录后水平有效沉默特异性致病基因。利用特定的递送技术将双链小核酸分子导入靶细胞，在mrna水平关闭与小分子核酸序列具有同源序列的靶基因表达时，可使该基因沉默，从而对患者体内特定靶基因表达进行调控，实现基因治疗。sirna作为药物治疗恶性肿瘤，与化疗、免疫治疗等其他疗法相比，具有专一性强，副作用小的特点，具有广阔的市场前景。技术实现要素：为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种用于治疗胶质瘤的sirna及其制备方法和应用。本发明提供的sirna，可靶向抑制olfml2a基因的表达，降低胶质瘤的恶性程度，为胶质瘤靶向治疗药物的研发提供新的方法，为胶质瘤的靶向药物治疗奠定了基础，具有重大的应用推广价值。本发明所采用的技术方案为：一种用于治疗胶质瘤的sirna，所述sirna的核苷酸序列为下面序列中的至少一组：sirna-1序列：5’-tctatgtcaccaactacta-3’，如seqidno.1所示；sirna-2序列：5’-gccaaacaaacattcacta-3’，如seqidno.2所示。一种包含所述sirna的载体。所述载体为慢病毒。所述的sirna在制备胶质瘤靶向治疗药物中的应用。一种治疗胶质瘤的药物，所述药物包含所述sirna和药学上可接受的载体或助剂。所述sirna的制备方法，包括如下步骤：(1)设计质粒；(2)对所述质粒进行慢病毒包装；(3)慢病毒的浓缩与纯化，即得所述sirna。设计质粒的具体操作如下：(a1)以olfml2a基因为模板，设计多个19-21ntrna干扰靶点序列；选取sirna序列作为干扰靶点，根据靶点序列设计shrna干扰序列，并在两端添加限制性内切酶酶切位点以完成载体构建；(b1)在正链3’端添加ttttt终止信号，而反链5’端添加终止信号互补序列；设计完成后合成单链dnaoligo；(c1)将合成的单链dnaoligo干粉溶解于退火缓冲液中，加热一段时间后，自然冷却至室温，形成带粘性末端的双链；(d1)将双链dnaoligo与线性化的载体相连，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆的pcr鉴定，将测序正确的菌液转接于液体培养基中，37℃摇床震荡培养过夜，提取质粒。步骤(c1)中，所述退火缓冲液的终浓度为20μm；所述加热为90℃水浴15min；步骤(d1)中，所述液体培养基为含amp抗生素的lb液体培养基。所述慢病毒包装包括质粒转染与慢病毒收获，具体操作如下：(a2)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293t细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度约5×106细胞/15ml，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％co2培养箱内培养；(b2)待细胞密度达70％-80％时用于转染，转染前2h更换为无血清培养基；向一灭菌离心管中加入所制备的各dna溶液，并相应体积的转染试剂混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育15min；混合液缓慢滴加至293t细胞培养液中，混匀，于37℃、5％co2细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的pbs液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、5％co2培养箱内继续培养48-72h。步骤(3)中，所述慢病毒的浓缩与纯化，具体操作如下：根据细胞状态，收集转染后48h的293t细胞上清液；于4℃、4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒的上清液以25000rpm速率进行离心2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm、5min后，取上清质量检测后，即得所述sirna。本发明的有益效果为：本发明所述的sirna，通过将sirna的慢病毒载体感染胶质瘤细胞，利用sirna敲低olfml2a基因的表达，可以有效降低胶质瘤恶性程度，减缓瘤体的生长，抑制肿瘤的形成，从而为胶质瘤靶向治疗药物的研发提供新的方法，为胶质瘤的靶向药物治疗奠定了基础，具有重大的应用推广价值。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1a为正常脑组织与胶质瘤患者癌组织olfml2a表达水平比较图；图1b为4株高级别永生化的胶质瘤细胞系检测olfml2a基因的表达水平对比图；图2a和2b分别为不同胶质瘤细胞株的慢病毒转染效率检测结果图；图2c、图2d分别为rt-pcr检测不同胶质瘤细胞株中olfml2a基因的表达；图2e、图2f分别为westernblot检测不同胶质瘤细胞株中olfml2a基因的表达；图3a、3b分别为mtt观察不同胶质瘤细胞株中敲低olfml2a对胶质瘤细胞系增殖的影响；图3c、图3d分别为不同胶质瘤细胞株中敲减olfml2a对小鼠成瘤的影响。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。下述实施例中涉及到的各种试剂等均为本领域技术人员所知晓的市售产品。实施例1本实施例提供一种用于治疗胶质瘤的sirna，所述sirna的核苷酸序列为：sirna-1序列：5’-tctatgtcaccaactacta-3’，如seqidno.1所示。本实施例还提供一种所述sirna的制备方法，包括以下步骤：(1)根据rna干扰序列设计原则，以olfml2a基因(核苷酸序列如seqidno.3所示)为模板，设计多个19-21ntrna干扰靶点序列。经评估测定后，选取sirna序列作为干扰靶点。根据已选靶点序列设计shrna干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外，在正链3’端添加ttttt终止信号，而反链5’端添加终止信号互补序列。设计完成后合成单链dnaoligo。将合成的单链dnaoligo干粉溶解于退火缓冲液中(终浓度20μm)，90℃水浴15min。自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链。按照fermentast4dnaligase说明书配制20μl反应体系，将双链dnaoligo与线性化的载体相连。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆的pcr鉴定，将测序正确的菌液转接于150ml含amp抗生素的lb液体培养基中，37℃摇床震荡培养过夜。按照endofreemaxiplasmidkit说明书提取质粒，质检合格的质粒进行慢病毒包装。(2)慢病毒包装包括质粒转染与慢病毒收获，具体操作如下：转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293t细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度约5×106细胞/15ml，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％co2培养箱内培养。24h待细胞密度达70％-80％时即可用于转染；转染前2h更换为无血清培养基；向一灭菌离心管中加入所制备的各dna溶液(gv载体质粒20μg、phelper1.0载体质粒15μg、phelper2.0载体质粒10μg)，并相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育15min；混合液缓慢滴加至293t细胞培养液中，混匀，于37℃、5％co2细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的pbs液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、5％co2培养箱内继续培养48-72h；(3)之后进行慢病毒浓缩与纯化，具体操作如下：根据细胞状态，收集转染后48h(转染即可计为0h)的293t细胞上清液；于4℃、4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(可用pbs或细胞培养基替代)，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm、5min后，取上清质量检测后使用。实施例2本实施例提供一种用于治疗胶质瘤的sirna及其制备方法，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述sirna的核苷酸序列为：sirna-2序列：5’-gccaaacaaacattcacta-3’，如seqidno.2所示。实施例3本实施例提供一种用于治疗胶质瘤的sirna及其制备方法，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述sirna的核苷酸序列为：sirna-1序列：5’-tctatgtcaccaactacta-3’，如seqidno.1所示；sirna-2序列：5’-gccaaacaaacattcacta-3’，如seqidno.2所示。靶点编号靶点序列gc％sirna-1tctatgtcaccaactacta36.8％sirna-2gccaaacaaacattcacta36.8％实验例一、在胶质瘤人群组织样本、永生化胶质瘤细胞系中检测olfml2a基因表达水平组织样品：将待研磨的组织样品置于装有1mltrizol裂解液的1.5mlep管中。使用超细匀浆机研磨组织；4℃、5000rpm离心3min，弃沉淀；细胞样品：细胞于2000rpm离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mltrizol，充分混匀后室温静置5min，然后转移至新的1.5mlep管中。每管加入200μl氯仿，室温静置10min；4℃、12800rpm离心15min；吸取上层液体移至新的1.5mlep管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃静置10min。4℃、12800rpm离心12min后，弃上清；加入1ml、75％乙醇(用depc水新鲜配制)，洗涤沉淀。4℃、11800rpm离心5min，弃去上清，室温干燥。待rna沉淀基本透明时，加入rnase-free水至完全溶解，nanodrop2000/2000c分光光度计分析测定所抽提rna的浓度及质量；rna反转录，将得到的rt产物—cdna置于-20℃保存备用；real-timepcr检测并制作熔解曲线；数据分析。如图1a所示为正常脑组织与胶质瘤患者癌组织olfml2a表达水平比较，其中，normal：正常脑组织；cancer：胶质瘤组织。可以看出，在胶质瘤患者中，olfml2a基因在肿瘤组织中的表达明显增高。如图1b所示为4株高级别永生化的胶质瘤细胞系检测olfml2a基因的表达水平。可以看出，olfml2a基因在4株永生化胶质瘤细胞系中高表达，这证实了olfml2a在胶质瘤中的致病性，从而推断针对olfml2a基因的sirna序列可能是治疗胶质瘤的有效途径。二、sirna序列敲减olfml2a基因的表达(1)慢病毒转染及转染效率验证调整u251、u87细胞密度为1×105个/ml，将细胞悬液接种于6孔板中，每吧孔加入2ml，培养至细胞20％汇合，换液并加入转染增强试剂(polybrene)聚凝胺稀释25倍，每孔加入40μl，根据moi＝5计算按照106个/孔加入病毒于6孔板，每孔溶液终体积为1ml。转染16h后，对培养板中细胞进行换液，并继续培养至72h后荧光显微镜下观察gfp蛋白表达情况，验证转染效率。之后吸掉孔中的培养基，每孔加入新鲜的含有嘌呤霉素(浓度2μg/ml)的2ml生长培养基，培养24h后进行相关实验。病毒感染复数(multiplicityofinfection，moi)＝(病毒滴度×病毒体积)/细胞数目。(2)westernblotu251、u87细胞pbs洗涤两次，加入适量预冷的细胞裂解液裂解，细胞刮刮下细胞转移入ep管中，冰上裂解10-15min后超声破碎细胞(200w共4次，每次5s，间隔2s)；4℃、12000g离心15min，取上清bca法测定蛋白浓度；sds-page蛋白电泳(浓缩胶80ma，20min；分离胶120ma，1h)，在4℃、300ma恒流条件下电转150min，将蛋白转移到pvdf膜上，一抗孵育过夜，二抗孵育1.5h，ecl显影，数据分析。通过小干扰核糖核酸(sirna)敲减olfml2a(dna序列如seqidno.3所示)，观察胶质瘤细胞株u87、u251目的基因olfml2a的表达，检测sirna敲减效率；其中：图2a、2b所示为慢病毒转染效率检测结果，可以看出：经慢病毒转染，将sirna序列导入靶细胞后，检测细胞中gfp(绿色荧光)的表达，观察慢病毒转染效率超过80％。图2c、图2d分别为rt-pcr检测u87、u251中olfml2a基因的表达，在mrna水平验证sirna序列敲减效率；图2e、图2f分别为westernblot检测u87、u251中olfml2a基因的表达，在蛋白水平验证序列有效性；通过rt-pcr(图2c、2d)及westernblot(图2e、2f)观察到sirna序列可以明显降低靶细胞中olfml2a基因的表达。三、sirna敲低olfml2a对胶质瘤恶性程度的影响(1)mtt实验将处于对数生长期的各实验组根据u251、u87细胞生长速度决定铺板细胞密度(2000个/孔)，根据实验设计决定铺板数量(如检测5天，则铺5张96孔板)，并调整实验各组细胞密度至均匀。从铺板后第二天开始，培养终止前4h加入20μl5mg/ml的mtt于孔中，无需换液。4h后完全吸去培养液，加100μldmso溶解甲瓒颗粒。振荡器振荡2-5min，酶标仪490/570nm检测od值。数据统计分析。(2)肿瘤细胞动物移植模型(裸鼠皮下荷瘤动物模型的建立)选取处于对数生长期的细胞，经消化、重悬、计数等步骤调整浓度至2×107个/ml。将200μl重悬细胞接种至裸鼠皮下，每组10只裸鼠。每间隔2天测量肿瘤体积，第30天处死裸鼠，数据分析。图3a、3b为mtt观察敲低olfml2a对胶质瘤细胞系增殖的影响，证实在胶质瘤细胞系u87、u251中敲低olfml2a基因，可以显著抑制细胞的生长；图3c、图3d为敲减olfml2a对小鼠成瘤的影响，发现与正常组相比，实验组成瘤率降低(图3c)，肿瘤生长速度明显减缓(图3d)，图中的“nc”代表对照组，“kd”代表慢病毒转染敲低组，从而表明sirna可以通过抑制olfml2a基因的表达，降低胶质瘤的恶性程度，实现对胶质瘤的药物治疗。图2c-f、图3a-b中，shctrl代表对照组，sholfml2a-1代表shrna序列1敲低实验组，sholfml2a-2代表shrna序列2敲低实验组。本发明所述的sirna序列可有效降低胶质瘤恶性程度，减缓瘤体的生长，抑制肿瘤的形成，可为胶质瘤的临床药物治疗提供有效途径，具有广泛前景。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。sequencelisting<110>兰州大学<120>一种用于治疗胶质瘤的sirna及其制备方法和应用<130>2010<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1tctatgtcaccaactacta19<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2gccaaacaaacattcacta19<210>3<211>5961<212>dna<213>未知<400>3catatcctagaggttgggtgaccaaccctgtcccagtttgcctgggacttgagggttttt60ccaggatgcagcactttcagtgctaaaactaggaatgttccaggcactctgggatgagtt120ggtcaccttgcctaggtgcctaagaacctctcccctgcccacgtactaagaccaatgagt180aagagagacaaggctgggaaggacacagctagaggaaaaggcaaggacatcagcaagtat240ggcagtgtgcagaaaagctttgcagacagaggcctcccaaaacctcccaaggagaagctg300cttcaggtggagaagctgagaaaggagagcggcaagggcagtttcctccagcccacagcc360aagccccgcgccctggcccagcagcaggctgtgatccggggcttcacctactacaaggca420ggcaagcaggaggtgaccgaggcggtggcagacaacaccctccagggcacttcctggctg480gagcaactgccgcccaaggtggagggcaggtccaactccgcagagcccaactccgcagag540caggatgaggctgagcccaggtcctccgagcgagtggacctggcttctggcacccccact600tcaatccctgccaccaccaccaccgccaccaccaccccaacccccaccaccagtctcctg660cccaccgagccaccttcaggtccagaagtctccagccaaggcagagaggcgagctgtgag720ggcaccctccgggctgtggacccccctgtgaggcaccacagctatgggcgccacgaggga780gcctggatgaaggaccctgcagctcgagacgacaggatctatgtcaccaactactactat840ggaaacagcctggtggagttccgcaacctggaaaacttcaagcaaggccgctggagtaac900atgtacaagctaccctacaactggatcggcacaggccacgtggtgtaccagggcgccttc960tactacaaccgcgccttcaccaagaacatcatcaagtacgacctacggcagcgcttcgtg1020gcctcctgggcgctgctgcccgacgtggtatatgaggacaccacaccttggaagtggcgc1080ggacactcggacattgactttgccgtggacgagagcggcctgtgggtcatctaccccgcc1140gtggacgaccgcgatgaggcccagcccgaggtgatcgtcctgagtcgcttggaccccggc1200gatctctccgtgcaccgggagaccacgtggaagacacggctgcggcggaactcctacggg1260aactgcttcctggtgtgcggcatcctgtatgccgtggacacgtacaaccagcaggaaggc1320caggtcgcctacgctttcgacacgcacacgggcaccgacgcacgcccccagctgccgttc1380ctcaacgagcacgcctacaccacccagatcgactacaaccccaaggagcgggtgctgtac1440gcctgggacaatggccaccagctcacctacaccctccacttcgtggtctgagtggagacc1500tgtgctccccggagaggggcagcagtgcgggaggggctttgcacagcagctcctgcaact1560gacccagtccgcaaatatttattgggggccagcccagggctgggactgggcatgaggtgg1620tcaccaggattgagcttcctcagcacccagtgggtaatacttgcttccacttgcagagca1680ccgtgccaagcacttcccacacacttacccgtttgattctcctagcacctcccttggagg1740tagagatcatgaacccatttaacagacgaggagacaggctcagagaggcaccgtcccttg1800cctaacacctcagttgtgatcaggcaggctgtgctctcaggacagccccattttagggat1860gaggagacttcaccacgccctcccctccctgccctcccccatctccccggtctcccttgt1920tctctcaacccagtctcccttcccagggccactcagaaccagaggtctttagggccagtg1980tactggtgtggggtggaggccctggctctgcctgccatcctagggccctgttctggctga2040gctgttggtggccctgggctttgggccccttagccaatgtccttgtctcttgtctttggc2100cagccccctcagcccagcccaccccacccgctgtccggccacattccaaacctctaccgt2160cacctagctgctgagcagaaaccgcaccccgagagaaaatcccatcctctgttccaaggc2220ccctgtctgctctatgctcatttttattttctcttattcttcatcagtgccgtcatttgt2280ttctgcagcagcagctgagaaggcagccggcagctctgccagggtggggagctgagctga2340ggctccctctccacccagaagcactggcgttgttcacatagtcaggccttgggtcccctc2400cctggttcatcccagagcctttgggcctggagtccgccttgtcctttttctctgggcttt2460caaacccacaacctttacacactcagggatacctccgggtctgccatgaataagacccta2520ggcccaagtctggtgtggtgccaggatggcacagtttccctcttccttgccagccctgac2580ctggtcactgggcaggctggcccagcagcctgggggctgcagaagacatggtgtgagtag2640ttgggtccaggggaggcatcaggccttcttctggttgcaggagagaaccagagggtggga2700acggggagggaagaactgagggtctgcagactggacttttcctggctcgacccaggactt2760gggttgaggatgcacgggggccaccttgcccggggccactggtggctccccagagcctca2820gacccacacagcccagaggacgaggccttcaagcctgcccctcttctgcttttttagaca2880gtatttttagagctggaaagaaattttctagcccaactccctgtttcatgaaagagaaaa2940gaggctcagaaaagtttagagagcagctcagtgtcacactgggagctgggcacagccgat3000ctccttccagaagggttctgtctgtatcctttattctccgcacatggaggctgccctacc3060tgggaaggcaccccagcacctgtgaaggacatttactgctcatcctcacctgccccctgg3120cccttgctgccttcattctgtcccaatgccagctccctggatgtctgtatgtttgaatac3180cagttgccatgttaggaaggtcagctgcacagccaagagtgtaagagtgtaaagaaatgc3240ctttttttttttttttgagttggagttttgctcttgtcgcccaggctggagtgcagtggc3300gcgatctcggctcactgcaacctctgccccctgggttcaagcgattctcctgcctcagcc3360tccctagtagctgggactacagcacccaccaccacacccagctaatttttgtatttttag3420tagagacaggggtttcaccacgttggccaggctggtctcgaactcctgaccttaggtgat3480ccgcccgcctcagcctcccaaagtgttgggattacaggcatgagccactgcgcctggcca3540gcaaatgctttttgtgcagaatacacttctttcaggcattgtcaggtgctgttttgttta3600agctctaactcacccctggaatacaggggaatgatgacaaccagcccagccaggcctgac3660tcatcatggtcacatccagcccccacccccggccaactaaccactgcaggctcctcttcc3720agactcaccagggggcctcgaggccccggcatctcccttggccctgggtgtgggttttac3780aagactgtgtctttcatgacatcatagcccaaccatgtgagaagaaggagaaggcccccc3840tttcttcattaatctgaaaaaaaggaaagtgagaataggctgatttttaaaagttaaggg3900gcaagcagcattgcattctgggggaacgatcctggccacagccgccaaacaaacattcac3960taggcctcttctgttttcatacccttgtaagtgggttatgtggtgggtatggtcagtttt4020ttcttttttcttttcttttcttttttttgagacagagtttcgcttttgttgcccgggctg4080gaatgcaatggcgcgattcagctcactgcaatctccgcctcccgggttcaagtgattctc4140ctgccttagcctcctgaaaagctgggattacagggccctgccaccaagcccagctaattg4200tatttttagtagagacaggatttcaccatgttggccaggccagtctcaaactcctgacct4260caggtgatccacctgcctcagcctcccagactgttgggattacaggcatgagccaccacg4320cctggccagtttcttcattttacatatggtcacattggcgcctagaacagttaggtcgct4380cgtcacataggcagttaagtggagaaccaggt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