三环二萜类化合物及其提取方法和用途与流程

本发明涉及壮药棵矮瓤化学成分的
技术领域：
，具体为从壮药棵矮瓤中提取的三环二萜类化合物及其提取方法和用途。
背景技术：
：壮药棵矮瓤是广西壮族常用药材，药用地上部分，味辛、微苦，性温，气香，有祛风除湿、消肿止痛、通经活络的功效，对于治疗风湿关节痛、皮肤瘙痒等症疗效确切。壮药棵矮瓤是一种非常容易种植的草本植物，但国内外对壮药棵矮瓤化学成分的研究及报道较少，现有技术中对壮药棵矮瓤中提取的化学成分也未报道有具有治疗肺损伤和抑郁方面的研究。技术实现要素：本发明针对壮药棵矮瓤中的化学成分进行研究，提供一种三环二萜类化合物，其化学结构式为：其分子式为c20h34o3。2、提取三环二萜类化合物的方法，其特征在于，所述三环二萜类化合物为如权利要求1所述的三环二萜类化合物，提取方法包括步骤如下：步骤一、取干燥的壮药棵矮瓤茎叶药材粉末，用体积浓度为75％-95％的甲醇浸提，得到提取物；步骤二、将提取物混悬于水中，用石油醚脱脂萃取，所得水层用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取物，浓缩得到稠膏；步骤三、将稠膏用石油醚与丙酮的体积比依次为20:1、8:1、6:1、4:1、3:1、2:1和1:1，进行梯度洗脱，得到七个部位，分别编号为fr-a、fr-b、fr-c、fr-d、fr-e、fr-f和fr-g部位，取fr-b部位反复采用硅胶，葡聚糖凝胶，制备色谱方法分离纯化，得到白色固体，即为所述三环二萜类化合物。本发明还提供了上述三环二萜类化合物在制备治疗急性肺损伤的药物中的应用。优选的是，所述药物下调急性肺损伤受试者炎症因子的水平、炎症调节因子的水平。优选的是，所述炎症因子包括tnf-α、il-1β、il-6，所述炎症调节因子包括mpo。优选的是，所述药物含有治疗有效量的所述三环二萜类化合物和药学上可接受的载体。优选的是，所述药物被制成药学上允许的剂型。优选的是，所述药物被制成注射剂。优选的是，所述三环二萜类化合物的给药剂量为不低于6.6mg/kg·d。本发明还提供了上述三环二萜类化合物在制备抗抑郁的药物中的应用。优选的是，所述药物提高腺苷酸环化酶活性，增强ac-camp信号转导通路活性。优选的是，所述药物被制成口服剂。优选的是，所述三环二萜类化合物的给药剂量为不低于5mg/kg·d。本发明至少达到以下有益效果：1、经过试验表明，本发明的化合物在慢性应激大鼠模型中显示出明显的抗抑郁活性，具有在制备抗抑郁药物中的应用。2、经过试验表明，本发明的化合物可有效抑制lps引起的小鼠支气管肺泡中白细胞计数的增多，降低肺组织内mpo活性，抑制支气管肺泡中tnf-α、il-1β、il-6水平升高，同时也能明显升高肺组织中camp含量。在制备治疗急性肺损伤药物方面具有很好的研究开发价值。附图说明图1为本发明实施例1制备的三环二萜类化合物的hr-esi-ms谱；图2为本发明实施例1制备的三环二萜类化合物的1h-nmr谱；图3为本发明实施例1制备的三环二萜类化合物的13c-nmr谱；图4为本发明实施例1制备的三环二萜类化合物的1h–1hcosy谱；图5为本发明实施例1制备的三环二萜类化合物的hmbc谱；图6为本发明实施例1制备的三环二萜类化合物的13cdept-135谱；图7为本发明实施例1制备的三环二萜类化合物的hsqc谱；图8为试验3各组对急性肺损伤小鼠camp含量影响的柱形图。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是，下述实施方案中涉及的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。<实施例1>步骤一、取干燥的壮药棵矮瓤茎叶药材粉末7.0kg用体积浓度为75％-95％的甲醇，在室温条件下浸提3次，每次5天，过滤合并滤液，回收甲醇，得到浓缩后的提取物；步骤二、将浓缩后的提取物混悬于水中，用石油醚与提取物体积比为1:1脱脂萃取3次；所得水层用乙酸乙酯与水层体积比为1:1萃取3次，合并乙酸乙酯萃取物，浓缩得505g稠膏；步骤三、将稠膏用石油醚与丙酮的体积比依次为20:1、8:1、6:1、4:1、3:1、2:1和1:1，进行梯度洗脱，得到七个部位，分别编号为fr-a、fr-b、fr-c、fr-d、fr-e、fr-f和fr-g部位，取fr-b部位反复采用硅胶，葡聚糖凝胶，制备色谱方法分离纯化，得到白色固体，即为所述三环二萜类化合物。本发明的三环二萜类化合物的化学结构式为：三环二萜类化合物：为白色固体，hr-esi-ms(见图1)在m/z305.2482(calcdfor305.2481)[m+h-h2o]+，结合碳氢谱推测其分子式为c20h34o3，计算其不饱和度为4。1h-nmr(cdcl3,600mhz)表1和图2显示分子中有四个甲基质子信号：δh0.73(s,3h,h-19),0.81(s,3h,h-18),1.23(s,3h,h-16),1.11(s,3h,h-17)；三个烯碳上的质子信号：δh5.85(1h,dd,j＝17.4,10.9hz,h-14),δh5.24(1h,dj＝17.4hz,h-15)和δh5.10(1h,dj＝10.9hz,h-15)；一个氧取代的次甲基质子信号：δh3.89(1h,dd,j＝9.1,3.3hz,h-12)以及氧取代的亚甲基信号：δh3.07(1h,d,j＝10.8hz,h-20a)和δh3.37(1h,d,j＝10.8hz,h-20β)。13cnmr(cdcl3,150mhz)数据(见表2和图3)，显示共有20个碳信号，根据dept(见图6)和hsqc(见图7)数据显示有4个甲基、8个亚甲基和4个次甲基，其余4个为季碳。其中双键碳信号为δc141.0(c-14)和δc113.7(c-15)，连羟基碳信号为δc81.6(c-12)，羟甲基碳信号为δc17.2(c-19)，推测化合物是一种三环四甲基半日花烷型三环二萜类化合物，带一个双键和两个羟基(如上述化学结构式所示)。在hmbc谱(见图5)中，可看到甲基质子信号h-16(δh1.23)与c-12(δc8.16)、c-14(δc141.0)远程相关，h-17(δh1.11)与c-7(δc39.3)、c-9(δc60.0)远程相关，h-18(δh0.81)与c-19(δc17.0)、c-3(δc35.5)和c-5(δc50.3)远程相关，h-20(δh0.72)与c-1(δc39.2)、c-9(δc60.0)远程相关，可判定甲基分别连接在13位，8位，10位和4位，且羟亚甲基碳δc72.0与c-4相连。双键的位置可由h-15(δh5.24)和c-13(δc74.5)及h-16(δh1.23)和c-12(δc81.6)、c-14(δc141.0)的远程相关关系来确定。结合1h-1hcosy谱(见图4)可知，h-11(δh1.56)和h-12(δh3.89)与cosy相关，且h-12与次甲基碳碳信号δc81.6(c-12)直接相关，可判定另一个取代羟基连接在12位。至此，化δc72.0(c-20；1h,δh3.37,d,j＝10.8hz；1h,δh3.07,d,j＝10.8hz)。因此，化合物的平面构型得以确定，命名为aromatinb。根据单晶x-射线衍射实验结果，确定化合物手性中心碳原子的绝对构型为4r,5r,8s,9s,10r,12r,13s。表1：三环二萜类化合物的1h-nmr数据(600mhz,cdcl3,δinppm,jinhz)表2：三环二萜类化合物的13c-nmr数据(150mhz,cdcl3,δinppm)<试验1>本发明的三环二萜类化合物对腺苷酸环化酶活性测定试验如下：1、药品和试剂：实施例1提取的三环二萜类化合物，简称实施例1化合物；camp定量测定试剂盒；三羟甲基氨基甲烷(tris)；其它试剂均为分析纯产品。2、主要仪器：离体心肌灌流装量(自制)；ls6500液体闪烁计数器，美国beckman公司。3、离体大鼠心脏腺苷酸环化酶活性测定：取健康雄性，体重约370g大鼠1只，断头取出心脏，在冰浴条件下，用浓度为50mmol/l的冷tris-hcl缓冲液洗净心脏内残余血液。称取心室组织500mg，加入5ml浓度为50mmol/l的tris-hcl缓冲液，将心室组织剪碎匀浆。将心室匀浆每50ul体积分装于试管中，其中取出两管煮沸灭活作为对照组，其余各管分别加入肾上腺素(肾上腺素组)及不同浓度的实施例1化合物(实施例1组)各50ul，各试管再加入50mmol/ltris-hcl，内含2mmol/lmgso2，12.5mmol/l茶碱，ph＝7.5的反应液至450ul，再加50ul100mmol/l的atp溶液，30℃水浴温育5min后立即煮沸5min，立即冰浴冷却至室温，3000rpm离心10min，取上清液5ml，用环磷腺苷试剂盒测定camp，用反应试管的camp量减去灭活试管的camp量即为ac催化生成的camp量。酶活力单位表示方法为pmol·camp/(mg湿重·5min)。4、检测方法：采用elisa方法检测样品中camp含量。上步所采取的样品按照所用elisa试剂盒要求进行进一步处理后，用elisa方法检测各样品中camp含量，结果如表3所示。表3：腺苷酸环化酶活性测定结果与对照组比，**p<0.01。由表3结果可以看出，本发明的化合物具有显著的激活腺苷酸环化酶(ac)的活性，提高大鼠心脏细胞内的环磷腺苷(camp)浓度，从而参与多种细胞功能调节，在体内起着广泛的调节作用。<试验2>本发明的三环二萜类化合物对抗抑郁作用的测定试验如下：抑郁症是一种复杂的心境障碍性疾病，主要表现为情绪低落，言语减少，精神、运动迟缓，在西方国家发病率约为9％～18％。目前认为，长期慢性、低水平的应激源是促进抑郁发生、发展的主要原因。应激的主要特征为机体受到内外环境刺激后发生下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenalaxis，hpaaxis)功能失调及免疫系统功能紊乱，由此引发各种行为和功能的改变。近年研究发现，抗抑郁药物能引起腺苷酸环化酶(adenylatecyclase，ac)活性增强和camp含量的增加，从而可能通过ac-camp信号转导途径发挥作用。1、动物、药品与试剂：雄性sd大鼠，180-200g。实施例1提取的三环二萜类化合物和丙咪嗪(美国sigma公司)。camp酶免测定试剂盒(美国sigma公司)；egta(纯度≥97％，北京天来生物医学科技有限公司)；atp，dtt(北京赛尔曼生物公司)；茶碱(美国sigma公司)；125i-camp放射免疫测定试剂盒。2、仪器：超声匀浆仪；550型全自动酶标仪；sn-695b型智能放免1测量仪。3、方法：建立大鼠慢性应激模型大鼠随机分每笼10只，在室温21～23℃，湿度40％～60％，自然光照，自由摄食饮水条件饲养。慢性应激时程共计20d，每日一次，时间：9：00—14：00，每日应激刺激依次如下：高速水平振荡45min；强迫游泳(水温10℃)：5min；制动1.5h；夹尾(距尾根1cm)：1min；禁水24h；足底电击(1ma，时程1s，每1min1次)：30min；强迫游泳(水温10℃)：5min；禁食24h；制动2h；高速水平振荡1h；夹尾(距尾根1cm)：1min；禁水24h；换笼孤养24h；足底电击(1ma，时程1s，每1min1次)：45min；强迫游泳(水温10℃)：5min；高速水平振荡1.5h；制动2.5h；夹尾(距尾根1cm)：1min；禁食24h；换笼孤养24h。实施例1组为：每天慢性应激实验前60min给予不同剂量的实施例1化合物(2.5，5，10mg/kg，ig，用花生油溶解)。丙咪嗪组为：每天慢性应激实验前30min给予丙咪嗪(10mg/kg，ip，用蒸馏水溶解)。正常组为：不经过慢性应激。空白对照组为：每天慢性应激前不给任何药剂。第21天给药后60min(实施例1组)和第21天给药后10min(丙咪嗪组),立即断头取脑，正常组、空白对照组也断头取脑，分离大鼠额叶皮层和海马，至液氮中保存备用，用于ria法测ac活性和elisa法测camp。4、ria法测ac活性：取适量组织样品，按1：40加入预冷的tris-hcl缓冲液(0.05mol/l，ph7.4)，在冰浴下充分研磨成组织混悬匀浆液。取适量匀浆液，用bradford法测定蛋白含量。反应总体积为500ul，其中含有50mmoltris-hcl缓冲液，8mmol茶碱，4mmoldtt，1mmolegta，1mmolatp。加入适量组织匀浆后，30℃水浴保温15min，于沸水中加热3min终止反应，冷却后于3000r/min离心10min，取上清液测camp。反应以双管进行，对照管将匀浆在沸水中加热3min使酶失活，其他步骤同实验管。camp的测定按125i-camp放免测定试剂盒说明进行。将反应管camp的量减去对照管的camp量即为ac催化生成的camp量，用此量计算出酶的活性，其单位是pmol/(mg·min)。4.1、数据统计处理：采用spss19统计软件包进行统计学处理，数据以均数±标准差表示，单因素方差分析，组间差异(p<0.05)采用student-newman-keulstest，计算出酶的活性数据如表4所示。表4：对慢性应激大鼠不同脑区ac活性的影响(n＝10，)与对照组比，**p<0.01。5、elisa法测camp：将组织样品置于不锈钢研磨器中，加入液氮并研成精细的粉末，在液氮挥发后称组织的重量，以10倍体积0.1mol/lhcl溶解，室温下3000r/min离心10min，之后用所提供的0.1mol/lhcl稀释用于测试。按camp酶免测定试剂盒说明进行，最后制作标准曲线，计算样品中的camp浓度，如表5所示。表5：对慢性应激大鼠不同脑区camp活性测定结果与对照组比，**p<0.01，*p<0.05。表4和表5的结果显示，慢性应激20d后，大鼠额叶皮层和海马的camp水平和ac活性显著下降，与正常对照组相比差异有显著性，提示慢性应激可能使ac-camp信号转导通路受损；而给实施例1的化合物(5或10mg/kg，ig)可以拮抗这一作用，使大鼠相应脑区camp含量增加，ac活性升高，ig5mg/kg实施例1的化合物组达到ip10mg/kg丙咪嗪组的效果，ac-camp信号转导通路活性增强。ac-camp信号转导通路在实施例1的化合物的抗抑郁效应中发挥重要作用。综上所述，本发明的化合物在慢性应激大鼠模型中显示出明显的抗抑郁活性。<试验3>本发明的三环二萜类化合物对治疗急性肺损伤的测定试验如下：1、材料：实验动物icr小鼠，雄性，体质量19～21g，清洁级，实验环境：恒温(22±2)℃，湿度60％～70％，自由饮水和进食。1.2、试剂与仪器：实施例1提取的三环二萜类化合物；lps(脂多糖)；地塞米松；髓过氧化物酶试剂盒；tnf-α、il-1β和il-6elisa试剂盒；蛋白测定试剂盒；campelisa试剂盒。gf-1型控时调速式高速分散器；elx800uv型酶标仪；dhg-9145a型电热恒温鼓风干燥箱。2、方法2.1、模型制备及给药应用气道内滴入lps的方法制备小鼠ali模型，将小鼠随机分为生理盐水组、lps模型组、地塞米松组(dxm5mg/kg)和实施例1组(6.6mg/kg)，每组12只。小鼠按280mg/kg腹腔注射100g/l水合氯醛麻醉，钝性分离气管，除生理盐水组外，其余各组小鼠气道内滴入lps(2mg/kg)，生理盐水组给予等体积生理盐水。10min后给药组(地塞米松组和实施例1组)分别一次性腹腔注射相应剂量药物，生理盐水组和模型组腹腔注射等体积生理盐水。37℃放置，6h后处死，左肺行支气管肺泡灌洗，右肺收集保存。2.2、支气管肺泡灌洗液中白细胞计数和分类造模6h后将小鼠麻醉，股动脉放血处死，结扎右肺后，暴露气管行气管插管，用pbs液1.5ml分3次进行支气管肺泡灌洗，支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，balf)回收率达90％，冰浴保存，取部分balf混匀后细胞计数，进行总白细胞(wbc)计数，剩余balf于4℃，250×g离心10min，取细胞沉淀涂片，晾干后吉姆萨染色，进行细胞分类计数，包括巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞，离心后取上清留取上清液，储存于-80℃。2.3、支气管肺泡灌洗液中相关细胞因子和蛋白含量测定采用双抗体夹心elisa法，按照试剂盒说明书要求，测定balf中tnf-α、il-6和il-1β相关细胞因子，利用bio-rad蛋白测定试剂盒测定balf中总蛋白含量。2.4、肺组织中mpo活性和camp含量的测定准确称取右肺下叶组织，按试剂盒要求用生理盐水制备成100g/l的组织匀浆，4℃、12000×g离心10min，收集上清，利用campelisa试剂盒，按步骤测定组织匀浆里的camp含量，mpo活性测定采用酶学动力方法测定。2.5、统计学处理采用spss13.0软件进行统计学处理。各组数据先行方差齐性检验，样本均数比较采用方差分析和dunnettt检验。2.6、结果如表6、表7和图8所示。表6：对急性肺损伤小鼠肺泡灌洗液中白细胞数、中性粒细胞数和蛋白含量的影响组别白细胞(×109/l)中性粒细胞(％)蛋白含量(pmol/l)生理盐水组13.56±3.672.85±1.62281.22±15.42lps模型组205.73±68.31··78.15±11.83··308.63±14.77··地塞米松组84.68±24.71**54.79±12.65**284.34±14.97*实施例1组70.53±21.22**51.43±11.02**261.32±19.28*与生理盐水组比较··p<0.01；与lps组比较*p<0.05，**p<0.01。与生理盐水对照组相比，lps模型组balf中白细胞总数和中性粒细胞百分数增多(p＜0.01)，实施例1化合物处理后，可降低lps引起的白细胞总数增高和中性粒细胞百分数(p＜0.01)，作用强度与地塞米松相当；lps组小鼠balf中的蛋白含量较生理盐水组明显升高(p＜0.01)，给予实施例1化合物和地塞米松处理后，可使balf中的蛋白含量明显降低(p＜0.05)，差异具有统计学意义。表7：对急性肺损伤小鼠mpo、tnf-α、il-1β和il-6含量的影响与生理盐水组比较··p<0.01；与lps组比较*p<0.05，**p<0.01。lps组小鼠肺组织中mpo活性较生理盐水组明显升高(p＜0.01)，给药处理后，实施例1化合物组中mpo活性明显降低(p＜0.05)，而地塞米松组有所降低；与生理盐水组相比，lps组balf中tnf-α、il-1β、il-6的含量均明显升高(p＜0.01)，地塞米松能明显降低三者的含量，实施例1化合物也能明显降低三者的含量(p＜0.01)，且效果优于地塞米松图8为各组对急性肺损伤小鼠camp含量影响的柱形图，(与生理盐水组比较··p<0.01；与lps组比较**p<0.01，柱形条上的星号表明有统计学意义)。从图8的数据显示，lps组与生理盐水组相比，肺组织camp含量明显降低(p＜0.01)；与lps组相比，地塞米松和实施例1化合物能明显升高肺组织中camp含量(p＜0.01)。综上数据可得，实施例1化合物可有效抑制lps引起的小鼠balf中白细胞计数的增多，降低肺组织内mpo活性，抑制balf中tnf-α、il-1β、il-6水平升高，同时也能明显升高肺组织中camp含量，在治疗急性肺损伤方面具有很好的研究开发价值。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。当前第1页12