一种基于二代测序的egfr突变检测方法及试剂盒
1.技术领域
2.本发明为一种基于二代测序的egfr突变检测方法及试剂盒。
背景技术：
3.循环游离核酸（circulating cell-free nucleic acid，cfna）是指存在于人体血液循环中的游离于细胞外的微量内源性或外源性核酸片段，cfna 最早由mandel和metais于1947年发现，随后leon等人的研究表明肿瘤患者外周血清dna水平大大高于正常人。1989年stroun等发现血液游离dna具有肿瘤细胞dna 的一些特征，5年后研究者在肿瘤患者的血浆和血清中检测到了癌基因突变，并且与原发肿瘤相一致。正常人循环血中存在少量游离dna（浓度常小于10 ng/ml），肿瘤循环血dna（circulating t
µ
mour dna，ctdna）主要来源于肿瘤细胞,其血浆dna浓度平均可达180 ng/ml。
4.靶向药物的出现从根本上改变了癌症的诊治，癌变相关基因变异检测用于预测肿瘤标记物变化在肿瘤患者管理中起着至关重要的作用。体细胞检测基因突变的局限性，促进了能精确地在异质混合物包括循环肿瘤dna(ctdna)中精确地测序遗传物质的新技术的发展。大多数肿瘤组织会将ctdna的释放到循环血液中，ctdna能够显示出肿瘤细胞的指纹特征, 并可以作为非侵入性生物标志物用于检测突变指导肿瘤个性化治疗、跟踪治疗反应或监测复发。因此，开发适用于肺癌，肝癌、胃癌，以及食道癌等患者的多重肿瘤液体活检试剂盒，将极大的促进肿瘤患者的分层管理和个性化治疗方案选择，解决目前临床的迫切需要。
5.目前，基于荧光pcr技术开发的单基因突变检测试剂盒价格高、敏感性低，只能进行单基因突变的检测，不适用于液体活检，需要的dna样本量较高。基于目前ngs平台技术由于样本制备和测序过程中固有的碱基错配和测序错误，使得无法区分结果是测序错误还是突变，导致低检测灵敏度和准确性，此外，大多数基于ngs技术平台开发的试剂盒要求起始dna样本量要》150ng，致使这些试剂盒并不适用于肿瘤液体活检和检测突变频率为1-5%的低浓度样本。
6.ngs技术具有高通量的特性，能够一次检测多个基因的多个突变位点附近的序列，从而能够同时鉴别出已知和未知的突变类型，节省样本dna用量，检测性价比高。因此，开发基于ngs技术的cfdna基因突变的检测试剂盒，提高检测特异性和准确性，显著降低成本提高经济效益，对解决当前中国人群恶性肿瘤的预防和及早检测、管理治疗将起到很大的推动作用。
技术实现要素：
7.本发明的目的是提供一种基于二代测序的egfr突变检测方法及试剂盒，其特征在于试剂盒包括：检测egfr基因第18外显子seq no.1中的第2155、2156变异位点、egfr基因第
19外显子seq no.2的缺失突变、egfr基因第20外显子seq no.3中2303~2369位点之间的突变和egfr基因第21外显子seq no.4中2573~2582位点之间突变的特异性引物对（引物混合液）、多重pcr混合液、te buffer、纯化磁珠。
8.所述的特异性引物对是指egfr基因第18外显子seq no.1中的第2155、2156变异位点、egfr基因第19外显子seq no.2的缺失突变、egfr基因第20外显子seq no.3中2303~2369位点之间的突变和egfr基因第21外显子seq no.4中2573~2582位点之间突变位点而设计，能特异性扩增出包含egfr基因第18外显子seq no.1中的第2155、2156变异位点、egfr基因第19外显子seq no.2的缺失突变、egfr基因第20外显子seq no.3中2303~2369位点之间的突变和egfr基因第21外显子seq no.4中2573~2582位点之间突变位点的dna片段的引物对。优选地，试剂盒中包含具有seq no.5和seq no.6所示序列的引物对、seq no.7和seq no.8所示序列的引物对、seq no.9和seq no.10所示序列的引物对、seq no.11和seq no.12所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成，本发明的引物不限于这8对引物。
9.在本发明中，所述特异前引物的序列为 ：5
’-
acactctttccctacacgannnnnnnnnnnnnnnnn-3’，其为seq id no.13所示；所述特异后引物的序列为：5
’-
cagacgtgtgctcttccgatctnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’，其为seq id no.14所示。特异前引物的序列中的“acactctttccctacacga”为illumina建库p5引物的部分序列，特异后引物中的“cagacgtgtgctcttccgatct”序列为illumina建库p7引物的部分序列，“nnnnnnnnnnnnnnnnn”可根据不同的靶序列进行设计，n可以是a、g、c、t中的随机组合。cfdna核酸可直接以特异性引物进行多重pcr，获得的目的片段进行建库扩增测序。
10.此外，本发明涉及基于二代测序技术检测egfr点突变的方法，具体步骤如下：（1）构建第二代测序文库；（2）第二代测序文库纯化；（3）第二代测序仪测序；（4）生物信息学分析，获得结果。
11.所述的步骤（1）构建第二代测序文库，包括a）准备样品dna；b）准备引物；c）多重pcr构建测序文库；其中，pcr 检测的反应程序为：预变性5min；然后95℃变性30s，60℃退火30sec，72℃延伸30sec扩增20循环。
12.再次，本发明涉及一种基于二代测序技术检测egfr点突变的试剂盒，所述的试剂盒包括上述所述的引物序列。
13.优选地，所述的试剂盒还包括第二代测序仪，所述测序仪为ion torrent proton测序仪。
14.与现有技术相比，本发明的积极效果是：1. 灵敏度高，本发明基于第二代测序技术可对clinvar数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）关于egfr基因已报道的18、19、20、21外显子的重要突变进行检测，且dna起始量仅需5μg；2. 操作简单，而本发明只需一次pcr扩增和一次纯化就可完成文库构建；3. 检测灵敏度高、特异性高，本发明dna起始量仅需5μg，最低可检测0.1%的突变，基于二代测序技术，可能扩增序列进行特异识别，检测特异性极高；4. 准确性高，通过双向测
序，可以有效避免扩增产生的突变，错误率降低到百万分之一。
15.本发明试剂盒的组分和含量包括：2μl引物混合液、2μl多重pcr混合液、30μl te buffer、30μl纯化磁珠。
16.本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
具体实施方式
17.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解为：这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如：sambrook等分子克隆：实验室手册见new york cold spring harbor laboratory 出版的molecular cloning第四版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
18.本实施例的寡核苷酸引物序列由英潍捷基公司生产。
19.步骤1: 基因组dna模板的提取用磁珠法提取人血清样本中的cfdna。
20.步骤2: 构建第二代测序文库a）准备样品dna，用常规方法提取全基因组dna；b）准备引物：将合成的引物序列加te溶液稀释到10
µ
m。将10
µ
m的引物seq no.5、seq no.6、seq no.7、seq no.8、seq no.9、seq no.10、seq no.11、seq no.12按照等比例混合即为引物预混液；c）多重pcr构建测序文库：在pcr体系中，该试剂盒反应体系为总体积10μl，包含浓度为10ng/μl的基因组dna模板6μl、引物混合液2μl、多重pcr混合液2μl。置于pcr扩增仪上进行反应，反应条件为：预变性5min；然后95℃变性30s，60℃退火30sec，72℃延伸30sec扩增20循环。
21.步骤三：第二代测序文库纯化向10ul pcr产物中，加入30ul贝克曼磁珠，移入1 .5ml离心管，漩涡振荡混匀，室温静止10min后，移入磁力架，待液体澄清后，除去上清，加入75%酒精400ul，静置1min后移除上清，再加入400ul 75%的酒精，1min后移除。室温干燥5min，酒精挥发后，将标本移下磁力架后，加入30ul te溶液，充分混匀后，静置3min。再次振荡混匀，再静置3min后，将标本上磁力架，待澄清后，取上清保存。
22.步骤三：第二代测序仪测序本实施例利用kapa library preparation kit ion torrent platforms试剂盒测序，将5个标本等量混合后，文库混合液稀释到12pmol/ul，并使其变性，制备所需的预填充试剂盒，将文库混合液装到指定槽的试剂盒中，设置实验步骤并检查各运行参数后开始运行，实验结束后查看测序结果。
23.步骤四：生物信息学分析对新一代测序数据进行预处理，后使用bwa将质控后的序列比对到参考基因组序列上，利用gatk工具判读snp和indel位点；利用snpnexus工具注释snp，找到可能性的功能性位点，最后利用dbsnp、千人基因组数据库、hgmd等数据库、clinvar数据库进行注释和比较，从而检测egfr基因突变。本实施例实验操作简单，检测灵敏度，范围广。