构建DNA文库的方法及试剂盒与流程

构建dna文库的方法及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及基因测序领域，具体地，涉及一种文库构建方法及试剂盒。


背景技术：

2.无创产前dna检测，是一种针对胎儿染色体非整倍性疾病的新型检测技术，具有无创、可靠、便捷、快速的特点，发病率较高的21-三体综合征(唐氏综合征)、18-三体综合征(爱德华氏综合征)、13-三体综合征(帕陶氏综合征)均在检测范围内。
3.1997年，科学家发现在母体外周血中存在胎儿游离dna，这一发现成为了无创产前检测的理论基础。无创产前dna检测技术通过采集孕妇外周血，利用二代测序技术对母体外周血中的游离dna片段进行测序，并结合生物信息分析及数据统计，最终评估胎儿是否患21-三体综合征(唐氏综合征)、18-三体综合征(爱德华氏综合征)、13-三体综合征(帕陶氏综合征)三大染色体疾病。
4.二代测序文库的构建一般流程如下：对目的dna片段化；对游离dna进行末端平齐化处理；在平齐化后的dna的3’末端突出腺苷酸化；将突出腺苷酸化的dna片段与突出胸腺嘧啶化的双链y型接头进行连接；通常文库构建末端修复、3'端加a反应、加接头，每一步反应结束都需要分离纯化，步骤繁琐，样本需要量大，反应需要的酶多。文库构建的时间长，酶的用量大，建库成本高。
5.因此，文库的构建方法有待改进。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种文库构建方法，该方法通过提高缓冲液的兼容性，适用于文库构建过程中的末端修复及3'端加a反应两步反应，无需纯化，简化了建库流程，降低了反应时间，并且，建库所需样本量低。
7.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建dna文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：对dsdna片段进行末端修复及3'端加a(腺苷酸)反应，获得加a产物；将加a产物与接头连接，获得连接产物；其中，末端修复及加a反应缓冲液含有8-12mm tris-hcl、1-2mm mgcl2和45-55mm kcl，且ph值为8-10。
8.根据本发明实施例的构建dna文库的方法，通过提高缓冲液的兼容性，适用于文库构建过程中的末端修复及3'端加a反应两步反应，无需纯化，简化了建库流程，降低了反应时间，有利于提高构建dna文库的方法的效率和稳定性。并且，该缓冲液对建库反应的酶无明显的抑制作用，降低了酶的用量，减少了建库所需酶的种类，此外，建库过程样本损失少，仅需微量样本即可实现建库。
9.根据本发明的实施例，所述末端修复及加a反应缓冲液含有9-11mm tris-hcl、1.3-1.8mm mgcl2、48-52mm kcl，且ph值为8.5-9.5。
10.根据本发明的实施例，所述末端修复及3'端加a反应的反应条件为：37℃5～30分
钟、65℃10～30分钟。
11.根据本发明的实施例，所述末端修复及3'端加a反应的反应条件为：37℃10分钟、65℃20分钟。
12.根据本发明的实施例，dsdna片段不低于4ng。
13.根据本发明的实施例，所述dsdna为血浆游离dna。
14.根据本发明的实施例，利用聚合酶进行所述3'端加a反应，且所述聚合酶为无5
’-3’
外切酶活性的聚合酶。
15.根据本发明的实施例，所述聚合酶为klenow exo酶或hemoklen taq酶。
16.根据本发明的实施例，所述3'端加a反应的所述聚合酶的用量为0.2-0.5u/μl，优先地，为0.3u/μl。
17.根据本发明的实施例，所述dsdna为打断的dna片段。
18.根据本发明的实施例，所述末端修复和3'端加a反应是连续进行的。
19.根据本发明的实施例，所述接头连接的接头浓度为4-40pmol，纯化倍数为1.0倍。
20.根据本发明的另一方面，本发明提供了一种构建文库的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：末端修复及3'端加a反应缓冲液，所述缓冲液包括：8-12mm tris-hcl、1-2mm mgcl2和45-55mm kcl，且ph值为8-10；连接缓冲液；以及末端修复及3'端加a反应控件，所述末端修复及3'端加a反应控件的控制条件是37℃5～30分钟、65℃10～30分钟。
21.根据本发明实施例的试剂盒，采用具有高兼容性的缓冲液，适用于文库构建过程中的末端修复及3'端加a反应两步反应，无需纯化，简化了建库流程，降低了反应时间，并且，该构建dna文库的试剂盒的建库效率和稳定性高。此外，该缓冲液对建库反应的酶无明显的抑制作用，降低了酶的用量，减少了建库所需酶的种类，降低了试剂盒的成本，此外，该试剂盒建库过程样本损失少，仅需微量样本即可实现建库。
22.根据本发明的实施例，该试剂盒进一步包括：无5
’-3’
外切酶活性的聚合酶。
23.根据本发明的实施例，所述聚合酶为klenow exo酶或hemoklen taq酶。
24.根据本发明的实施例，所述末端修复及3'端加a反应缓冲液包括9-11mm tris-hcl、1.3-1.8mm mgcl2、48-52mm kcl，且ph值为8.5-9.5。
25.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
26.下面的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
27.需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
28.构建dna文库的方法
29.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建dna文库的方法。根据本发明实施例的构建dna文库的方法，通过提高缓冲液的兼容性，适用于文库构建过程中的末端修复及3'端加a反应两步反应，无需纯化，简化了建库流程，降低了反应时间，并且，该缓冲液对建
库反应的酶无明显的抑制作用，降低了酶的用量，减少了建库所需酶的种类，此外，建库过程样本损失少，仅需微量样本即可实现建库，根据本发明的一些实施例，仅需4ng即可实现建库。
30.s100末修加a
31.根据本发明的实施例，对dsdna片段进行末端修复及3'端加a反应，获得加a产物，其中，该末端修复及3'端加a反应所需的末端修复及加a反应缓冲液含有8-12mm tris-hcl、1-2mm mgcl2和45-55mm kcl，且ph值为8-10。
32.发明人通过对末端修复及3'端加a反应缓冲液进行优化，得到本技术实施例的缓冲液，即含有8-12mm tris-hcl、1-2mm mgcl2、45-55mm kcl，且ph值为8-10。具体地，可以是以下任意组合，tris-hcl可以是8、9、10、11和12mm，mgcl2可以是1、1.1、1.3、1.5、1.8和2mm，kcl可以是45、46、48、50、52和55mm，根据本发明的优选实施例，该末端修复及加a反应缓冲液含有9-11mm tris-hcl、1.3-1.8mm mgcl2、48-52mm kcl，且ph值为8.5-9.5。更优选地，该缓冲液含有10mm tris-hcl、1.5mm mgcl2、50mm kcl，且ph值为9.0。发明人发现本发明实施例的缓冲液，缓冲液的兼容性更佳，稳定性显著提高，适用于文库构建过程中的多步反应，使文库构建过程中的多步反应可以连续进行，无需纯化，显著降低了反应时间，并且，有利于提高构建dna文库的方法的效率和稳定性。
33.根据本发明的实施例，所述末端修复及3'端加a反应的反应条件为：35-40℃5～30分钟、60-70℃10～30分钟，其中，末端修复和加腺苷酸尾的条件是：35-40℃，5～30分钟；加腺苷酸尾后灭活聚合酶的条件是60-70摄氏度，10～30分钟，该条件有效灭活聚合酶，避免连接过程中出现大量接头二聚体，提高有效模板数量。该条件下dna片段的末端修复和加尾效率高，偏好性低，稳定性好。根据本发明的实施例，该末端修复及3'端加a反应的反应条件为：37℃10分钟、65℃20分钟。由此，末端修复和加腺苷酸尾的有效模板数量高，反应效率进一步提高，偏好性更低，稳定性更佳，样本兼容性更好。
34.根据本发明的实施例，该dsdna为血浆游离dna，尤其适用于产前胎儿无创基因检测。
35.在现有的常规建库过程中，需要使用四种酶完成末段修复及3'端加a反应。本发明通过使用一或两种酶即可完成末修和加a两步反应。根据本发明的实施例，利用聚合酶进行所述3'端加a反应，且所述聚合酶为无5
’-3’
外切酶活性的聚合酶。为了保证在60-70℃的高温条件下聚合酶也能保持比较高的活性，发明人通过大量研究，从大量的聚合酶中挑选了热敏感的具有高保真性的聚合酶作为末端修复的核心酶，和嗜高温的没有外切酶活性的聚合酶作为突出腺苷酸化的核心酶。根据本发明的实施例，所述聚合酶为klenow exo酶或hemoklen taq酶。
36.根据本发明的实施例，所述3'端加a反应的所述聚合酶的用量为0.2-0.5u/μl。由此，酶的用量少且文库的产量高。根据本发明的优先实施例，该聚合酶的用量为0.3u/μl。由此，文库的产量更高。
37.根据本发明的实施例，该方法构建所需的时间短，仅需1h左右，文库构建流程更加简单、流畅、高效。需要说明的是除了血浆样本，使用本发明的方法需进行打断处理，打断方法可以为已知的任何方法，如机械打断、酶切打断等。需要说明的是，打断片段在步骤a反应中需加入t4 pnk酶。
38.根据本发明的实施例，该dsdna为打断的dna片段。
39.根据本发明的实施例，该末端修复和3'端加a反应是连续进行的。由此，末端修复后无需纯化即可直接进行加a反应，简化了方法步骤，缩短了反应时间。
40.根据本发明的实施例，该接头连接的接头浓度为4-40pmol，纯化倍数为1.0倍。由此，接头连接的效率高，有利于提高文库产量。
41.根据本发明的实施例，dsdna片段不低于4ng。由于建库过程样本损失少，仅需微量样本即可实现建库。
42.s200接头连接
43.根据本发明的实施例，将加a产物与接头连接，获得连接产物。本发明前述的缓冲液可以兼容接头连接处理过程，从而，加a后的样本无需分离纯化即可直接用于接头连接处理，节省了反应步骤和时间。需要说明的是，前述的末端修复及加a反应缓冲液可以兼容接头连接处理过程，但针对接头连接处理过程的需要，还需要再添加相应的接头连接缓冲液，但缓冲液的用量相对于现有的建库接头连接反应显著下降。
44.根据本发明的实施例，在接头连接中，a将3'端加adsdna与接头连接，获得连接产物，实现该步骤使用本领域技术人员常用的加接头反应条件和反应体系。优选地，本发明中使用t4 dna连接酶完成连接，反应条件为20℃30分钟。
45.试剂盒
46.根据本发明的另一方面，本发明提供了一种构建文库的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：末端修复及3'端加a反应缓冲液、连接缓冲液和末端修复及3'端加a反应控件，其中，该末端修复及3'端加a反应缓冲液包括：8-12mm tris-hcl、1-2mm mgcl2和45-55mm kcl，且ph值为8-10，该末端修复及3'端加a反应控件的控制条件是37℃5～30分钟、65℃10～30分钟。
47.根据本发明实施例的试剂盒，采用具有高兼容性的缓冲液，适用于文库构建过程中的末端修复及3'端加a反应两步反应，无需纯化，简化了建库流程，降低了反应时间，该构建dna文库的试剂盒的建库效率和稳定性高。并且，该缓冲液对建库反应的酶无明显的抑制作用，降低了酶的用量，减少了建库所需酶的种类，降低了试剂盒的成本。此外，该试剂盒建库过程样本损失少，仅需微量样本即可实现建库，根据本发明的一些实施例，仅需4ng即可实现建库。
48.在现有的常规建库过程中，需要使用四种酶完成末段修复及3'端加a反应。本发明通过使用一或两种酶即可完成末修和加a两步反应。根据本发明的实施例，利用聚合酶进行所述3'端加a反应，且所述聚合酶为无5
’-3’
外切酶活性的聚合酶。为了保证在60-70℃的高温条件下聚合酶也能保持比较高的活性，发明人通过大量研究，从大量的聚合酶中挑选了热敏感的具有高保真性的聚合酶作为末端修复的核心酶，和嗜高温的没有外切酶活性的聚合酶作为突出腺苷酸化的核心酶。根据本发明的实施例，所述聚合酶为klenow exo酶或hemoklen taq酶。根据本发明的实施例，所述末段修复及3'端加a反应中使用的酶还包括t4 pnk。
49.根据本发明的实施例，所述末端修复及3'端加a反应缓冲液包括9-11mm tris-hcl、1.3-1.8mm mgcl2、48-52mm kcl，且ph值为8.5-9.5。发明人发现本发明实施例的缓冲液，兼容性更佳，稳定性显著提高，适用于文库构建过程中的多步反应，使文库构建过程中
的多步反应可以连续进行，无需纯化，显著降低了反应时间，并且，有利于提高构建dna文库的方法的效率和稳定性。
50.下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
51.实施例1
52.利用本发明实施例的方法，对10名孕妇的血液样本进行建库，具体如下：
53.1、实验方法
54.本实施例中使用的酶及试剂无特殊说明均购自诺唯赞。
55.步骤1：抽提600μl血浆中cfdna.
56.步骤2：末端修复和3'端加a反应
57.制备如下表所示反应混合液：
58.试剂单个反应量(μl)dna30(约6ng dna)连接缓冲液4dntps3.9klenow exo-(5u/μl)0.5水2.4
59.datp：dctp：dttp：dgtp：atp＝4:1:1:1:1,10
×
dntps，缓冲液的datp浓度为10mm。
60.连接缓冲液的成分：10mm tris-hcl、1.5mm mgcl2、50mm kcl，且ph值为9.0。
61.反应条件：37℃15分钟，65℃20分钟。待反应完成后获得加a产物。
62.步骤3：连接反应
63.制备如下表所示反应混合液：
64.试剂单个反应(μl)加a产物40.8缓冲液45.8t4 dna连接酶(thermo)1水3接头(vazyme-n805)1
65.反应条件：20℃，30min反应，进行
×
1.0磁珠纯化。纯化后获得连接产物。
66.步骤4:测定连接产物的量
67.将纯化过的“连接产物1”送检q-pcr测浓度。
68.2、实验结果
69.10个孕妇血浆样本的建库结果如下表所示：
70.表1
71.样本名文库产量(fmol)文库浓度(pmol/l)样本12.86285.90样本23.12312.15样本33.87386.86
样本42.80280.47样本53.54354.35样本63.83382.90样本73.97396.89样本82.91290.99样本93.54354.35样本103.83382.90
72.本发明实施例的方法，以600μl血浆样本起始建库，文库产量均能满足illumina测序平台(nexseq ar550，最低上机浓度10pmol/l)测序要求，上机数据q30(％)均大于91％，duplication_rate均小于1.5％。本发明利用低起始量的血浆进行pcr-free文库构建，在有限血浆样本的前提下，更大程度降低扩增带来的偏好，提高测序数据的覆盖度和利用率，增加检测的灵敏度，有助于数据分析挖掘更多有效数据。另外，低起始量血浆在提取建库过程可以使用自动化提高建库通量。
73.实施例2
74.利用实施例1的建库方法，只是建库的接头浓度和纯化倍数不同，文库产量(fmol)实验结果具体如下：
75.表2
[0076][0077]
在本次测试中，不同的接头量在本发明条件下均成功建库，并且能观察到建库浓度随着接头量减少而降低，说明接投入量直接影响建库浓度。考虑到成本，最终选取10p投入量作为建库体系，最终也能获得有效建库产量。另外，在4p相同的接头含量下，能观察到x1.0的纯化体系高于x0.5，根据片段筛选的原理，可能是x1.0磁珠较x0.5能回收回来更多的文库(文库主峰在300bp左右)。所以虽然本次测试中没有10p接头+x1.0的条件，但是能预测在这个条件能获得比10p接头+x0.5更高的建库浓度。由此，1.0纯化更适合本发明实施例的建库方法。
[0078]
实施例3
[0079]
本实施例中，按照实施例1的建库试剂进行建库测试，为了扩大差异将产物进行pcr扩增，起始样本为2ng去除大片段的cfdna，只是改变了加a反应中连接酶的酶量、反应温
度和反应时间，检测不同条件下的文库产量，具体如下表所示：
[0080]1[0081][0082][0083]
以上结果同时说明单个变量0.5ul酶量、37℃和10min反应时间在加a过程中处于线性期，处于安全的加a范围，但是超过这个范围的加a过程可能存在过度加a或者加a效率没有充分利用的情况，都会导致文库浓度降低。由此，连接酶的酶量、反应温度和反应时间均直接影响文库产量，综合考虑建库的产量、成本和时间，以0.5ul酶+37℃+10min条件更优。
[0084]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0085]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。