一种重金属耐受性酵母菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物应用领域，尤其涉及一种重金属耐受性酵母菌及其应用。

背景技术：

随着工业生产的快速发展，重金属污染日趋严重并已成为全球关注的问题。重金属污染的主要来源是采矿业、工业生产和污水排放，它们向环境释放铜、镍、锌、铅等多种有毒金属。重金属在环境中易积累，难降解，且污染后难以发现。一方面，它们破坏了人类赖以生存的环境，另一方面，它们可以通过食物链的生物积累对人类造成损害，最终损害人类自身的健康，如对神经、肺、肝、骨和神经小叶的损害。

处理重金属污染的传统方法多为物理化学方法，如化学沉淀法、离子交换法、反渗透法、活性炭吸附法和植物动物修复法等，它们各有优点，但不同程度地存在着操作复杂、成本高、能耗大、容易产生二次污染的问题。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重金属耐受性酵母菌及其应用，旨在解决现有处理重金属污染的方法不同程度地存在着操作复杂、成本高、能耗大、容易产生二次污染的问题。

本发明的技术方案如下：

一种重金属耐受性酵母菌，其中，该菌株于2020年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmccno.20530。

所述重金属耐受性酵母菌，其中，所述重金属包括锌和镍。

所述重金属耐受性酵母菌，其中，在100mg/l的锌和80mg/l的镍的单一环境中，所述重金属耐受性酵母菌对镍和锌的吸附率分别为72.05％和100％，对镍和锌的富集量分别为22.06mg/g和16.76mg/g。

所述重金属耐受性酵母菌，其中，在100mg/l的锌和80mg/l的镍的混合环境中，所述重金属耐受性酵母菌对镍和锌的吸附率分别为49.44％和49.69％，对镍和锌的富集量分别为14.22mg/g和16.48mg/g。

一种重金属耐受性酵母菌的应用，其中，将所述重金属耐受性酵母菌用于富集镍和锌。

有益效果：本发明从深圳福田红树林自然保护区筛选出属于白地霉属的一种重金属耐受性酵母菌，该菌株名为geotrichumsp.cs-67，该菌株于2020年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmccno.20530。通过实验验证，所述重金属耐受性酵母菌对镍和锌具有较佳的耐受性，这为研究在镍和锌环境中利用geotrichumsp.cs-67来富集重金属镍和锌打下基础，从而丰富了利用微生物来修复重金属污染的微生物菌库，提高了微生物对重金属的富集能力并最终为实现利用微生物来修复水体、土壤重金属污染提供技术支持。所述geotrichumsp.cs-67在短时间内发酵能够得到大量的微生物生物量，且成本低，操作简单，其具有较高的修复潜力，能有效用于重金属污染治理。

附图说明

图1为本发明提供的重金属耐受性酵母菌培养后的正面平板观察照片。

图2为本发明提供的重金属耐受性酵母菌扫描电子显微镜照片。

图3为本发明提供的重金属耐受性酵母菌基于26srdnad1/d2区基因序列构建的neighbor-joining系统发育树。

图4a为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在不含金属镍的ym固体培养基中的生长状况图。

图4b为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在金属镍浓度为30mg/l的ym固体培养基中的生长状况图。

图4c为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在金属镍浓度为60mg/l的ym固体培养基中的生长状况图。

图4d为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在金属镍浓度为90mg/l的ym固体培养基中的生长状况图。

图4e为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在金属镍浓度为100mg/l的ym固体培养基中的生长状况图。

图4f为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在金属镍浓度为110mg/l的ym固体培养基中的生长状况图。

图5a为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在不含金属锌的ym固体培养基中的生长状况图。

图5b为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在金属锌浓度为250mg/l的ym固体培养基中的生长状况图。

图5c为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在金属锌浓度为500mg/l的ym固体培养基中的生长状况图。

图5d为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在金属锌浓度为750mg/l的ym固体培养基中的生长状况图。

图5e为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在金属锌浓度为900mg/l的ym固体培养基中的生长状况图。

图5f为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在金属锌浓度为950mg/l的ym固体培养基中的生长状况图。

图6a为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在金属镍80mg/l和锌100mg/l的混合环境中时间和吸附率的关系图。

图6b为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在金属镍80mg/l和锌100mg/l的混合环境中时间和吸附量的关系图。

图7a为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在金属镍80mg/l的环境中时间和吸附率的关系图。

图7b为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在金属镍80mg/l的环境中时间和吸附量的关系图。

图8a为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在金属锌100mg/l的环境中时间和吸附率的关系图。

图8b为本发明提供的重金属耐受性酵母菌在金属镍100mg/l的环境中时间和吸附量的关系图。

具体实施方式

本发明提供一种重金属耐受性酵母菌及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

微生物修复法是一种很有潜力的重金属污染治理方法，利用土壤中的某些微生物对重金属具有吸收、沉淀、氧化和还原等作用，从而降低污染环境中重金属的毒性，它不仅修复快，而且对周围环境影响较小，不会产生二次污染，利用生长细胞进行生物富集是微生物修复法中重要的一种技术。生长中的细胞具有自给自足的能力，在物理吸附后能继续代谢和吸收金属，分散在细胞内的金属进入空泡等细胞，再与细胞内的蛋白质螯合，这些过程通常是不可逆的。

一般来说，土壤中的微生物容易受到金属污染物的影响，导致微生物种群密度下降甚至灭绝。然后，微生物具有很强的环境特异性，根据环境的不同可表现出不同的形态结构和功能，从生物进化的角度来看，适者生存，微生物能够在重金属污染的环境中生存并形成一定的耐受性，逐渐成为土壤中的优势种群，甚至能利用重金属完成一定的生理活动。

红树林是陆地向海洋过渡的特殊生态系统，红树植物发达的根系，能够减缓潮水的冲刷效应，促进颗粒物的沉降和沉积物的发育，红树植物产生的凋落物能够在林下沉积物中降解，释放出富含氮官能团的有机质，增加颗粒物表面电荷，提高沉积物对重金属离子的吸附作用。因此，红树林土壤环境中积累了大量城市径流带来的重金属污染物含量，是培养具有抗重金属功能微生物的良好环境。

基于此，本发明提供了一种从深圳福田红树林自然保护区筛选出的属于白地霉属的重金属耐受性酵母菌，该菌株名为geotrichumsp.cs-67，于2020年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmccno.20530。

具体来讲，在深圳福田红树林自然保护区表层土壤进行样品的采集，分别在凤塘河、鱼塘边、潮滩和路边植被茂盛处采集四份表层土壤样品，放置于冰上，运回实验室于4℃冰箱保存。

利用传统平板培养法对菌株进行筛选：将所述土壤样品与无菌水混合摇匀，进行梯度稀释，取100μl的稀释液涂布到含有重金属锌和镍的固体培养基上，加入玻璃珠在台面呈十字形摇晃，使稀释液均匀的铺在培养基上，室温培养2周。在所述固体培养基中得到如图1及图2所示的菌株，如图所示，在固体培基上观察到菌落为乳白色粘液状，菌落表面光滑，有纹状，菌落边缘不平滑，呈根状；在扫描电子显微镜6000倍的放大倍数下观察到菌体呈棒状，长4.83-8.06μm，宽3.26μm。

采用fastdnaspinkitforsoil试剂盒提取培养得到的菌株，基于26srdna的d1/d2序列分析对得到的所述菌株进行分类学鉴定，采用通用引物nl-1和nl-4进行扩增。pcr反应在50μl体积中进行，其中含有2μl模板dna，正反向引物各2μl，25μl的taq-dan聚合酶和19μl的ddh2o；pcr反应程序为：96℃，6min，随后进行32个循环，包括95℃25s、64℃30s和72℃90s，最后在72℃下延伸5min。

pcr产物经tae缓冲液1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，使用abi3730xl自动dna测序仪(appliedbiosystems)测定26srdnad1/d2区基因序列，测序引物为nl1/nl4，序列被提交到ncbi核苷酸数据库中，并用blast与genbank中的核苷酸序列进行同源性比较确定到种属，且基于26srdnad1/d2区使用邻接法构建系统发育进化树，结果如图3所示，本实施例提取得到的潜在新酵母菌归于geotrichum属，与geotrichumcandidum亲缘关系最近，命名为geotrichumsp.cs-67。

进一步地，从酵母麦芽固体培养基(ym固体培养基)中提取直径为0.6cm的菌丝体盘，然后转移到含金属镍浓度分别为0、30、60、90、100和110mg/l的ym固体培养基中央，放置于28℃的培养箱中1个月，观察酵母菌的生长情况，测量菌落生长直径，另外，空白对照组不添加重金属，结果如图4a-图4f所示，从图中可以看出，除金属浓度最高的培养基外，均有酵母菌生长，但随着培养基中金属镍的浓度逐渐增高，生成的酵母菌数量越少，说明所述酵母菌对所述金属镍具有较佳的耐受性。

进一步地，从ym固体培养基中提取直径为0.6cm的菌丝体盘，然后转移到含锌金属浓度分别为0、250、500、750、900和950mg/l的ym固体培养基中央，放置于28℃的培养箱中1个月，观察酵母菌的生长情况，测量菌落生长直径。另外，空白对照组不添加重金属，结果如图5a-图5f所示，从图中可以看出，除金属浓度最高的培养基外，均有酵母菌生长，但随着培养基中金属锌的浓度逐渐增高，生成的酵母菌数量越少，说明所述酵母菌对所述金属锌也具有较佳的耐受性。

在一些实施方式中，通过实验验证所述geotrichumsp.cs-67对金属镍和锌具有富集作用：首先，将geotrichumsp.cs-67在ym固体培养基上活化3—5天，然后从琼脂表面(约30mg干物质)获得菌丝体，并转移到100ml液体培养基中，于28℃，200rpm的摇床中摇培得到快速生长期的种子溶液。将种子溶液以5％的接种量转移到100ml新鲜的ym液体培养基中，并在相同条件下培养约12小时。当培养基中有3×10⁹cell/ml时，分别从配制好的金属母液中加入相应体积的锌和镍，使培养基中镍和锌的终浓度分别为80mg/l和100mg/l，添加金属后，每隔12小时取样一次，持续72h。

将金属富集后的酵母菌离心，用超纯水洗涤两次，80℃干燥至恒重，称重计算生物量(m)。考虑到离心对金属离子的影响，使用whatman滤纸过滤得到上清液。上清液用硝酸-盐酸(v:v＝1:3)完全消化，并用超纯水稀释，溶液中的金属浓度由电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes，optima7000，perkinelmer)测定。金属的去除率(r)和生物累积量(q)由下式计算r＝(1-ct/c0)×100％

q＝(c0-ct)×v/m

公式中，r为ym液体培养基中的金属去除率(％)，ct为ym液体培养基中金属的终浓度(mg/l)，c0为ym液体培养基中的初始金属浓度(mg/l)，v为ym液体培养基的体积(l)，m为酵母菌的干生物量(g)，q为酵母菌的金属生物累积能力(mg/g)，所有实验一式三份，数据用平均值表示。

本实施例验证了所述geotrichumsp.cs-67在镍80mg/l和锌100mg/l的环境中探究的富集能力，结果如图6a和图6b所示，从图中可以看出随着时间的延长，geotrichumsp.cs-67对锌和镍的吸附率和生物积累量逐渐上升，在60h时达到了最大值，geotrichumsp.cs-67对锌和镍的吸附率分别为49.44％和49.69％，geotrichumsp.cs-67对锌和镍的生物积累量分别为14.22mg/g和16.48mg/g。

在一些实施方式中，通过实验验证所述geotrichumsp.cs-67对金属镍具有富集作用：首先，将geotrichumsp.cs-67在ym固体培养基上活化3—5天，然后从琼脂表面(约30mg干物质)获得菌丝体，并转移到100ml液体培养基中，于28℃，200rpm的摇床中摇培得到稳定期的种子溶液。将种子溶液以5％的接种量转移到100ml新鲜的ym液体培养基中，并在相同条件下培养约12小时。当培养基中有3×10⁹cell/ml时，分别从配制好的金属母液中加入相应体积的镍，使培养基中镍的终浓度分别为80mg/l，添加金属后，每隔12小时取样一次，持续72h。结果如图7a和图7b所示，从图中可以看出随着时间的延长，geotrichumsp.cs-67对镍的吸附率和生物积累量逐渐上升，在60h时达到了最大值，分别为72.05％和22.06mg/g。

在一些实施方式中，通过实验验证所述geotrichumsp.cs-67对金属锌具有富集作用：首先，将geotrichumsp.cs-67在ym固体培养基上活化3—5天，然后从琼脂表面(约30mg干物质)获得菌丝体，并转移到100ml液体培养基中，于28℃，200rpm的摇床中摇培得到稳定期的种子溶液。将种子溶液以5％的接种量转移到100ml新鲜的ym液体培养基中，并在相同条件下培养约12小时。当培养基中有3×10⁹cell/ml时，分别从配制好的金属母液中加入相应体积的锌，使培养基中锌的终浓度分别为80mg/l，添加金属后，每隔12小时取样一次，持续72h。结果如图8a和图8b所示，从图中可以看出geotrichumsp.cs-67在60h已经完全将锌吸附,对锌的吸附率和生物积累量分别为100％和16.76mg/g。

通过实验验证，本发明提供的所述重金属耐受性酵母菌对镍和锌具有较佳的耐受性，这为研究在镍和锌环境中利用geotrichumsp.cs-67来富集重金属镍和锌打下基础，从而丰富了利用微生物来修复重金属污染的微生物菌库，提高了微生物对重金属的富集能力并最终为实现利用微生物来修复水体、土壤重金属污染提供技术支持。所述geotrichumsp.cs-67在短时间内发酵能够得到大量的微生物生物量，且成本低，操作简单，其具有较高的修复潜力，能有效用于重金属污染治理。

基于所述重金属耐受性酵母菌的特性，本发明还提供一种重金属耐受性酵母菌的应用，将所述重金属耐受性酵母菌用于富集镍和锌，从而实现利用微生物来修复水体、土壤重金属污染。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。