一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因抑制的方法与流程

文档序号：23339120发布日期：2020-12-18 16:32阅读：105来源：国知局

本发明涉及一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因抑制的方法，属于基因工程和生物工程技术领域。

背景技术：

氧化葡萄糖酸杆菌属是醋酸菌群的一部分，因其能够不完全氧化广泛的碳水化合物和醇类，氧化葡萄糖酸杆菌菌株已被成功应用于食品、医药和化妆品等工业领域，生产如维生素c、米格列醇、二羟基丙酮和葡萄糖酸盐等产品。特别是氧化葡萄糖酸杆菌因能以芳香醇、脂肪醇和5-酮果糖为底物合成调味成分而在食品添加剂和甜味剂的生产中具有重要应用。氧化葡萄糖酸杆菌因没有完整的糖酵解跟柠檬酸循环，其主要的中心碳代谢途径为磷酸戊糖途径与entner-doudoroff途径。

随着代谢工程及合成生物学的发展，对于氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程改造以提升其生产转化能力越来越引起科研工作者的重视。然而，相对于大肠杆菌，酿酒酵母等模式菌株，作为工业菌株的氧化葡萄糖酸杆菌可用的基因操作工具非常有限。目前，仅有少数的穿梭质粒可用，且这些质粒在同一氧化葡萄糖酸杆菌内通常不兼容，限制了质粒游离表达多个基因的可能性。同时，对于氧化葡萄糖酸杆菌基因组的操作工具通常依赖于抗性整合跟利用五氟尿嘧啶反选整合的方法。因氧化葡萄糖酸杆菌对于多种抗生素的天然抗性，抗性整合被严重制约。另外因利用五氟尿嘧啶反选假阳性极多，大大增加了工作量。

因此，需要找到一种能够高效、简便的抑制氧化葡萄糖酸杆菌中基因表达的方法，从而推动对于氧化葡萄糖酸杆菌的研究与应用。

技术实现要素：

为了解决目前存在的问题，本发明通过转化能够转录crrna的p2-5-patse-crrna(图1)，实现了对氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003基因的抑制，成功在氧化葡萄糖酸杆菌中开发出了基于ie型crispr-cas系统的crispri系统，扩展了氧化葡萄糖酸杆菌中可应用的基因操作工具。

本发明的第一个目的是提供一种抑制氧化葡萄糖酸杆菌中基因表达的元件，所述元件由crrna、表达crrna的启动子和表达载体组成。

在本发明的一种实施方式中，crrna由目的基因的spacer序列和其两端的重复序列组成。

在本发明的一种实施方式中，以p2-5载体为表达载体，其核苷酸序列如seqidno.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达crrna的启动子为任意能够在氧化葡萄糖酸杆菌中表达的启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述表达crrna的启动子包括patse。

在本发明的一种实施方式中，所述patse的核苷酸序列如seqidno.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述氧化葡萄糖酸杆菌为氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003。

本发明的第二个目的是提供一种抑制氧化葡萄糖酸杆菌中基因表达的方法，利用所述的元件抑制基因的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述基因包括红色荧光蛋白、entner-doudoroff途径关键基因edd和磷酸戊糖途径关键基因gnd。

在本发明的一种实施方式中，所述edd基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述gnd基因的核苷酸序列如seqidno.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)选取目的基因pam序列为aag的合适位点的32bp序列作为spacer序列；

(2)在spacer序列的两端加上重复序列后，与表达载体连接，获得表达载体p2-5-patse-crrna；

(3)将p2-5-patse-crrna转化至氧化葡萄糖酸杆菌中。

本发明还保护所述元件或所述方法在在氧化葡萄糖酸杆菌中抑制基因表达的应用。

本发明的有益效果：

本发明以氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003为宿主，表达一系列重组质粒p2-5-patse-crrna，得到了表达相应靶基因crrna的重组氧化葡萄糖酸杆菌，利用获得的重组氧化葡萄糖酸杆菌验证了其基因抑制的作用。本发明的这种抑制目的基因表达的方法，为在氧化葡萄糖酸杆菌中抑制目的基因提供了一种新方法，能够快速、有效抑制目的基因的表达，提高了对氧化葡萄糖酸杆菌的基因编辑效率。

附图说明

图1为p2-5-patse-crrna穿梭质粒图谱。

图2为mcherry抑制图；(a)：mcherry抑制质粒图，(b)：抑制前后相对荧光水平；-：阴性对照，+：阳性对照，yzmcherry：mcherry抑制菌株。

图3为抑制gnd、edd前后相对转录水平；yzedd：edd抑制菌株，yzgnd：gnd抑制菌株。

具体实施方式

(一)培养基

lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l。加入17g/l琼脂粉，以配制lb固体培养基。

山梨醇培养基：酵母粉10g/l，山梨醇50g/l。加入17g/l琼脂粉，以配制山梨醇固体培养基。

(二)氧化葡萄糖酸杆菌感受态制备(冰上操作)：挑取单菌落接种山梨醇培养基30℃过夜培养，次日10％转接至50ml新液体培养基30℃培养4-6h，发酵液离心弃上清，加入用10％甘油配置的0.1m的预冷氯化钙洗涤一次，4℃离心弃上清，用预冷的10％甘油洗涤两次后每份40ul分装。

(三)氧化葡萄糖酸杆菌转化：将2ug质粒加入到40ul感受态中，混匀后加入到预冷的1mm间隙的电转杯中，用bio-radmicropulser进行电转，条件为1.8kv电击5ms。电激完后立即加入1ml冷却山梨醇液体培养基，30℃培养3h后涂布至含有50ug/ml头孢氨苄及50ug/ml卡那霉素的固体山梨醇平板上培养约24h至长出可见菌落。

(四)qpcr步骤：以菌株wsh-003作为对照，分别将野生菌株氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003、重组氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003/p2-5-patse-crrnagnd和重组氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003/p2-5-patse-crrnaedd的单菌落接种于液体山梨醇培养基，30℃培养12h后转接至50ml新液体山梨醇培养基。取24h样品提取rna进行qpcr分析。使用来自omega公司(中国广州)的细菌rna试剂盒按说明书提取样品的总rna，并通过eppendorf公司生物光度计(德国hamburg)测量浓度。

使用takara公司(中国大连)的试剂盒primescript^tmrtmastermix(perfectrealtime)按说明书从总rna合成cdna。以16srrna基因(qpcr引物：16srrna-f：acccttgtctttagttgccagcac；16srrna-r：ccactgtcaccgccattgtagc)为内标，测定编码6-磷酸葡萄糖酸脱水酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的edd(qpcr引物：edd-f：tccgccttcatcaatccgaatacg；edd-r：atcgccttctcatccacgcaatg)和gnd(qpcr引物：gnd-f：gtccgtcgtgcagaagaactctc；gnd-r：tccttgggtccgccgtacatc)的表达水平。在lightcycler480ii仪器(roche，曼海姆，德国)上进行qrt-pcr分析。根据takara公司(中国大连)的试剂盒premixextaq^tmii(tlirnasehplus)说明书制备反应混合物并设置扩增程序。使用lightcycler软件(版本3.3)确定ct值，每个样品重复三次。

(五)infusion-cloning试剂盒购自南京诺唯赞公司。

实施例1：crrna系统抑制氧化葡萄糖酸杆菌中mcherry表达

设计用于载体p2-5-p116-mcherry线性化的引物对f1和r1，

f1：

atcctctggatgcaacgatcctgaagcctcgtgtgttccccgcacacgcggggatgaaccgttttttttcgtcagcgggtgttggc(下划线部分为同源臂序列，下同)，

r1：tcaatattgagcccacggaaaactttcccacgccctgacgggcttg。

以实验室保存的p2-5-p116-mcherry质粒(seqidno.2)为模板，以该引物对其进行pcr线性化扩增，选择2×phantamaxmastermix(vazyme公司)进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，56℃，15s，72℃，4min进行；终延伸72℃，5min。

设计用于扩增patse-mcherrycrrna序列的引物对f2和r2

f2：

tgggaaagttttccgtgggc，

r2：

gcttcaggatcgttgcatccagaggatcggttcatccccgcgtgtgcggggaacacaaaccaatgaaaaataaagattattccgttcgga。

以氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003基因组序列(其核苷酸序列如genbankassemblyaccession:gca_000263255.1所示)为模板，以该引物对其进行pcr扩增，选择2×phantamaxmastermix(vazyme公司)进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，56℃，15s，72℃，10s进行；终延伸72℃，5min。

将上述两次pcr得到的产物进行纯化回收，并用infusion-cloning的方法将两个纯化片段重组为载体p2-5-patse-mcherrycrrna-p116-mcherry，并转化大肠杆菌jm109，将转化子送至上海生工测序，测序正确的即为阳性转化子，从阳性转化子中提取质粒，得到正确的p2-5-patse-mcherrycrrna-p116-mcherry质粒，将质粒p2-5-patse-mcherrycrrna-p116-mcherry转化氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003，对转化子进行菌落pcr验证。

将菌落pcr验证正确的重组氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003/p2-5-patse-mcherrycrrna-p116-mcherry(以菌株wsh-003作为阴性对照，以转化有p2-5-p116-mcherry载体的菌株wsh-003/p2-5-p116-mcherry作为阳性对照)，单菌落接种于液体山梨醇培养基，30℃培养16h后取200ul发酵液于黑色96孔板，利用酶标仪检测其荧光强度。激发波长为488nm，发射波长为520nm。通过对比分析可知，重组氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003/p2-5-patse-mcherrycrrna-p116-mcherry细胞内的荧光强度明显比阳性对照弱(图2)，说明了表达mcherrycrrna后对mcherry表达的抑制作用，说明了氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003内源crispri系统的有效性。

实施例2：利用crrna系统抑制氧化葡萄糖酸杆菌中edd的表达

对氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003基因组上的基因edd(核苷酸序列如seqidno.3所示)进行弱化。

设计用于载体p2-5线性化的引物f3，

f3：

gggcgtctcgcgtccgcgtctggcctgcggaaagtgttccccgcacacgcggggatgaaccgttttttttcctcttcgctattacgccag。

利用f3和r1，以实验室保存的p2-5质粒(seqidno.4)为模板，以该引物对其进行pcr线性化扩增，选择2×phantamaxmastermix(vazyme公司)进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，56℃，15s，72℃，3min进行；终延伸72℃，5min。

设计用于扩增patse-crrnaedd序列的引物r3，

r3：

tccgcaggccagacgcggacgcgagacgcccggttcatccccgcgtgtgcggggaacacaaaccaatgaaaaataaagattattccgttc。

用引物f2和r3，以氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003基因组序列为模板，进行pcr扩增，选择2×phantamaxmastermix(vazyme公司)进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，56℃，15s，72℃，10s进行；终延伸72℃，5min。

将上述两次pcr后的产物纯化回收，用infusion-cloning的方法将两步纯化片段重组为载体p2-5-patse-crrnaedd，并转化大肠杆菌jm109，将转化子送至上海生工测序，测序验证通过的即为阳性转化子，得到阳性转化子p2-5-patse-crrnaedd，并提取质粒，得到质粒p2-5-patse-crrnaedd。

将测序正确的p2-5-patse-crrnaedd转化氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003，菌落pcr验证正确后，得到重组氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003/p2-5-patse-crrnaedd。

以菌株wsh-003作为对照，分别将菌株wsh-003和菌株wsh-003/p2-5-patse-crrnaedd的单菌落接种于液体山梨醇培养基，30℃培养12h后转接至50ml新液体山梨醇培养基。取24h样品提取rna进行qpcr分析。

通过对比分析可知，重组氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003/p2-5-patse-crrnaedd中相应的edd表达量比对照低(图3)，说明了表达crrnaedd后对edd表达的抑制作用。

实施例3：利用crrna系统抑制氧化葡萄糖酸杆菌中gnd的表达

对氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003基因组上的基因gnd(核苷酸序列如seqidno.5所示)进行弱化。

设计用于载体p2-5线性化的引物f4，

f4：gtgggcgcgccacgggggcagacacattcgaggtgttccccgcacacgcggggatgaaccgttttttttcctcttcgctattacgcc。

利用f4和r1，以实验室保存的p2-5质粒为模板，以该引物对其进行pcr线性化扩增，选择2×phantamaxmastermix(vazyme公司)进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，56℃，15s，72℃，3min进行；终延伸72℃，5min。

设计用于扩增patse-crrnagnd序列的引物r4，

r4：

aatgtgtctgcccccgtggcgcgcccaccggttcatccccgcgtgtgcggggaacacaaaccaatgaaaaataaagattattccgttcg。

利用f2和r4，以氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003基因组序列为模板，进行pcr扩增，选择2×phantamaxmastermix(vazyme公司)进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，56℃，15s，72℃，10s进行；终延伸72℃，5min。

将上述两步pcr的产物进行纯化回收，用infusion-cloning的方法将两步纯化片段重组为载体p2-5-patse-crrnagnd，并转化大肠杆菌jm109，将转化子送至上海生工测序，测序验证通过的即为阳性转化子，得到阳性转化子p2-5-patse-crrnagnd，从阳性转化子中提取得到质粒p2-5-patse-crrnagnd。

将测序正确的p2-5-patse-crrnagnd转化氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003，进行菌落pcr验证正确后，得到重组氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003/p2-5-patse-crrnagnd。

以菌株wsh-003作为对照，分别将菌株wsh-003和菌株wsh-003/p2-5-patse-crrnagnd的单菌落接种于液体山梨醇培养基，30℃培养12h后转接至50ml新液体山梨醇培养基。取24h样品提取rna进行qpcr分析。

通过对比分析可知，重组氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003/p2-5-patse-crrnagnd中的gnd表达量比对照低(图3)，说明了表达crrnagnd后对gnd表达的抑制作用。

实施例4

利用实施例2和3中的方法对氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003中醛酮还原酶基因(核苷酸序列与ncbi登录号为nz_jh668181.1所示序列的第66081位至66920位一致)、磷酸葡糖酸脱水酶基因(核苷酸序列与ncbi登录号为nz_jh668180.1所示序列的第212455位至214302位一致)、山梨醇脱氢酶sldba1小亚基基因sldb1(核苷酸序列与ncbi登录号为nz_jh668178.1所示序列的第409140位至409520位一致)、山梨醇脱氢酶sldba1大亚基基因slda1(核苷酸序列与ncbi登录号为nz_jh668178.1所示序列的第406918位至409140位一致)进行敲除。结果显示，同样也能够取得与实施例3类似的效果，抑制上述基因的表达。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因抑制的方法

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<212>dna

<213>人工序列

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