一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因敲除的方法与流程

本发明涉及一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因敲除的方法，属于基因工程及生物工程技术领域。

背景技术：

氧化葡萄糖酸杆菌属于醋酸菌群,是一种专性需氧革兰氏阴性微生物,它们能很好地适应含丰富醇糖的栖息地，如鲜花、水果、发酵食品和饮料。由于其众所周知的不完全氧化能力,这种细菌已经成功地应用于商业生产维生素c前体，二羟基丙酮、葡糖酸、米格列醇等。氧化葡萄糖酸杆菌具有两个空间分离的醇类和碳水化合物代谢系统。一方面，含大量膜结合脱氢酶的周质空间使得不同底物快速不完全氧化并将对应的产物释放到发酵培养基中。另一方面，由于缺乏磷酸果糖激酶和琥珀酸脱氢酶，这种细菌缺失糖酵解途径和完整的三羧酸循环,戊糖磷酸途径(ppp)和entner-doudoroff途径(edp)是氧化葡萄糖酸杆菌中分解糖类的两个重要途径。

作为一种应用广泛的工业菌种，通过基因工程改造提高氧化葡萄糖酸杆菌的性能具有重要意义。在前人的工作中，通过蛋白质组学分析，鉴定出一个强启动子。一系列合适的人工聚(a/t)尾被报道可以提高编码山梨醇脱氢酶的sldhab基因的mrna丰度。将氧化葡萄糖酸杆菌中隐蔽质粒的par-rep基因插入puc中，构建了几个穿梭质粒进行基因过表达。分别以5-氟尿嘧啶和蔗糖为反选试剂，建立了两种无标记基因敲除方法。这些研究为氧化葡萄糖酸杆菌的代谢工程做出了贡献。然而，与大肠杆菌、酿酒酵母等模型微生物相比，工业菌株氧化葡萄糖酸杆菌的遗传工具研究相对匮乏。

crispr/cas系统为约46％的细菌和90％的古生菌提供适应性免疫，以抵御质粒和噬菌体等侵入性核酸元件。第2类单cas核酸酶，如cas12或cas9，广泛应用于微生物、动植物等多种生物的基因组修饰。然而，大多数天然crispr/cas系统由多亚基复合物组成，属于第1类。第1类包括i、iii和iv型。其中i型系统，包括i-a到i-f加上i-u是最普遍的类型。除了i-f型系统使用cas2/3作为dna裂解核酸酶外，其他i型系统使用cas3来执行此功能。而i型系统的pam通常位于前间隔序列的5’端。i型系统近年来受到越来越多的关注，基于内源性i型crispr/cas系统的基因敲除系统已在数种微生物中得到开发。到目前为止，还没在氧化葡萄糖酸杆菌中成功开发crispr/cas基因敲除系统的报道。

如果能够在氧化葡萄糖酸杆菌中使用crispr/cas系统来敲除基因，将大大缩短敲除筛选的时间、有效提高基因突变的筛选效率。

技术实现要素：

本发明中，通过crisprcasfinder对氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003基因组进行分析，鉴定出一个非常典型的i-e型crispr/cas系统。然后通过分析进一步确定了用于基因敲除的cas蛋白簇的表达。本发明中，crispr/cas基因敲除系统的开发丰富了氧化葡萄糖酸杆菌的基因编辑工具，促进了用以提高其性能的代谢工程修饰。此外，它可能对其他基因操作工具匮乏菌株的代谢工程改造有启示。

本发明的第一个目的是提供一种敲除氧化葡萄糖酸杆菌基因的工具，所述工具由cas3蛋白、crrna、表达crrna的启动子和表达载体组成；所述cas3蛋白的氨基酸序列如seqidno.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述crrna由任意能够在氧化葡萄糖酸杆菌中可以表达的启动子启动；所述cas3蛋白由氧化葡萄糖酸杆菌自身的启动子启动。

在本发明的一种实施方式中，crrna由目的基因的spacer序列和其两端的重复序列组成。

在本发明的一种实施方式中，所述表达crrna的启动子包括启动子patse，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

在本发明的一种实施方式中，启动cas3蛋白表达的启动子包括ptufb、pb932_2000或p112。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子ptufb公开于xu等enhancedproductionofl-sorbosefromd-sorbitolbyimprovingthemrnaabundanceofsorbitoldehydrogenaseingluconobacteroxydanswsh-003.公开日为2014年。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子pb932_2000公开于hu等enhancedproductionofl-sorboseinanindustrialgluconobacteroxydansstrainbyidentificationofastrongpromoterbasedonproteomicsanalysis.公开日为2015年。

在本发明的一种实施方式中，启动cas3蛋白表达的启动子优选为p112，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

在本发明的一种实施方式中，以p2-1载体为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，p2-1载体的核苷酸序列如seqidno.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述氧化葡萄糖酸杆菌为氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003。

本发明的第二个目的是提供一种敲除氧化葡萄糖酸杆菌中目的基因的方法，利用所述工具，对氧化葡萄糖酸杆菌中的目的基因进行敲除。

在本发明的一种实施方式中，将所述工具转入氧化葡萄糖酸杆菌细胞中得到重组菌，再将重组菌培养，实现对氧化葡萄糖酸杆菌中目的基因的敲除或缺失。

在本发明的一种实施方式中，所述氧化葡萄糖酸杆菌为氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003。

在本发明的一种实施方式中，将目的基因的上下游同源臂融合的片段与所述工具共同转入氧化葡萄糖酸杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述目的基因包括山梨糖还原酶的编码基因，其核苷酸序列如seqidno.5所示。

本发明还保护所述敲除氧化葡萄糖酸杆菌基因的工具，或敲除氧化葡萄糖酸杆菌中目的基因的方法在氧化葡萄糖酸杆菌中基因敲除中的应用。

本发明的有益效果：

本发明以氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003为宿主，表达重组质粒p2-1-p112-cas3-patse-crrna，得到了表达相应靶基因crrna与氧化葡萄糖酸杆菌wsh-005cas3的重组氧化葡萄糖酸杆菌，利用获得的重组氧化葡萄糖酸杆菌验证了其基因敲除的作用。相比基于5-氟尿嘧啶和蔗糖为反选试剂的基因敲除方法，本发明的方法不需要漫长的筛选过程，操作更加简便、快捷、高效。

附图说明

图1为氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003内源ie型crispr/cas系统基因组分布(a)及转录水平(b)图。

图2为p2-1-p112-cas3-patse-crrna穿梭质粒图谱。

图3为crispr/cas系统基因敲除原理图。

图4为crispr/cas系统敲除山梨糖还原酶基因琼脂糖凝胶电泳图(a)及测序验证图(b)。

具体实施方式

(一)培养基

lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l。加入17g/l琼脂粉，以配制lb固体培养基。

山梨醇培养基：酵母粉10g/l，山梨醇50g/l。加入17g/l琼脂粉，以配制山梨醇固体培养基。

(二)氧化葡萄糖酸杆菌感受态制备(冰上操作)：挑取单菌落接种山梨醇培养基30℃过夜培养，次日10％转接至50ml新液体培养基30℃培养4-6h，发酵液离心弃上清，加入用10％甘油配置的0.1m的预冷氯化钙洗涤一次，4℃离心弃上清，用预冷的10％甘油洗涤两次后每份40μl分装。

(三)氧化葡萄糖酸杆菌转化：将2ug质粒加入到40μl感受态中，混匀后加入到预冷的1mm间隙的电转杯中，用bio-radmicropulser进行电转，条件为1.8kv电击5ms。电激完后立即加入1ml冷却山梨醇液体培养基，30℃培养3h后涂布至含有50ug/ml头孢氨苄及50ug/ml卡那霉素的固体山梨醇平板上培养约24h至长出可见菌落。

pcr所用2×phantamaxmastermix购自南京诺唯赞公司。

infusion-cloning试剂盒购自南京诺唯赞公司。

taqpcrmastermix购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

实施例1：穿梭质粒p2-1-p112-cas3-patse-crrna的构建

设计用于载体p2-1线性化的引物对f1和r1，

f1：

accggttgccgttattaccggttcgagtgctggtatgtgttccccgcacacgcggggatgaaccgtttttttgtactgagagtgcaccat(下划线部分为同源臂序列，下同)，

r1：

ctgggatgccagcgcgcgaacaacagtatcaatctgctctgatgccgcatag。

以实验室保存的p2-1质粒为模板，以该引物对其进行pcr线性化扩增，将pcr产物纯化回收，得到线性化片段p2-1(seqidno.4)。

设计用于扩增启动子p112序列的引物对f2和r2，

f2：gatactgttgttcgcgcgc，

r2：gggaaatactcctgatttcgtcctg。

以氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003基因组序列为模板，利用f2和r2对其进行pcr扩增，将pcr产物纯化回收，得到p112片段(核苷酸序列如seqidno.2所示)。

设计用于扩增cas3序列的引物对f3和r3，

f3：catgaaacaggacgaaatcaggagtatttcccatggatttgacggatttggcc，r3：atattgagcccacggaaaactttcccattatgcggggaacatcaaccc。

以氧化葡萄糖酸杆菌wsh-005基因组序列为模板，利用f3和r3对其进行pcr扩增，将pcr产物进行纯化回收，得到片段cas3。

设计用于扩增启动子patse序列的引物对f4和r4，

f4：tgggaaagttttccgtgggc，

r4：ccagcactcgaaccggtaataacggcaaccggttcatccccgcgtgtgcggggaacacaaaccaatgaaaaataaagattattccgttcg。

以氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003基因组序列为模板，以该引物对其进行pcr扩增，将pcr产物纯化回收，得到patse片段(核苷酸序列如seqidno.1所示)。

设计用于退火合成crrna序列的引物对f5和r5，

f5：gtggttccccgcacacacgcggggatgaaccggttgccgttattaccggttcgagtgctggtatgtgttccccgcacacgcggggatgaaccg，

r5：cggttcatccccgcgtgtgcggggaacacataccagcactcgaaccggtaataacggcaaccggttcatccccgcgtgtgcggggaacac。

将引物f5、r5各取10μl混匀后于pcr仪中95℃保温5min后冷却至室温，得到片段crrna。

用infusion-cloning的方法将线性化片段p2-1、p112片段、cas3片段、patse片段和crrna片段重组为载体p2-1-p112-cas3-patse-crrna，并转化大肠杆菌jm109。将转化后的转化子送至上海生工测序，验证正确的即为阳性转化子，从阳性转化子中提取质粒，即为重组质粒p2-1-p112-cas3-patse-crrna。

实施例2：用于敲除氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003山梨糖还原酶的山梨糖还原酶上下游融合同源臂的构建

设计用于扩增山梨糖还原酶上游同源片段序列的引物对f4和r4，

f4：aagggaacgagtcacggac，

r4：atattaacaatataagtggattaactgccgataacctcatttttct。

以氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003基因组序列为模板，以该引物对其进行pcr扩增，pcr产物纯化回收得到山梨糖还原酶上游同源片段。

设计用于扩增山梨糖还原酶下游同源片段序列的引物对f5和r5，

f5：

agaaaaatgaggttatcggcagttaatccacttatattgttaatatcgtgattaactac，

r5：tcggtcacccccaggtc。

以氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003基因组序列为模板，以引物对f5和r5对其进行pcr扩增pcr产物纯化回收得到山梨糖还原酶下游同源片段。

将山梨糖还原酶上游和下游同源的纯化片段作为模板，各加1μl，f4跟r5各加1μl，加21μl水，加25μl2×phantamaxmastermix进行重叠延伸pcr，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段10个循环，按照95℃，15s，60℃，15s，72℃，20s进行；扩增阶段25个循环，按照95℃，15s，56℃，15s，72℃，30s进行；终延伸72℃，5min。所得pcr产物经琼脂糖凝胶电泳及测序验证。

实施例3：重组氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003山梨糖还原酶的敲除验证

将测序正确的p2-1-p112-cas3-patse-crrna与山梨糖还原酶上下游融合同源臂共转化氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003，待固体山梨醇平板上培养约24h至长出可见菌落后随机挑取单菌落利用交叉引物f4和r5进行菌落pcr验证。使用taqpcrmastermix进行菌落pcr，条件如下：预变性94℃，3min；扩增阶段25个循环，按照94℃，30s，56℃，30s，72℃，2min进行；终延伸72℃，5min。

若山梨糖还原酶基因被敲掉，则pcr所得片段大小为1023bp；若山梨糖还原酶基因未被敲掉，则pcr所得片段大小为1815bp。经琼脂糖凝胶电泳结果可知，随机挑取的12个单菌落中，1个为山梨糖还原酶基因被敲掉的菌株，效率为8.3％，并将此菌落pcr产物送上海生工测序验证(图4)，测序结果显示，该菌株的山梨糖还原酶基因已被敲除。

实施例4

利用实施例2和3中的方法对氧化葡萄糖酸杆菌wsh-003中山梨醇脱氢酶sldba1小亚基基因sldb1(核苷酸序列与ncbi登录号为nz_jh668178.1所示序列的第409140位至409520位一致)、山梨醇脱氢酶sldba1大亚基基因slda1(核苷酸序列与ncbi登录号为nz_jh668178.1所示序列的第406918位至409140位一致)、山梨醇脱氢酶sldba2小亚基基因sldb2(核苷酸序列与ncbi登录号为nz_jh668178.1所示序列的第190588位至190968位一致)、山梨醇脱氢酶sldba2大亚基基因slda2(核苷酸序列与ncbi登录号为nz_jh668178.1所示序列的第190968位至193187位一致)进行敲除。

结果显示，同样也能够取得于实施例3类似的效果，将上述基因敲除。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种氧化葡萄糖酸杆菌中基因敲除的方法

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