本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及一种葡萄糖抑制效应解除的酵母菌及其利用非葡萄糖碳源的方法，尤其是耐热酵母菌株马克斯克鲁维酵母的突变株，该突变株中的葡萄糖抑制效应解除，且保持了葡萄糖的利用能力，利用非葡萄糖碳源如木糖、甘油、半乳糖、蔗糖、棉籽糖，特别是木糖的能力高。
背景技术：
：：木质纤维素生物质类生物质，例如玉米秸秆、玉米芯、柳条稷、芒草等的主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素(fatmaetal.,2018)，其水解得到的主要单糖包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖极少量的果糖和乳糖。而其他的乳制品行业废液、淀粉产业的废渣、废渣处理液等也包含葡萄糖之外的糖类。这些糖类的完全利用对生物基的化学产品的经济性非常重要(kimetal.,2012)。葡萄糖抑制效应，又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用，指葡萄糖或某些容易利用的碳源其分解代谢产物阻遏某些编码诱导酶体系的基因的转录的现象。其在微生物中的存在严重抑制了微生物对生物质水解液中非葡萄糖碳源的利用，也显著降低了目标产物的得率和速率，从而使生产经济性下降(kimetal.,2012)。为了高效利用木质纤维素材料和各种生物质相关的废料，需要实现混合糖的共利用。因此，需要一种解除了葡萄糖抑制效应，既，在混合糖中能够利用非葡萄糖碳源，且非葡萄糖碳源利用能力高的微生物。对于解除葡萄糖抑制效应而言，申请人在以前的研究中发现，在酵母菌中己糖激酶基因的敲除可以解除葡萄糖效应(huaetal.,2019)，但是该策略会使菌株利用葡萄糖的能力迅速下降，同时丧失果糖利用能力。即使在其中通过过表达葡萄糖激酶基因而改善了葡萄糖利用效率，该菌株依然丧失了果糖的利用能力，难以作为良好的平台菌株应用。snf3(sucrosenon-fermening3,snf3)为细胞膜低葡萄糖感受器，是诱导己糖运输的高亲和力感受器，同时，snf3还能够感应果糖和甘露糖，具有一个同源蛋白rgt2。在酿酒酵母中，snf3是一个与糖转运蛋白高度同源的葡萄糖感受器，snf3和rgt2分别感受低浓度和高浓度的葡萄糖(ozcanetal.,1996)。如果酿酒酵母中的snf3和rgt2被敲除则该菌株利用葡萄糖的显著能力下降，利用葡萄糖的生长变得非常缓慢(ozcan,2002)。单独敲除酿酒酵母中snf3会导致该菌株丧失利用蔗糖和棉籽糖生长的能力，同时丧失利用低浓度葡萄糖的能力(neigebornetal.,1986)。对蔗糖利用的关键基因suc2和利用半乳糖的关键基因的beta-半乳糖苷酶的表达分析发现，酿酒酵母的snf3的敲除并不改变葡萄糖对蔗糖和半乳糖利用基因表达的抑制，其中蔗糖利用能力的丧失可能是由于蔗糖吸收能力的丧失导致的。因此，仍然没有得到解除了葡萄糖抑制效应的微生物，更谈不上在此基础上非葡萄糖碳源利用能力高的菌株。耐热的马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces.marxianus)作为公认的安全微生物(gras)，用于发酵时有以下几个优点：1、安全，可以用于食品工业；2、高温发酵，这一般会使得发酵速率更快，且在发酵工艺上减少了冷却成本，同时减少了污染的风险(zhangetal.,2016)；3、底物谱很广泛，可利用葡萄糖、木糖、半乳糖、菊糖等等(pentjussetal.,2017)；4、本身可产生多种酶，如果胶酶，β-d-半乳糖苷酶和菊糖酶等，使得它可以直接利用多种原料(fonsecaetal.,2008)。在以木质纤维素生物质及乳制品废液等为底物生产化学品时，马克斯克鲁维酵母具有更明显的优势，所以利用马克斯克鲁维酵母发展成乳酸生产菌株具有非常重要的应用价值。但是马克斯克鲁维酵母中同样存在葡萄糖效应，抑制了马克斯克鲁维酵母在混合糖的情况下对其他非葡萄糖碳源的利用，降低了化学品生产的效率，限制了其应用。技术实现要素：本发明人着眼于马克斯克鲁维酵母进行改造，构建葡萄糖效应减轻或解除的平台菌株，并进行了深入研究。在马克斯克鲁维酵母基因组中仅存在一个snf3/rgt2的同源基因kmsnf3(genbankaccessionno.:bap73238.1)，注释为snf3，未发现rgt2基因。本发明人在马克斯克鲁维酵母中敲除了基因kmsnf3，发现获得的突变株表现出许多与酿酒酵母中类似基因敲除时不具有的新特性：该突变株解除了葡萄糖抑制效应，利用葡萄糖的能力没有下降，而且木糖利用能力大幅度提高。进而提供了一种解除了葡萄糖抑制效应，非葡萄糖碳源利用能力高的突变株及其利用非葡萄糖碳源的方法。具体而言，本发明通过将马克斯克鲁维酵母yhj010(尿嘧啶、亮氨酸和色氨酸的三重营养缺陷型，由发明人以马克斯克鲁维酵母kluyveromycesmarxianusnbrc1777作为出发菌株构建，并保存在本实验室；构建方法参见hongetal.,2007)中的基因kmsnf3敲除，得到了一种葡萄糖抑制效应解除的耐热工程酵母菌突变株：马克斯克鲁维酵母cgmccno.20304，(下文中有时也称为yδsnf3)。由此，本发明提供了一种马克斯克鲁维酵母cgmccno.20304，其中基因kmsnf3为不显性。yδsnf3具有解除葡萄糖抑制效应地利用木糖、甘油、蔗糖、棉籽糖、乳糖等非葡萄糖碳源的能力。在含有2-脱氧葡萄糖的固体培养基上培养时，yδsnf3对这些碳源的利用不再受2-脱氧葡萄糖的抑制。在snf3基因敲除后yδsnf3仍保持了利用葡萄糖生长的能力，生长速度没有明显下降，而生物量有所上升。与对照菌株ywd005(将yhj010菌株中尿嘧啶的营养缺陷型通过表达ura3回补，保证和yδsnf3有相同的营养缺陷型，wuetal.,2020)相比，yδsnf3的最终细胞密度提高了45.8％；且58小时内的木糖消耗升高了44.7％。木糖还原酶，木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的表达水平分别增加了10.98倍，15.11倍，2.51倍。log2fc(δysnf3/ywd005)分别为3.71，4.14，1.94。在本发明的一个实施方式中，使用了马克斯克鲁维酵母yhj010作为进行snf3敲除的出发菌株，但不限于此，也可以选择巴斯德毕赤酵母、耶氏解脂酵母、汉逊酵母。同样地，作为使用的质粒，也不限于pgem-teasy载体，可列举：pmd18t，puc57，puc19等。在本发明中的一个实施方式中，snf3基因的敲除通过使用具备敲除框的质粒进行，但也可以通过其他基因工程的常用方式例如：crispr-cas9，cre-loxp，rnai，使菌株中的snf3基因为非显性即可。在本发明中的一个实施方式中，作为非葡萄糖碳源使用了木糖、甘油、蔗糖、棉籽糖、乳糖，但不限于此，可列举：半乳糖，阿拉伯糖等。在本发明中的一个实施方式中，用于进行snf3基因的敲除的敲除框中包含scura3表达框，作为该表达框而使用了scura3完整表达框(genbank：am697670.1的从第2061碱基到第3158碱基的序列)。其中，也可以使用该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有编码同等功能蛋白质的核苷酸序列，或其他微生物中的与马克斯克鲁维酵母的snf3基因相似性为90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％及以上的同源基因或同源基因的片段，或这些序列根据微生物的种类不同而进行了优化后的核苷酸序列。在本发明中的一个实施方式中作为转化方法使用了醋酸锂转化，也可以使用其他常用的酵母转化方法，例如电转化，化学转化如氯化锂转化法，peg100转化法，原生质体法等。具体地，本发明包含以下内容：1.马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces.marxianus)yhj010的突变株，其中的基因kmsnf3被敲除，该突变株的葡萄糖抑制效应解除，且保持了葡萄糖的利用能力，利用木糖的能力高，其中kmsnf3的genbankaccessionno.:bap73238.1。2.根据项1所述的突变株，其为马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces.marxianus)cgmccno.20304。3.一种葡萄糖抑制效应解除的突变株的构建方法，包括使马克斯克鲁维酵母的基因kmsnf3为不显性，优选通过敲除方式进行，所述马克斯克鲁维酵母优选为来源于kluyveromycesmarxianusnbrc1777的菌株，更优选为马克斯克鲁维酵母yhj010。4.根据项3所述的构建方法，其中，所述敲除通过构建具备敲除框的载体进行，所述敲除框中包含scura3表达框，优选为scura3完整表达框genbank：am697670.1的从第2061碱基到第3158碱基的序列，优选所述具备敲除框的载体为质粒pkmsnf3-u。5.项3或4所述的构建方法中使用的载体，优选为质粒pkmsnf3或pkmsnf3-u。6.项5所述的载体在构建葡萄糖抑制效应解除的菌株中的应用。7.项1或2所述的突变株在非葡萄糖碳源的利用或降解中的应用。8.一种利用非葡萄糖碳源的方法，其包括培育项1或2所述的突变株或使用项3或4所述的方法构建的菌株处理含有非葡萄糖碳源的溶液，所述非葡萄糖碳源优选为木糖、甘油、半乳糖、蔗糖、棉籽糖，更优选为木糖，所述溶液优选为生物质水解液或生物基的化学产品、其废渣处理液。优点和积极效果马克斯克鲁维酵母(kluyveromycesmarxianus)yhj010的突变株yδsnf3为首个实现解除葡萄糖抑制效应却没有丧失其他糖类利用的耐热菌株，因此该菌株可以作为构建利用木质纤维素工程菌的重要出发菌株。本发明的突变株yδsnf3中解除了葡萄糖对木糖、乳糖、半乳糖、甘油、蔗糖、棉籽糖等碳源利用的抑制，保持着利用葡萄糖生长的能力，并提高了木糖的利用，由此可以作为葡萄糖、木糖等碳源共利用的平台菌株构建的基础，应用于生物质水解液或生物基的化学产品、其废渣处理液的利用等。并在构建高效利用木质纤维素生物质的工程菌方面具有广泛的应用前景。同时，本发明提供了一种通过基因snf3同源基因的敲除来构建解除葡萄糖抑制效应的微生物的方法，使用该方法能够得到解除葡萄糖抑制效应却没有丧失其他糖类利用的马克斯克鲁维酵母，通过将该方法应用于其他微生物特别是酵母品系，可以期待得到具有相似特性的微生物特别是酵母突变工程菌株。保藏说明本发明的突变株马克斯克鲁维酵母(kluyveromycesmarxianus)yδsnf3于2020年7月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心(cgmcc，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏号为cgmccno.20304。附图说明图1.yδsnf3中kmsnf3基因的敲除的pcr验证结果。图2.yδsnf3的利用葡萄糖类似物2-dg的葡萄糖抑制效应检测结果。图3.葡萄糖或木糖的存在下yδsnf3的生长情况。a:利用葡萄糖生长；b:利用木糖生长。图4.木糖的存在下的yδsnf3在生长过程中的木糖浓度变化。具体实施方式下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。试剂和菌株：本发明中的所有实际均是市场购买的试剂级以上的试剂。其中，葡萄糖，木糖，蔗糖、棉籽糖、甘油、半乳糖、酵母基本氮源，尿嘧啶、色氨酸、亮氨酸，胶回收试剂盒以及所有的限制性内切酶均来源于上海生工生物工程公司。primestarhsdna聚合酶，t4dna连接酶以购自于大连宝生物公司，pgem-t-easy载体购自promega公司。大肠杆菌escherichiacolixl10-gold菌株(美国加利福利亚stratagene公司)及dh5α菌株作为dna操作时使用的宿主菌，包含100μg/ml氨苄青霉素的luria-bertani(lb)培养基用作培养e.coli。葡萄糖合成培养基(葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，色氨酸20mg/l,亮氨酸30mg/l)主要用于转化。ypd培养基(10g/l酵母提取物，20g/l细菌蛋白胨，20g/l葡萄糖)用于酵母前培养。rnaseq由上海美吉生物医药科技有限公司完成，普通基因克隆及质粒构建过程中的测序由上海生工生物工程股份有限公司完成，引物合成公司上海生工生物工程股份有限公司。本发明涉及的引物信息实施例1.马克斯克鲁维酵母snf3基因敲除突变株的构建1.snf3基因敲除框的构建：1)质粒pkmsnf3的构建。提取马克斯克鲁维酵母的基因组dna，从马克斯克鲁维酵母基因组扩增出kmsnf3(genbankaccessionno.:bap73238.1)，插入到pgem-teasy载体中，获得的质粒命名为pkmsnf3。具体操作如下：(1)提取基因组dnaa)取冻存菌划线，37℃培养箱培养24小时。b)挑取单克隆，接种于5ml液体培养基中，37℃摇床，250rpm培养过夜。c)12000rpm，离心1分钟，弃上清，收集菌体。d)取500μl无菌水重悬菌体，转移至1.5ml离心管中，12000rpm，离心1分钟，弃上清，收集菌体。e)加入200μl裂解缓冲液(edta(1mm),tritonx-100(2％(w/v)),nacl(100mm),sds(1％(w/v)),tris-cl(10mm,ph8.0))重悬菌体。f)向其中加入0.3g玻璃珠(425-600nm，sigma，美国)和200μl酚氯仿溶液(25：24：1，ph8.0)，高速涡旋震荡3分钟。g)再加入200μl1xte缓冲液(1mmedta,10mmtris-cl，ph8.0)，快速轻微震荡30秒。h)12000rpm离心5分钟，将上层的水相转移至新的1.5ml离心管中，向其中加入1ml冰冷的无水乙醇，颠倒混匀。i)4℃，12000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀用400μl1xte缓冲液重悬。j)向其中加入2μl2ng/ml的rna酶a(中国上海，生工生物)，37℃温浴5分钟。k)加入40μl3m醋酸钠(ph5.2)和1ml冰冷的无水乙醇，颠倒混匀。l)4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用1ml冰冷的75％乙醇清洗，再次离心去上清。m)沉淀于室温下干燥10分钟，用40-100μl1xte缓冲液重悬，即为提取的酵母基因组dna。(2)包含基因kmsnf3及其上下游的片段的扩增：以kmsnf3f(seqidno.1)和kmsnf3r(seqidno.2)为引物，yhj010的基因组dna为模板，利用高保真primestarhsdna聚合酶扩增出目的基因片段，pcr反应如下：反应条件：由此，通过pcr进行扩增得到的pcr产物中，包含kmsnf3基因及其上下游的片段。(3)通过taqdna聚合酶对按下面配置好反应体系后，72℃反应30分钟，对pcr产物片段末端进行加a处理。加a的反应体系如下：(4)载体连接。pcr产物末端加a后直接与pgem-teasy载体连接，按照下面准备连接反应体系后，16℃条件下反应过夜。连接反应体系如下：(5)大肠杆菌转化。第二天将连接产物转化入大肠杆菌，待长出克隆后挑取单克隆接入含有新鲜lb液体培养基的试管中培养过夜；培养过夜的菌液提取质粒，然后测序确认序列信息，获得了含有kmsnf3基因的质粒pkmsnf3。2)含有snf3基因敲除框的质粒构建通过pcr的方法将通过上述过程获得的质粒pkmsnf3中的基因orf的部分片段(中间991bp)删掉，获得scura3完整表达框(genbank：am697670.1，从第2061碱基到第3158碱基)。利用smai对scura3完整基因表达框dna进行酶切，与得到的线性pkmsnf3载体连接，从而获得含有基因敲除框的质粒，命名为质粒pkmsnf3-u。具体的步骤如下：(1)scura3表达框片段的扩增：质粒yeugap(日本京都大学，玉置尚德教授惠赠)(zhangetal.,2014)作为扩增反应的模板，通过高保真酶primestarhsdna聚合酶和引物scura3-smai-f(seqidno.3)及scura3-smai-r(seqidno.4)扩增出包含scura3表达框片段，具体反应体系如下，反应程序设定与基因kmsnf3的扩增相同。(2)使用引物dkmsnf3f(seqidno.5)和dkmsnf3r(seqidno.6)，以质粒pkmsnf3为模板进行反向扩增反应，扩增产物包含了整个t载体的骨架以及对应基因的部分序列，pcr的扩增体系如下，反应程序设定与kmsnf3基因扩增相同。(3)将步骤(2)获得的扩增产物部分与scura3表达框利用平末端进行连接，获得pkmsnf3-u质粒。在质粒pkmsnf3-u中，scura3表达框两端是对应基因的剩余片段，可以作为同源臂与酵母内的基因进行同源重组，从而对目的基因进行敲除，连接反应体系如下，16℃反应过夜；(4)连接产物转化入大肠杆菌，再通过菌落pcr(挑取少量菌落的细胞作为模板，其他反应条件和snf3的扩散相同)以及测序确认序列信息，获得含有kmsnf3基因敲除框的质粒pkmsnf3-u。2.kmsnf3基因的敲除对kmsnf3基因进行敲除，出发菌株为马克思克鲁维酵母yhj010。(1)以含有基因敲除框的质粒pkmsnf3-u为模板，以kmsnf3f(seqidno.1)和kmsnf3r(seqidno.2)为引物扩增出该基因的敲除框片段；然后通过乙醇沉淀的方法浓缩并纯化扩增得到的该基因的敲除框片段；乙醇沉淀法1)将获得的dna溶液(如pcr反应液)汇集于干净的1.5ml离心管中，加入十分之一体积的3m醋酸钠溶液(ph＝5.2)，充分混匀；2)再用移液器向离心管中加入约2～3倍体积的预冷处理过的无水乙醇，颠倒充分混合后放于-20℃冰箱静置约20分钟；此时将低温冷冻离心机打开预冷至4℃；3)混合液静置完全后，取出，4℃离心机进行离心处理，离心条件为16000×g，10分钟；4)离心结束后，取出离心管，小心弃去上清后，再用移液器向离心管中加入1ml预冷的75％的乙醇，16000×g转速离心5分钟；5)离心结束，弃去上清后再用1ml的预冷75％乙醇洗一次，离心条件仍然为16000×g，5分钟；6)离心结束后小心弃上清，然后用移液器小心吸取残留液体，开盖放置在室温中，挥发剩余的乙醇；7)放置约10分钟后加入合适体积的双蒸水溶解获得的dna沉淀，然后放置于-20℃冰箱保存。(2)将各基因的敲除框片段转化进入马克斯克鲁维酵母yhj010，通过添加了亮氨酸和色氨酸的合成培养基平板进行筛选，只有成功转入片段使菌株yhj010恢复尿嘧啶合成能力的菌株才能在该平板上存活。酵母的醋酸锂转化i).将马克斯克鲁维酵母菌株yhj010在ypd琼脂培养基平板上划线，在37℃培养箱培养24小时。ii).从划线平板上挑取单克隆接种于5ml液体ypd培养基，37℃摇床，250rpm培养过夜。iii)取500μl过夜培养的菌液，接入5ml新鲜的ypd培养基中，37℃摇床，250rpm培养4小时。iv).将菌液5000rpm离心3分钟，弃上清，收集菌体。v).配制1ml的转化缓冲液：50％peg4000800μl2m醋酸锂100μl1mdtt100μlvi).吸取150μl的转化缓冲液重悬菌体，并转移至1.5ml离心管中，5000rpm，迅速离心5秒，弃上清。vii).吸取100μl的转化缓冲液再次重悬菌体，向其中加入5μl的线性化质粒，混匀。viii).混合液置于47℃水浴锅中，水浴热激15分钟。ix).取出混合液，向其中加入100μlsd液体培养基，涡旋震荡30秒。x).将混合液均匀涂布于筛选用的合成培养基上，37℃培养箱中，倒置培养3-4天。xi)将平板上的单克隆划线于新的同种平板上，二次筛选。xii).挑取划线生长的单克隆，于液体ypd培养基中培养，作为通过了筛选的菌株yδsnf3。(3)由于马克思克鲁维酵母中非同源重组的概率较高，对通过了筛选的菌株yδsnf3进一步通过了菌落pcr的方式确定转入片段与目的基因发生了同源重组，从而证实其为对应基因敲除的菌株。具体步骤为，将通过了筛选的菌株yδsnf3利用引物kmsnf3f(seqidno.1)和kmsnf3r(seqidno.2)进行pcr扩增，确认菌株yδsnf3敲除结果的菌落pcr体系与前面snf3基因扩增条件相同。将结果示于图1。结果显示，图1中kmsnf3基因在敲除菌yδsnf3中和基因未敲除的出发菌株(yhj010)相比中有明显变大的的扩增条带。由于敲除框的构建时删除了部分kmnsf3的orf，并插入了scura3的表达框，因此在基因敲除成功的情况下，敲除菌的基因组扩增出来的目的基因长度(4.0kb)相比于野生型(2.8kb)扩增出来的目的基因长度更大。提示菌株yδsnf3中成功敲除了对应基因。实施例2.菌株yδsnf3中葡萄糖抑制效应的解除对kmnsf3敲除的菌株yδsnf3的葡萄糖抑制效应进行了鉴定。分别在添加了葡萄糖类似物2-deoxyglucose(2-dg)的木糖，半乳糖，蔗糖以及棉籽糖的酵母提取物蛋白胨(yp)平板上观察菌株yδsnf3的生长状况。由于菌株yδsnf3中的kmsnf3被敲除，为了保持遗传背景的一致性，采用在马克斯克鲁维酵母菌株yhj010(发明人以马克斯克鲁维酵母kluyveromycesmarxianusnbrc1777作为出发菌株构建；构建方法参见hongetal.,2007)基础上回补了ura3标签(即使菌株恢复合成尿嘧啶能力的关键基因)的菌株ywd005(发明人构建，构建方法参见文献(wuetal.,2020))为对照菌株。具体操作如下：(1)待测菌株yδsnf3和对照菌株ywd005划线到ypd固体培养基，37℃生化培养箱培养过夜；(2)第二天从平板上挑单克隆菌到含有5ml的ypg(10g/l酵母提取物，20g/l细菌蛋白胨，20g/l甘油)液体培养基的试管中培养，培养条件一致为37℃，250rpm过夜。(3)过夜培养的菌液通过紫外分光光度计测菌密度od600nm，通过计算和无菌水稀释控制点板样品的浓度梯度：第一个浓度梯度为od600nm＝1，然后依次进行10倍稀释，即od600nm＝10-1,10-2,10-3。(4)用移液器吸取od600＝1，10-1,10-2和10-3的待点样的稀释后的菌液1.5μl，滴到平板上对应的位置，点板结束待菌液晾干后，将平板放于培养箱，37℃培养。(5)培养48小时后，将各平板在tanon1600全自动数码凝胶成像分析系统下观察拍照。将结果示于图2。结果显示，如图2所示，相比于对照ywd005，在含有2-dg的木糖，半乳糖，蔗糖以及棉籽糖平板上，基因kmsnf3敲除突变株yδsnf3都有非常明显的生长优势。其中：在以葡萄糖为碳源的培养时，接种细胞密度(od600)是1、10-1、10-2、10-3，无论是否有2-dg，yδsnf3与ywd005生长几乎没有差异，而以甘油、半乳糖、木糖、蔗糖、棉籽糖为碳源时，在培养基中没有2-dg时，接种细胞密度是1、10-1、10-2、10-3下yδsnf3与ywd005生长几乎没有差异，但是培养基中有2-dg时，对照菌株只在接种细胞密度为1时，有明显生长，10-1有微弱生长，其他接种浓度下，不在生长，而yδsnf3在1、10-1、10-2、10-3条件下都有明显生长。2-dg可以经由葡萄糖转运蛋白进入细胞内并启动葡萄糖抑制效应，它抑制细胞对其它非葡萄糖的利用，但是并不能经代谢为细胞代谢提供能量和碳源等。因此在含有2-dg的非葡萄糖碳源平板上，菌株yδsnf3相比于对照菌株ywd005具有生长优势，说明马克思克鲁维酵母中snf3的敲除在不同程度上解除了葡萄糖对包括木糖在内的多种非葡萄糖碳源的利用的抑制效应。实施例3.菌株yδsnf3对葡萄糖和木糖的利用能力在测试了基因kmsnf3敲除突变株yδsnf3利用葡萄糖或木糖的生长情况。将菌株yδsnf3和对照菌株ywd005在以葡萄糖或木糖为碳源的培养基中进行培养，通过od600检测菌的菌密度。并进一步对菌株yδsnf3培养上清中的木糖浓度变化进行了检测。具体的步骤如下：将菌株yδsnf3在5mlypd液体培养基中42℃，250rpm过夜培养作为前培养；将前培养得到的菌株以起始od600为0.5转接到包含100g/l葡萄糖的培养基(ypd)或100g/l木糖的培养基(ypx)中，在42℃，250rpm摇床培养，在培养过程中的不同时间点(取样时间参见图3a、图3b)取培养基测定其od600，并绘制生长曲线(图3a、图3b)，并不同时间点的菌株在培养0、2、6、10、24、28、36、50、58小时的培养上清中剩余的木糖浓度通过高效液相色谱[agilent1260色谱仪(安捷伦)roa-organicacidh+(8％)column(菲罗门)色谱柱，0.0025m硫酸为流动相)]进行测定(图4)。结果显示，在包含100g/l葡萄糖的培养基中，虽然培养2，3，10小时时，yδsnf3的细胞密度比对照菌株ywd005低，但是培养23，28，36，50，58小时后，各时间点中，yδsnf3与对照菌株ywd005相比均达到了更高的菌密度(od600)。在培养58小时后，yδsnf3的od600达37，而对照菌株ywd005仅达29(图3a)，yδsnf3的菌密度(od600)高于对照菌株27.6％。而在包含100g/l木糖的培养基中，各时间点中(12，16，20，23，38，58小时)，yδsnf3与对照菌株ywd005相比，无论是生长速度还是最终菌密度都更高，在培养58小时后，yδsnf3的od600达35，而ywd005的od600仅24，yδsnf3的菌密度(od600)高于对照菌株45.8％(图3b)。在各时间点(12，16，20，23，38，58小时)，yδsnf3菌株的培养上清中剩余的木糖都比wd005菌株的培养上清中少，说明yδsnf3具有更快的利用木糖的能力，经58小时培养后，yδsnf3菌株的培养上清中仅剩32g/l的木糖，而ywd005菌株的培养上清中还剩余53g/l木糖(图4)。即yδsnf3菌株和ywd005菌株分别消耗了68g/l和47g/l的木糖，58小时内的木糖消耗升高了44.7％。综上，结果显示，在用包含木糖的培养基培养时，与对照菌株ywd005相比，菌株yδsnf3能够更快的利用木糖，且木糖利用能力更高。实施例4.菌株yδsnf3葡萄糖和木糖的混合糖培养中的转录组分析。将突变株yδsnf3和对照菌株ywd005以起始od600＝1，在包含8％葡萄糖和2％木糖的培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨以及葡萄糖和木糖，附图中也缩写为ypdx)中培养，在37℃培养至od600＝8，并检测此时培养上清中的葡萄糖，证实葡萄糖未消耗完(测试方法同木糖的测定)。于12000rpm离心回收菌体，送美吉生物(上海)进行rna-seq测序及分析，将结果示于表1。表1采用rna-seq测定的木糖醇脱氢酶、木糖醇还原酶和木酮糖激酶的表达水平比较结果显示，突变株yδsnf3的木糖还原酶，木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的表达与ywd005的对应基因表达相比，其表达水平分别增加了10.98倍，15.11倍，2.51倍，log2fc(δysnf3/ywd005)分别为3.71，4.14，1.94。证实突变株yδsnf3在包含葡萄糖和木糖的混合糖培养基中出现了木糖还原酶，木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶等的增强表达，提示了其葡萄糖抑制效应的解除的作用方式。参考文献：1.fatma,s.,hameed,a.,noman,m.,ahmed,t.,shahid,m.,tariq,m.,sohail,i.,tabassum,r.2018.lignocellulosicbiomass:asustainablebioenergysourceforthefuture.proteinandpeptideletters,25(2),148-163.2.fonseca,g.g.,heinzle,e.,wittmann,c.,gombert,a.k.2008.theyeastkluyveromycesmarxianusanditsbiotechnologicalpotential.applmicrobiolbiotechnol,79(3),339-354.3.hong,j.,wang,y.,kumagai,h.,tamaki,h.2007.constructionofthermotolerantyeastexpressingthermostablecellulasegenes.journalofbiotechnology,130(2),114-123.4.hua,y.,wang,j.,zhu,y.,zhang,b.,kong,x.,li,w.,wang,d.,hong,j.2019.releaseofglucoserepressiononxyloseutilizationinkluyveromycesmarxianustoenhanceglucose-xyloseco-utilizationandxylitolproductionfromcorncobhydrolysate.microbialcellfactories,18,24.5.kim,s.r.,ha,s.j.,wei,n.,oh,e.j.,jin,y.s.2012.simultaneousco-fermentationofmixedsugars:apromisingstrategyforproducingcellulosicethanol.trendsinbiotechnology,30(5),274-282.6.neigeborn,l.,schwartzberg,p.,reid,r.,carlson,m.1986.nullmutationsinthesnf3geneofsaccharomyces-cerevisiaecauseadifferentphenotypethandopreviouslyisolatedmissensemutations.molecularandcellularbiology,6(11),3569-3574.7.ozcan,s.2002.twodifferentsignalsregulaterepressionandinductionofgeneexpressionbyglucose.journalofbiologicalchemistry,277(49),46993-46997.8.ozcan,s.,dover,j.,rosenwald,a.g.,wolfl,s.,johnston,m.1996.twoglucosetransportersinsaccharomycescerevisiaeareglucosesensorsthatgenerateasignalforinductionofgeneexpression.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,93(22),12428-12432.9.pentjuss,a.,stalidzans,e.,liepins,j.,kokina,a.,martynova,j.,zikmanis,p.,mozga,i.,scherbaka,r.,hartman,h.,poolman,m.g.,fell,d.a.,vigants,a.2017.model-basedbiotechnologicalpotentialanalysisofkluyveromycesmarxianuscentralmetabolism.jindmicrobiolbiotechnol,44(8),1177-1190.10.wu,d.,wang,d.,hong,j.2020.effectofanovelalpha/betahydrolasedomainproteinontoleranceofk.marxianustolignocellulosicbiomassderivedinhibitors.frontiersinbioengeeringandbiotechnology,8,844.11.zhang,b.,zhang,j.,wang,d.,han,r.,ding,r.,gao,x.,sun,l.,hong,j.2016.simultaneousfermentationofglucoseandxyloseatelevatedtemperaturesco-producesethanolandxylitolthroughoverexpressionofaxylose-specifictransporterinengineeredkluyveromycesmarxianus.bioresour.technol.,216,227-237.12.zhang,j.,zhang,b.,wang,d.m.,gao,x.l.,hong,j.2014.xylitolproductionathightemperaturebyengineeredkluyveromycesmarxianus.bioresour.technol.,152,192-201.当前第1页12当前第1页12